Разделение белков методом хроматографии

Методы разделения смесей веществ представляют ценность не только как начальная ступень практически любого эксперимента в области исследования биополимеров, так как выделенный и очищенный белок или нуклеиновая кислота претерпевают с течением времени изменения как в растворе, так и в кристаллическом виде или в виде осадка, но и как методы непосредственного изучения свойств биополимеров. Изучение электрохимических свойств белков, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, полипептидов методами электрофореза и сорбции, изучение их морфологии методами сорбции и хроматографии представляет собой столь же важную область применения этих методов, как и наиболее до настоящего времени распространенное их приложение для фракционирования и анализа смеси веществ. [c.9]

Избыток детергента может мешать фракционированию. Например, высаливание сульфатом аммония приводит к появлению на поверхности раствора слоя тритона Х-100, в котором часто содержатся нужные белки. Однако эффективного разделения при этом не происходит. Можно провести колоночную хроматографию или отделить белки с помощью гель-фильтрации (разд. 5.1), но не исключено, что мицеллы детергента будут двигаться в той же зоне, что и белок, и, следовательно, окажутся в одной фракции. Ионообменная хроматография успешно осуществляется в присутствии неионных детергентов (разд. 4.2 и 4.3). Действительно, тритон Х-100 в концентрации до 1% оказывает незначительное влияние на ионообменные свойства нормальных водорастворимых белков. Но солюбилизированные белки мембран могут находиться только в составе детергентных мицелл, что существенно влияет на процесс ионного обмена. Если исследуемый белок удается адсорбировать на ионообменнике, то избыток детергента свободно проходит через колонку. Это позволяет элюировать свободный (относительно) от детергента белок. С другой стороны, если полное удаление детергента приводит к денатурации белка, то, чтобы предотвратить это, в буфер вносят небольшое количество детергента (<0,1 7о). Собранная фракция будет, конечно, тоже содержать некоторое количество детергента. Тем не менее, так как обычно из смеси белков выделяют какой-то определенный фермент, присутствие в конечном препарате незначительной концентрации чистого детергента, не загрязненного жирами, не принесет большого вреда. Методы удаления избытка детергентов были недавно суммированы в обзоре [23]. [c.55]

Следует отметить, что потенциальные возможности гидрофобных адсорбентов до сих пор еще не реализованы. Несмотря на отсутствие у них хроматографической избирательности в отношении сходных компонентов смеси, гидрофобные адсорбенты могут быть очень полезными при грубом разделении белков на очень ранних стадиях очистки или даже на первой стадии. Если гидрофобную хроматографию использовать в качестве быстрого метода адсорбции в объеме , то она может заменить в некоторых случаях фракционирование сульфатом аммония, так как при этом исключается центрифугирование и получается более узкая зона, содержащая нужный белок. Это описано в следующем разделе. [c.185]

Радиохимические методы основаны на обнаружении меченых продуктов реакции, которые должны быть полностью отделены от оставшегося меченого субстрата. Разделение — это обычно наиболее длительная стадия, которая вносит наибольшую ошибку в конечный результат. Продукт можно отделить от реагента по принципу фазового разделения, например осаждая меченый белок из раствора, содержащего реагент, или удаляя меченый СОг из смеси принцип метода достаточно прост, хотя существует много практических трудностей. В других случаях необходимы хроматографические методы. Для этого используют хроматографию на бумаге или в тонком слое, ионообменную хроматографию или жидкостную хроматографию высокого разрешения. Иногда эти процедуры протекают очень быстро н просто, особенно в ситуациях все или ничего , когда какой-либо один компонент пары продукт — реагент полностью сорбируется на носителе, а второй не сорбируется вовсе. Но бывает и так, что разделение идет с трудом, особенно тогда, когда в смеси присутствует в большом избытке субстрат. Из-за обычной диффузии может произойти перекрывание зоны субстрата с зоной продукта, и тогда содержание продукта будет ошибочно завышено, если не будут поставлены соответствующие контрольные пробы (рнс. 8.6). [c.292]

Анализ. Методы анализа белковых макромолекул селективны и осуществляются в зависимости от того, какая структура является объектом исследования, и начинаются с определения аминокислотного состава. Для этого необходимо провести полный гидролиз пептидных связей и получить смесь, состоящую из отдельных аминокислот. Гидролиз проводят при помощи 6 М соляной кислоты при кипячении в течение 24 ч. Так как для гидролиза пептидных связей изолейцина и валина этого может быть недостаточно, проводят контрольный 48- и 72-часовой гидролиз. Некоторые аминокислоты, например триптофан, при кислотном гидролизе разрушаются, поэтому для их идентификации используют гидролиз при помощи метансульфоновой кислоты в присутствии триптамина. Для определения цистеина белок окисляют надмуравьиной кислотой, при этом цистеин превращается в цистеиновую кислоту, которую затем анализируют. Вьщеление и идентификацию аминокислот проводят при помощи аминокислотных анализаторов, принцип действия которых основан на хроматографическом разделении белкового гидролизата на сульфополистирольных катионитах, В основе количественного определения той или иной аминокислоты лежит цветная реакция с нингидрином, однако более перспективным следует считать метод, при котором аминокислоты модифицируют в производные, поглощающие свет в видимом диапазоне. Разделение смеси аминокислот проводят при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, а само определение — спектрофотометрически. Следующим этапом является определение концевых аминных и карбоксильных [c.40]

Были проведены некоторые разделения белковых молекул с помощью хроматографии на бумаге, хотя, как правило, разделение происходит плохо, с перекрывающимися полосами. Франклин и Квостел [43], используя для проявления хроматограмм буферные водные растворы солей, разделили смесь папаина и казеина с помощью двухмерного метода. Эти исследователи в качестве индикатора использовали гемин. Присутствие комплекса белок — гемин на бумаге легко можно обнаружить с помощью-реактива бензидин — перекись водорода. Было показано, что сыворотка человека содержит от 6 до 10 фракций белка. [c.332]

Высокоэффективным методом разделения является сочетание электрофореза на бумаге с обычной хроматографией. При этом сначала через влажную бумагу, на которую нанесена смесь, пропускают ток высокого напряжения, а затем смесь хроматографируют с помощью подходящего растворителя в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. В результате достигается разделение первоначальной смеси в двух измерениях. Применение такого метода к продуктам ферментативного расщепления белков позволяет получить двухмерную картину, которую называют пептидной картой. Каждый белок дает характерную для него при каждом конкретном способе расщепления картину. Локализацию отдельных компонентов во многих случаях определяют с помощью специфических красителей. При определении аминокислот и пептидов в качестве такого красителя используют, например, нингидрин. Если производится элюция адсорбированных компонентов, то удобнее всего устанавливать их присутствие в элюате спектрофотометрически. Вероятно, наиболее тонким методом разделения белков следует считать иммуноэлектрофорез, при котором эффект достигается за счет использования различий в двух свойствах электрофоретической подвижности и иммунологической специфичности. [c.220]

Кривые элюирования, полученные на колонке такого типа, требуют тщательной расшифровки, поскольку механизм процесса, лежащего в основе такого метода, отличается от механизма распределительной и ионообменной хроматографии. В процессе адсорбционной хроматографии встречается значительное размывание вытекающих зон (образование хвостов ), за исключением тех случаев, когда состав элюирующего раствора таков, что значение вымываемого вещества приближается к единице. Успех фракционирования смеси белков зависит от подбора таких концентраций буферного раствора, которые достаточно различаются по ионной силе, чтобы обеспечить четкое разделение компонентов смеси на фракции при элюировании их с колонки. Во многих случаях последовательное элюирование белков проходит без помех, но необходимо помнить, что пики, полученные из смеси неизвестных белков, могут содержать несколько белков в каждой элюируемой зоне. Наряду с этим можно ожидать, что один белок, обладающий сильно изогнутой изотермой, будет давать отдельный пик при каждом приращении ионной силы в более широкой зоне элюирования. Адсорбционную хроматографию легко спутать с другими формами хроматографии. Наилучшим критерием первого механизма является отсутствие пропорциональности между длиной колонки и абсолютным положением пика на кривой элюирования. В случае истинного распределительного или ионообменного механизма разделения объемы элюирования данного растворенного вещества прямо пропорциональны длине колонки. [c.224]

На следующем этапе исследования белок подвергают ферментативному гидролизу на пептиды, например под действием трипсина, химотрипсина и пепсина. Разделение пептидов осуществляют с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге. Затем, пользуясь ДНФБ-методом, определяют аминокислотную последовательность, начиная с Ы-конца. [c.289]

Чтобы удалить белок из плазмы крови, к последней добавляют пикрат [184] или лучше (чтобы избежать потери основных аминокислот) сульфосалициловую кислоту [185], смесь фильтруют, не содержащий белков фильтрат очищают методом катионообменной хроматографии на колонке (50X8 мм) с дауэксом AG50W-X8. Методики очистки образцов мочи перед разделением и количественным определением в нем аминокислот и пептидов описаны в работах [2, 182]. [c.69]

С момента разработки этого метода гель-хроматография наиболее часто используется для препаративного фракционирования белков, причем обычно как первый этап разделения. Поскольку разрешающая способность этого метода низка, хроматографические фракции могут содержать несколько компонентов и необходимо дальнейшее разделение другими способами. Анализ смеси неизвестного состава первоначально проводят на гелевой матрице с широким диапазоном фракционирования, собирают фракцию, содержащую интересующий белок, и разделяют ее на геле с 0олее узким диапазоном фракционирования. Выделенную в результате фракцию разделяют далее методом ионообменной хроматографии или электрофореза. [c.106]

Таким путем удается добиться и разделения сахаров. Хроматография на бумаге была применена для качественного анализа редуцирующих сахаров в таких разнообразных материалах,. как яблочный сок, яичный белок и кровь [49, 216]. Для локализации положения отдельных сахаров на бумаге был применен аммиачный раствор окиси серебра, хотя в более поздней работе указывается, что флуоресценция, появляющаяся после конденсации редуцирующего сахара с ж-фенилендиамином, дает более надежные результаты. Как силикагель, так и фильтровальная бумага были применены для хроматографического разделения органических кислот, выделенных из фруктов [99, 139]. На этом же принципе основано определение молочной кислоты в молоке и янтарной — в яичных продуктах [60]. Особый интерес для биохимика представляет применение хроматографии на бумаге для разделения пуринов, пиримидинов и нуклеозидов из гидролизата нуклеиновой кислоты [134]. Удалось улучшить метод определения витамина В в рыбьих жирах и продуктах облучения эргостерина, основанный на измерении характерной абсорбции в ультрафиолетовом свете или интенсивности окраски производных с треххлористой сурьмой точность определения была значительно повышена после хроматографического удаления примесей, мешающих определению [79, 95]. [c.164]

Онределение тирозина стандартным ионообменным методом обычно не вызывает больших затруднений, не считая возможности разложения тирозина в процессе гидролиза, особенно в присутстви углеводов (см. стр. 128). Было показано, что для белков с очень низким содержанием тирозина, таких, как коллаген и желатин, нужны специальные методы количественного определения, так как наблюдается недостаточное разделение тирозина и фенилаланина [371. Кобетт и сотр. [1121 сравнили величины, полученные нри ионообменной хроматографии, с данными двух других методов — специально модифицированного колориметрического метода, включающего реакцию с а-нитрозо-р-нафтолом, и метода прямого поглощения в ультрафиолетовой области. Последний метод был осуществлен так, как описано для триптофана, причем белок растворяли в щелочи и измеряли оптическую плотность раствора при двух длинах волн. В случае желатина, не содержащего триптофана, оптимальными длинами волн для определения тирозина служат 292 и 304 ммк. Вводится поправка на мутность раствора. [c.149]

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Аффинная хроматография основана на использовании равновесного состояния высокоспецифического связывания, встречающегося в биологических системах. Этот метод позволяет осуществлять такое разделение веществ, которое невозможно достичь с помощью других способов [19, 20, 22]. Суть метода заключается просто в иммобилизации одного из компонентов обратимо связывающейся системы на твердом носителе и последующем его взаимодействии с другим компонентом (компонентами) этой равновесной системы, приводящем к отделению сопутствующих примесей. Таким образом, разделение основано на специфическом связывании компонентов данной системы, а не на различиях в их физических и химических свойствах. Методы аффинной хроматографии хорошо разработаны. Они используются для разделения и очистки компонентов таких высокоспецифически связывающихся комплексов, как антиген— антитело, гормон—связывающий белок, фермент— лиганд. Основными факторами, определяющими процесс разделения, являются природа и химическая струк- [c.216]

Первые исследования белков проводились со сложными белковыми смесями, такими, как яичный белок, сыворотка крови, экстракты из растительных и живот ных тканей, а подчас и цельные ткани. Лишь в конце XIX в. получили распространение методы разделения белков с помош ью осаждения нейтральными солями. В 30-е годы XX в. были получены первые белки в кристаллическом состоянии. Получение веш ества в кристаллическом виде служит одним из надежных доказательств чистоты (гомогенности) препарата. В частности, в 1926 г. Д. Самнер выделил из семян канавалии белок (фермент) уреазу в кристаллическом состоянии Д. Нортроп и М. Кунитц в 1930-1931 гг. получили кристаллы пепсина и трипсина. После этих пионерских работ выделение индивидуальных белков стало частым событием в истории биохимии, особенно после 50-х годов, когда начали применять современные методы фракционирования — хроматографию на гидрофильных ионообменниках, гель-фильтрацию ( молекулярное просеивание ), новые методы электрофореза и др. [c.17]