Иммобилизация белков

Синтез полимерных суспензий с заданным комплексом свойств. В процессе работы были получены устойчивые полимерные суспензии с узким распределением частиц по размеру и заданной поверхностной концентрацией функциональных групп. Иммобилизацию белков на латексе проводили двумя способами - физической сорбцией белка или ковалентным связыванием макромолекулы с поверхностью активированного латекса. Первый способ использовали для иммобилизации антител к наркотикам и конъюгированных антигенов К-ОВА и Г-ОВА на поверхность латекса, не [c.201]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

Метод применим для иммобилизации белков на полиакриламидных гелях и на АЕ-целлюлозе. Глутаровый альдегид применяли также для образования нерастворимой массы ферментов посредством поперечного сшивания. [c.236]

Перейдем к иммобилизации белков в более общем виде. Хорошо известно, что белки плазмы крови, по крайней мере млекопитающих, практически мгновенно адсорбируются из раствора на любой границе раздела фаз, в том числе на внесенной в их раствор инородной твердой поверхности. Это существенно затрудняет, например, имплантацию искусственных органов в медицинской практике. Как показывают результаты исследований [101], адсорбирующая активность полиуретана, применяемого в хирургии, в значительной степени зависит от параметров поверхности на молекулярном уровне, что требует очень тонкой регулировки соотношений при добавке сополимеров (мочевины) и других условий синтеза. Иначе уже при незначительном отклонении от этих условий полиуретановые матрицы становятся удобны для использования в качестве подложки для выращивания, например, бактериальных культур, т. е. имеют высокое сродство к белкам. [c.553]

Иммобилизация белков на нитроцеллюлозной мембране при помощи электрофоретического переноса белка из геля или прямого нанесения белковой смеси на мембрану [c.63]

ИММОБИЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ НА ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ШАРИКАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЛУТАРОВОГО АЛЬДЕГИДА [c.88]

Иммобилизованные ферментные препараты обладают существенными преимуществами при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными соединениями, что определяется легкостью отделения от пищевого продукта, многократностью использования дорогостоящего препарата, возможностью осуществления технологических процессов производства и переработки пищевой продукции в непрерывном потоке. Для иммобилизации белков в качестве носителей применяют природные, синтетические полимеры и др. [1]. [c.213]

Как правило, иммобилизация белков на поверхности кремнезема проводится методами, широко используемыми для закрепления аминосодержащих лигандов в аффинной хроматографии (см. разд. 7.4), однако для повышения стабильности хиральных фаз данного типа используют поперечную сшивку молекул белков. В работе [299] хиральная фаза была получена простой поперечной сшивкой глутаровым альдегидом молекул БСА, адсорбированных на поверхности силикагеля, при этом особо отмечено, что отсутствие прочной ковалентной связи БСА с поверхностью носителя существенно не изменяет стабильности фазы. [c.447]

Иммобилизация белка происходит в очень мягких условиях. Оптимальное значение pH для разных белков различно (в пределах от 5 до 9). [c.237]

Приемы химической (ковалентной) иммобилизации белков [c.86]

Иммобилизацию белков на самых разных носителях используют для решения множества химических задач. Этот вопрос подробно рассмотрен в монографиях [10, 34, 59], а также в гл. 6. Аналитические приложения иммобилизации описаны в [7]. Из-за недостатка места мы не можем отдать должное всем работам в этой области. Читателю, желающему получить более детальные сведения, рекомендуем обращаться к упомянутым выше источникам и к оригинальным работам. В этом разделе мы лишь отметим некоторые типичные эффекты, связанные с иммобилизацией. [c.111]

Существует несколько стратегических подходов к синтезу водорастворимых полимерных производных белков (рис. 5.1). Первый и наиболее распространенный подход заключается в ковалентном связывании белка с водорастворимым функциональным полимером. По замыслу эта стратегия аналогична той, которой придерживаются при иммобилизации белков на нерастворимых носителях, однако переход к растворимым конъюгатам и необходимость последующего их введения в организм вызывает дополнительные проблемы. Как белок, так и полимер-носитель являются полифункциональными реагентами. Поэтому трудно (хотя все же возможно) избежать многоточечного связывания этих полимеров друг с другом. В некоторых случаях, правда, процесс многоточечного связывания даже желателен, так как приводит к закреплению конформации белка и повышению его устойчивости к действию внешних факторов [5]. Однако не всегда закрепление конформации положительно отражается на каталитической активности фермента. Ряд белков меняет конформацию в ходе функционирования (например, гемоглобин), и в этом случае жесткое закрепление какой-либо определенной структуры нецелесообразно. [c.160]

Кроме очистки стоков от загрязняющих веществ, немаловажное значение имеет извлечение ценных компонентов из растворов. Сорбционное концентрирование широко применяется в аналитической химии белков, так как позволяет избирательно выделять эти вещества из биологических сложных систем. Изучена адсорбция бычьего сывороточного альбумина (БСА) на незаряженной и поляризованной поверхности исходного и модифицированного гидроксидом титана углеродного волокна. Подобраны оптимальные условия иммобилизации белков на тонкослойных сорбентах. Показано, что для тонкослойных покрытий гидроксидом титана степень обратимости адсорбции белка зависит от текстуры исходной матриш.1. Изменение заряда повфхности волокна оказывает значительное влияние на адсорбируемость БСА модифицированным сорбентом, что обусловлено различными поверхностными свойствами исходного и титансодержащего волокна. Подобраны условия электродесорбции БСА с поверхности волокнистых материалов. [c.208]

Ключевым фактором успешного развития СВО-приборов для иммуноанализа является иммобилизация одного из компонентов иммунохимической пары на поверхности ЭВО. Методика иммобилизации должна не только удовлетворять таким требованиям, как воспроизводимость, захват большого количества белка, сохранение иммунохимической активности и устойчивости, но и не вызывать химических или физических изменений на поверхности, которые могли бы приводить к нежелательным оптическим эффектам (например, рассеянию света). Поскольку в большинстве работ по данному вопросу использовали кварц или стекло, мы ограничимся обсуждением только этих материалов. Кроме того, в дальнейшем мы будем рассматривать только иммобилизацию белков. На поверхностях ЭВО можно иммобилизовать и многие антигены небелковой природы. Для этого используют химические реакции, пригодные лишь для определенных соединений, поэтому здесь мы их также не будем обсуждать. Отметим, однако, один из подходов к решению данной проблемы, состоящей в том, что на ЭВО наносят белок (например, бычий сывороточный альбумин), с которым затем связывают его небелковый антиген [24]. [c.528]

Наиболее распространенны.ми методами иммобилизации белка на кварцевых или стеклянных поверхностях являются физическая адсорбция и ковалентное связывание. По данному вопросу имеется значительное ко.тичество информации (см., например, обзоры [20], [34], [53-55]) и для подробного ознакомления отсылаем читателя к этим обзорам, а в этой главе ограничимся рассмотрением общих принципов. [c.528]

Первоначальным шагом в любом эксперименте блоттинга является иммобилизация белков на мембране. Наиболее популярные методы блоттинга используют для переноса белков из геля на мембрану электрофоретический перенос. Он является быстрым и эффективным методом, а также сохраняет высокое разрешение, полученное при электрофорезе в полиакриламидном [c.63]

Механизм активации и связывания точно не установлен возможно, что активация сопряжена q образованием циклических и ациклических имидокарбонатов. Иммобилизация белков протекает в мягких условиях, при 4 °С и pH от 7 до 10 в течение нескольких часов. Для подавления адсорбции белок—белок в процессе иммобилизации рекомендуется использовать буферные растворы с большой ионной силой, например 0,1 М карбонатно-бикарбонатный или боратный буферные растворы с добаблением Na l (0,5 М). [c.233]

Иммобилизация белков на эупергите С (оксиран-акриловые шарики). Общая методика [c.135]

Многоточечное ковалентное присоединение фермента к поверхиости носителя (рис. 24,а). Другой путь ужестчения структуры фермента заключается в его иммобилизации на носителе с образованием большого числа ковалентных связей. Для реализации многоточечного взаимодействия необходимо, чтобы размеры ферментной глобулы и поры носителя соответствовали друг другу. Если проводить иммобилизацию белка на произвольно взятом носителе, то такое соответствие можно получить лишь случайно, поскольку поверхность носителя и поверхность белка имеют свои индивидуальные рельефы, в общем случае не комплементарные друг другу. [c.129]

За последние 20 лет в области энзимологии достигнуто глубокое понимание физико-химической сущности биологического катализа, выявлены основы специфичности и стереоспецифичности действия ферментов, найдены механизмы регуляции таких важнейших свойств ферментов, как активность и стабильность. Широкое развитие методов химической модификации и иммобилизации белков, а также достижения современной биохимии н микробиологии дали возможность выделять практически любой фермент в нужном количестве и на его основе создавать необходимый гетерогенный катализатор. Благодаря этому, с начала 70-х годов ферменты стали находить применение в современной промышленности и медицине. Экономический эффект только от внедрения первого в нашей стране процесса инженерной этимологии — биокаталитического получения 6-аминопени-циллановой кислоты — составил более 100 млн. рублей. Открылись широкие перспективы использования ферментов для анализа, в 10ИК0М органическом синтезе, в системах биоконверсии солнечной энергии и ряде других областей. [c.6]

Если необходимо нанести на гель большой объем разбавленного белкового раствора, то его можно смешать с гелеоб-разующнм раствором перед проведением полимеризации. Однако при этом возникают два источника ошибок. Один из них заключается в том, что в процессе полимеризации может произойти химическая модификация белков [168, 362, 877, 1153]. Наиболее серьезная опасность образования артефактов исходит от персульфата, поэтому при исследовании чувствительны.с белков лучше воспользоваться фотополимеризацией. Второй источник ошибок связан с возможностью иммобилизации белков в теле. Чтобы избежать обо нх видов артефактов, гель следует формировать в отсутствие белков и перед нанесением проб подвергать его преэлектрофокусированию. Для предотвращения денатурации белков под действием кислых или щелочных электродных растворов рекомендуется. поверх образца наносить слой раствора амфолитовнносителей с той же концентрацией, что и в геле (обычно 1—2%). Разумеется, если исследуемый раствор наносят на поверхность геля, то он должен содержать достаточное количество сахарозы нл н глицерина, обеспечивающее разницу в плотности между ним и находящимся выше слоем электролита. [c.148]

Концентрация белка. Во избежание полимеризации олигомеров концентрация белка в реакционной смеси должна быть низкой. Если известна молекулярная масса олигомера, то признаком образования межмолекулярных (между молекулами олигомера) связей будет присутствие в смеси компонентов с молекулярной массой, превышающей М олигомера. Воспрепятствовать образованию поперечных связей (сшивок) олигомеров можно с помощью предварительной иммобилизации белка на нерастворимой матрице [135], например благодаря образованию дисульфидной связи с тиольными группами сефарозы 4В (разд. 3.2.5) далее можно провести обработку бисиминоэфира-ми [32]. [c.55]

Ковалентная иммобилизация антител. /Со-валентное связывание антител с носителями осуществляют главным образом за счет свободных амино- и карбоксильных групп, йахОДящХися на поверхности глобулы макромолекулы,. Для связывания антител могут использоваться многие методы, разработанные для иммобилизации белков и ферментов на носителях органической и неорганической природы. Эти методы различны по степени сложности синтеза и доступности реагентов. Многие из Них могут быть корректно осуществлены только специалистами в области органической и биоорганической химии. [c.203]

Существующие способы ковалентной иммобилизации белков и ферментов на полистироле и его производных в основном разработаны для макропористых носителей и полистирольных гелей, используемых в ионообменной хроматографии. Сложность ковалентной Пришивки для целей ИФА состоит в том, что модификации должно подвергаться готовое штампованное изделие из оптически прозрачного непористого полистирола (или другого полимера). При этом оптические свойства носителя в процессе активации не должны ухудшаться, так как. На конечной стадии анализа Лунки планшета или пробйрка служат кюветой Для фотометриро-вания продукта ферментативной реакции. С другой стороны, условия модификации должны исключать изменение однородности поверхности носителя (Частичное растворение набухание полимера [c.206]

Источником входной информации для биокомпьютера являются сверхчувствительные датчики-преобразователи на иммобилизованных ферментах. Работы по их созданию также миновали стадию эмпирического поиска благодаря успехам молекулярной биофизики. Можно конструировать датчики с нужными свойствами, избирательностью и высокой чувствительностью. Биологические устройства способны преобразовывать энергию самых различных видов — химическую, механическую, световую, электрическую, причем в ряде случаев возможно обратное ее преобразование, что позволяет использовать одни и те же биопреобразователи для измерения различных параметров коэффициент полезного действия их чрезвычайно высок и иногда близок к 100%. Биодатчики реагируют на самые разные вещества, улавливая отдельные молекулы как в воздухе, так и в растворах и обладают повышенной устойчивостью к физико-химическим воздействиям. Чувствительный элемент биопреобразователей получают путем иммобилизации белков, ферментов или колоний микроорганизмов к подложкам. На основе глобулярного белка, упругость которого различна в разных направлениях, конструируют хемомеханические датчики. [c.46]

Основные вопросы, связанные с иммобилизацией белков. При рассмотрении вопросов, связанных с иммобилизацией белков, в первую очередь необходимо отметить, что при иммобилизации белок частично денатурируется, то есть, по наиболее общему определению, изменяет в какой-то степени свои первоначальные (нативные) характеристики. Эти изменения происходят как под воздействием физико-химических условий синтеза (температура, состав и концентрация модифицирующего раствора), так и в результате ковалентной межмолекулярной сшивки. Поэтому условия синтеза гетероповерхностного сорбента, предназначенного для анализа биологических проб с прямым вводом, следует подбирать таким образом, чтобы, с одной стороны, не происходило значительных изменений нативной глобулярной структуры белка для создания максимально однородного внешнего покрытия частиц, а с другой — чтобы уже иммобилизованный белок был лишен детерминантных групп (активных центров) для устранения возможных биоспеци-фических взаимодействий с содержащимися в пробе белками. Хотя для иммобилизации используются преимущественно инертные белки (например, сывороточный альбумин), их инертность весьма относительна. Но, по крайней мере, такое допущение принимается по сравнению со специализированными белками. Примерно в половине работ, посвященных созданию селективных электродов и сорбентов при иммобилизации ферментов, последние иммобилизуются совместно с альбуминами или коллагеном, либо на их матрицы. [c.544]

В целом, введение аффинных меток в виде обсуждавшихся выше пептидных и полипептидных последовательностей существенно облегчает очистку меченых таким образом рекомбинантных белков, а также предоставляет дополнительные возможности наблюдать за эффективностью экспрессии рекомбинантных генов. Выбор для этих целей системы очистки зависит от конкретного белка, который предстоит получать в очищенном состоянии, а также от целей его дальнейшего использования. В ряде современных систем в рекомбинантные белки вводится двойная аффинная метка, одна из которых служит для очистки белка, а другая - для мониторинга за его биосинтезом. Также с помощью двойной метки может быть достигнута большая степень очистки рекомбинантных белков. Разработаны множественные аффинные аминокислотные последовательности, которые включают в себя кальмодулин-связывающий пептид, специфический сайт расщепления протеиназой и белок А для иммобилизации всей рекомбинантной конструкции. С помощью этих систем удается изучать белок-белковые взаимодействия путем выделения соответствующих белковых комплексов при исследованиях протеома [183, 184]. Методы иммобилизации белков с помощью аффинных последовательностей используются при создании пептидных и белковых микрочипов, клонотек на их основе, для адресной доставки белков и во многих других приложениях. О некоторых из них будет дополнительно рассказано в разделе П.3.2. [c.132]

В устройствах для СВО используют и ряд других систем с ковалентным связыванием [36]. Так, иммобилизацию белка на поверхности кремниевых пластинок проводят следующим образом. Кремниевые пластинки алкилируют, после чего образованные на алкилированной поверхности гидроксильные группы активируют трезилхлоридом. Трезилатные группы могут затем реагировать с аминогруппами белка. Этот метод применяли для закрепления на кремниевых поверхностях конканавалина А, который в дальнейшем реагировал с клетками S. aureus. Взаимодействие клеток с поверхностью контролировали с помощью эллипсометрии [32]. [c.530]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология