Спектрофотометрия растворов белка

Б. Спектрофотометрия растворов белков [c.456]

Методика. Бесцветный, совершенно прозрачный раствор белка помещают в соответствующую кювету спектрофотометра и определяют величину экстинкции при длине волны 280 нм. Концентрацию белка рассчитывают, исходя из известного коэффициента экстинкции. [c.67]

Ход работы. 1, Бесцветный, совершенно прозрачный раствор белка помещают в кювету спектрофотометра с толщиной слоя I см и определяют его оптическую плот- [c.22]

При помощи метода спектрофотометрического дифференциального титрования можно определить число фенолятных анионов и число —5 -групп, содержащихся в молекуле белка. Для этого устанавливают в кюветодержателе двухлучевого спектрофотометра две кюветы с денатурированным белком (на месте образца и на месте кюветы сравнения), причем рн раствора, находящегося в канале образца, делают равным И,О, а в канале сравнения — 7,5. Наблюдаемое в этих условиях различие оптической плотности при длине волны 295 нм связано с тирозином (фенолятная форма). При длине волны 243 нм различие в оптической плотности образцов будет уже обусловлено оттитрованными формами как тирозина, так и цистеина. В приведенной ниже таблице указаны значения молярных коэффициентов экстинкции для тирозина при обеих длинах волн и для цистеина при более короткой длине волны (анионные формы поглощают, тогда как протонированные формы не поглощают), Раствор белка имеет концентрацию 5,5-10" М. Различие в поглощении при 295 нм составляет 0,013, а при 243 нм—0,185. Определите число титрующихся тирозиновых и цистеиноБых остатков. Считайте, что толщина слоя всех растворов равна 1,00 см. [c.533]

Растворы нуклеиновых кислот бесцветны, они не имеют полос поглощения в видимой части спектра, однако в ультрафиолетовой области они имеют характерный максимум поглощения в области 2600 А. В этой же части спектра находится область 2800 А, ультрафиолетовый свет которой поглощается также белками (их циклическими аминокислотами— тирозином и триптофаном). Изучение поглощения в ультрафиолетовой части спектра проводится с помощью спектрофотометра или фотоэлектроколориметра ФЭК-Н, снабженного ультрафиолетовым осветителем. [c.72]

Окрашивание растворов белка по Лоури проводится в трехкратной повторности. 1 см исследуемого раствора помещают в пробирку, приливают 5 см щелочного раствора медного купороса - раствора С . Раствор в пробирке энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. В каждую пробирку добавляют по 0,5 см реактива Фолина и оставляют стоять 30 мин для развития окраски. При наличии белка желтая окраска раствора постепенно переходит в синюю. Интенсивность окраски измеряют на фотоколориметре с красным светофильтром или на спектрофотометре при 750 нм. Калибровочную кривую строят, используя сывороточный альбумин или препараты белка, близкие по свойствам к анализируемым. [c.369]

Степень связывания ионов белками можно определять различными методами из них наиболее широко распрострапен метод равновесного диализа. При диализе (так же как и при осмометрии) используют мешочек, стенки которого непроницаемы для молекул белка, но проницаемы для небольших ионов. Диализный мешочек с раствором белка помещают в раствор, содержащий необходимый ион. После установления равновесной концентрации диффундирующего иона по обе стороны мембраны измеряют концентрацию иона в растворе, не содержащем белка разность начальной и конечной концентраций иона в не содержащем белка растворе позволяет определить концентрацию иона в растворе белка. Если концентрации иона по обе стороны мембраны равны друг другу, то это означает, что связывания не произошло. Если связывание имело место, то концентрация иона в белковом растворе должна быть выше, чем в растворе, не содержащем белка разность концентраций может служить мерой числа ионов, связанных с одной молекулой белка. Для того чтобы исключить влияние эффекта Гиббса — Доннана, равновесный диализ проводят обычно либо в изоэлектрической точке белка, либо при высокой ионной силе. Такие методы, как ультрафильтрация, распределительный анализ, а в некоторых случаях и адсорбционная спектрофотометрия, также могут служить для определения степени связывания ионов с белками. [c.73]

После образования ФТК-белка (около 2 ч) смесь экстрагируют сначала циклогексаном, затем бензолом и в заключение высушивают. Сухой препарат, освобожденный от бензола, растворяют в 3 мл раствора гуанидинхлорида (1 г/мл) и экстрагируют эфиром не. сколько раз до тех пор, пока экстинкция экстракта при 270 нм не станет практически равна нулю. Затем к раствору белка в гуанидинхлориде добавляют 1 мл 6 н. НС1 и за процессом циклизации наблюдают в спектрофотометре. ФТГ-производное экстрагируют эфиром, свободным от перекисей (лучше всего это делать в аппарате Сокслета). [c.284]

Метод УФ-спектрофотометрии используют также для обнаружения примесей. 1) Белки сильно поглощают свет при 280 нм. Показателем загрязнения исследуемого раствора белком служит отношение величины оптической плотности раствора нуклеиновой кислоты при 260 нм к ее величине при 280 нм (А2бо/А28о)- Однако коэффициент экстинкции белка очень низок по сравнению с коэффициентом экстинкции нуклеиновых кислот, [c.124]

Определение белка проводят следующим образом. К 0,4 мл исследуемого раствора добавляют 2 мл реактива С. Смесь энергично перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 минут. Затем в каждую пробирку приливают 0,2 мл реактива Е и пробы оставляют при комнатной температуре на 30 минут. В присутствии белка развивается синяя окраска. Интенсивность окраски изменяется на фотоэлектроколориметре с. красным светофильтром или на спектрофотометре при 750 ммк. [c.72]

Элюат (фракции по 20 мл) анализируют на присутствие белка на спектрофотометре при 280 нм. После того как весь белок нанесен на колонку, ее промывают 1,5—2,0 л 1 М раствора хлористого натрия в течение 48 ч. По истечении этого времени оптическая плотность элюата при 280 нм не должна превышать 0,05. Конканавалин А элюируют 0,10 М раствором о-глюкозы в 1,0 М растворе хлористого натрия. Фракции с оптической плотностью не ниже 0,10 собирают и диализуют против большого объема 1,0 М раствора хлористого иатрия, причем последний несколько раз меняют. Концентрацию конканавалина А рассчитывают исходя из коэффициента поглощения при 280 им в 1,0 М растворе хлористого натрия —11,4 0,1. [c.91]

К 2 мл раствора, содержащего 0,1—2 мг белка, добавляют 2 мл 6%-ного раствора NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 330 нм на спектрофотометре. Предварительно строят калибровочный график по стандартному раствору белка. [c.81]

В кювету спектрофотометра вносят раствор белка и добавляют 5—10-кратный молярный избыток ДТНБ над сульфгидрильными группами. Полученную смесь перемешивают и через 5—10 мин измеряют оптическую плотность при 412 нм. Спустя 30 мин проводят повторное измерение оптической плотности, используя в качестве контроля раствор, содержащий равное количество ДТНБ, но не содержащий белка или низкомолекулярного тиола. Обычно реакция протекает очень быстро и максимальная оптическая плотность достигается через 5— [c.160]

Для приготовления конъюгатов смешивали 1 часть 0,1—0,01% стабилизированных в течение 1 нед растворов СгСЬ-бНгО и 9 частей растворов белков (САЧ, гам-ма-глобулин человека —ГГЧ и папаин) в 0,05 М растворе Na l с концентрацией белка 20 мг/мл. Инкубация при -f48° длилась И сут. Затем при 15 g осаждали денатурированную агрегированную фракцию, а элюат очищали от несвязавшегося хрома и белка путем гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной 0,05 М раствором Na l, и обеззараживали, пропуская через миллипоровые фильтры. Конъюгаты хранили при +4°С в ампулах. Образование конъюгата подтверждалось во время спектрофотометрии в видимой и ультрафиолетовой части спектра по смещению максимума поглощения. [c.43]

Спектрофотометрия растворов ДНК при длинах волн 260 и 280 нм дает некорректные результаты в присутствии РНК и белков, вследствие наложения их спектров. Hoe hst 33258 связывается только с двухцепочечной ДНК, что позволяет корректно измерять концентрацию ДНК в присутствии белковых и РНКовых контаминантов. [c.184]

Шкалу и исследуемые растворы окрашивают в градуированных пробирках на 10 мл. В пробирки с номерами по порядку (для шкалы номера —с первого по шестой, далее нумеруют пробирки с исследуемыми растворами) из соответствующих колб наливают по 1 мл раствора белков, добавляют 4 мл биуретового реактива. Содерл имое каждой пробирки осторолсно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего колориметрируют на спектрофотометре СФ-26, Спеколе или фотоэлектроколориметре ФЭК-60 при 540 нм. [c.179]

Кюветы спектрофотометра заполняют средой, содержащей фосфатный буфер (pH 7,4), 1 мМ K N, 1 мкМ ротенон, 1,5 мМ НАДН, 10—20 мкМ цитохром с. Устанавливают длину волны 550 нм (точно ). Для этого кювету помещают в кюветное отделение, устанавливают длину волны по шкале прибора на отметке 550 нм и добавляют к среде нейтрализованный (pH 7,4) раствор аскорбиновой кислоты (конечная концентрация — 5—10 мМ). Цитохром с немедленно восстанавливается, и раствор меняет цвет от красновато-оранжевого до ярко-розового. Устанавливают шкалу длин волн на 550 нм по максимальному поглощению раствора восстановленного цитохрома с, при дальнейшей работе установку длин волн не меняют. Реакцию начинают внесением препаратов в кювету, содержащую окисленный цитохром с, и регистрируют увеличение поглощения при 550 нм. Рассчитывают удельную активность препаратов в микроэлектронэквивалентах за 1 мин в расчете на 1 мг белка. Коэффициент миллимолярной экстинкции для цитохрома с Активность фермента, характерного для внешней мембраны, определяют по разнице скоростей реакций в присутствии и в отсутствие ротенона. [c.412]

Регистрация активности. А. Кювету спектрофотометра заполняют раствором, содержащим 25 мМ фосфатный буфер, 0,1 мМ ЭДТА, 20 мМ сукцинат калия и 40 мкМ цитохром с, pH 7,4. Устанавливают длину волны регистрации 550 нм, как описано на с. 412. Реакцию начинают внесением активированного препарата ( 2—10 мкг/мл среды измерения) фермента и рассчитывают его активность в микромолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка. Коэффициент молярной экстинкции для восстановленного цитохрома с (vlsso— 55о)= 18. Б. В связи с тем что цитохром с служит акцептором электронов, но не протонов, сукцинат цитохром с-редуктазная активность при pH>6 может быть записана в виде [c.428]

Определение содержания гема а в препарате цитохромоксидазы. В кювету спектрофотометра помещают 2 мл 0,1 М. фосфатного буфера (pH 7,4), содержащего 1,5%-ный холат натрия, и 0,1 мл полученного препарата. Измеряют оптическую плотность раствора при 605 нм. Затем фермент восстанавливают, добавляя несколько кристаллов дитионита. Через 10 мин регистрируют значение оптической плотности раствора при 605 нм. Концентрацию гема а рассчитывают, исходя из разности коэффициентов молярной экстинкции окисленной и восстановленной форм гема, которая при 605 нм составляет 12-10 см . Высокоочищенные препараты цитохромоксидазы, выделенные предложенным методом, содержат около 11 нмоль гема а на 1 мг белка фермента. [c.434]

Для определения распределения белка внутри гранул носителя готовят тонкие срезы носителя с прикрепленным ферментом, принимая меры предосторожности против нарушения структуры матрицы. Для этого гранулы носителя включают в 20 /о-ную желатину. Частицы геля выдерживают 5 ч при 37 °С в растворе желатины, затем смесь переносят в подходящий для этих целей небольшой контейнер и оставляют на несколько часов в холодильнике. Желатиновые блоки замерзают, их режут микротомом на образцы толщиной 10 мкм. Полученные срезы наносят на предметные стекла и покрывают тонкими покровными стеклами для предохранения от высыхания. С помощью флуоресцентного спектрофотометра записывают спектры поглощения и излучения флуоресцеинизотиоцианата меченной флуоресцеином аминопептидазы, как свободной, так и связанной с агарозным или декстрановым носителем. [c.255]

Цианурфторид (20] реагирует с тирозином и боковыми цепями некоторых аминокислот, например с амино- и сульфгидрильными группами, но не взаимодействует с другими ароматическими аминокислотами. После реакции с цианурфторидом полоса поглощения тирозина в УФ-области исчезает. Цианурфторид устойчив в диоксане, но медленно гидролизуется в воде с образованием циануровой кислоты. Ни циануровая кислота, ни продукты реакции с аминокислотами не поглощают в области выше 290 нм. При взаимодействии ЦФ с белком оба процесса, гидролиз реагента и реакция с остатками аминокислот, включая тирозин, идут одновременно. Оптимальная область pH для модификации остатков тирозина составляет 9,0—12,6. Продукт реакции с аминогруппой гидролизуется до свободной кислоты при обычном кислотном гидролизе. Степень замещения можно определять дифференциальной спектрофотометрией в сравнении с иитактным тирозином, не модифицированным ЦФ. Для этого реакционную смесь разделяют на две части в одной половине поддерживают нейтральное pH, другую подщелачивают до 12,6. Разница в поглощении между двумя растворами позволяет рассчитать концентрацию тирозина. Добавление гуанидина способствует полной ионизации некоторых маскированных остатков тирозина. [c.351]

Остаток ароматической аминокислоты может быть доступен для растворителя и подвергаться воздействию среды, или он может быть маскирован в глубине глобулы, т. е. окружен боковыми цепями других аминокислот. В зависимости от состава среды или природы соседних аминокислот в УФ-спектре могут наблюдаться те или иные изменения, которые измеряют с помощью дифференциальной спектрофотометрии между нативным и денатурированным или гидролизованным белком или же снятием спектров в различных средах. Например, по данным Инада [10], в дифференциальном спектре остатков триптофана в пепсине максимум лежит в области 298 нм, а Ае = 365 см" , по данным Донована [257], Ае = 240М см . Если построить график поглощения растворов пепсина при 298 нм в зависимости от pH, то на кривой будут видны две стадии изменения состояния 6 остатков триптофана [10, 260, 261] = 2 с рК 4,0 и = 4 с рК 7,2 (продукт необратимой денатурации). Две стадии наблюдаются в изменении поглощения для 2 из 6 остатков триптофана в лизоциме п = 1 с рК 3,15 (Ае = 375 М см" ) и = 1 с рК 6,2 (Ае == = 438 М- см- ). [c.375]

В клинических лабораториях. Так как ни гемоглобин, ни оксигемоглобин не являются стойкими соединениями, они не могут быть использованы в качестве стандартов. Часто в качестве стандарта применяют раствор кислого гематина, имеющий коричневую окраску. Исследуемая кровь при этом методе предварительно смешивается с разведенной соляной кислотой. Необходимо, однако, отметить, что указанный метод дает часто ошибочные данные в связи с помутнением растворов вследствие постепенной флокуляции пигмента. Это помутнение означает, что падающий на раствор свет не только поглощается, но и рассеивается [209]. Помутнение растворов может быть обусловлено также липидами крови [210] или флокуляцией белков плазмы [211]. Более надежные результаты получаются при колориметри-ровании щелочных растворов, наилучшим же методом является колориметрическое или фотометрическое определение цианида метгемоглобина [212], образующегося при прибавлении к крови соляной кислоты и цианистого калия [213]. Этот метод был испытан в различных лабораториях, и полученные результаты оказались очень хорошими [214]. Большим преимуществом этого метода является также то, что можно использовать в качестве стандарта циангематин, который имеет такую же окраску и такой же спектр поглощения, как и цианид метгемоглобина. Хорошие результаты при определении гемоглобина дает также газовый метод Ван-Слайка. Содержание гемоглобина в крови нормальных людей при определении указанными методами оказалось равным 15,7—16,1% [215]. Метгемоглобин в присутствии гемоглобина может быть определен путем насыщения крови кислородом или окисью углерода до и после восстановления крови дитионитом (Ыа23204) [216]. Эта соль является одним из немногих восстановителей, которые могут быть использованы для превращения оксигемоглобина или метгемоглобина в гемоглобин, так как большинство других восстановителей одновременно необратимо денатурируют глобин. Однако некоторым недочетом этого метода является то, что небольшие количества неактивного пигмента , не способного присоединять кислород, также превращаются при действии N328204 в гемоглобин [217]. Очень малые количества кислорода и оксигемоглобина могут быть определены полярографическим методом [218]. Карбоксигемоглобин и метгемоглобин можно определять также путем спектрофотометрии в инфракрасном свете [219]. Спектрофотометрические методы применяются и тогда, когда необходимо определить какое-либо производное гемоглобина, находящееся в смеси с другими его производными [171, 220]. [c.255]

Для анализа белков при 205 им требуется спектрофотометр высокого класса и следует иметь в виду, что из раствора должны быть исключены даже следовые количества соединений, поглощающих в этой области (НСООН, СН3СООН, СН3СОСН3 и др.). [c.302]

Смотреть страницы где упоминается термин Спектрофотометрия растворов белка: [c.68] [c.235] [c.298] [c.300] [c.140] [c.314] [c.177] [c.8] [c.431] [c.30] [c.30] [c.31] [c.31] [c.31] [c.32] [c.32] [c.20] [c.22] [c.178] [c.81] [c.353] [c.346] [c.167] [c.337] [c.310] [c.54]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология