Метод EPL в белковой инженерии

Разработанный Ферштом эмпирический подход к изучению термодинамических и кинетических аспектов свертывания белковой цепи с привлечением сайт-направленного мутагенеза позволил автору и сотрудникам проанализировать все этапы формирования трехмерной структуры белка (барназы), не содержащего дисульфидных связей [31-33]. Изучение обратимой денатурации начинается с тщательного визуального анализа трехмерной структуры белка с целью выявления остатков, которые предположительно могут играть важную роль в структурной стабилизации и кинетике свертывания. Следующий этап заключается в модификации потенциально важных для сборки межостаточных взаимодействий путем специальных химических изменений белковых цепей актуальных остатков и сайт-направленного мутагенеза. Завершается этап составлением оптимального набора и его синтеза методами генной инженерии. Далее проводятся термодинамические и кинетические экспериментальные исследования механизма ренатурации (денатурации) нативного белка и мутантов, определения констант равновесия, констант скорости и величин изменений свободной энергии Гиббса стабильных структур, промежуточных и переходных состояний. Найденные значения используются для построения энергетических профилей путей свертывания белковых цепей дикого и мутантного типов. На их основе определяются разностные энергетические диаграммы, которые показывают различия в уровнях энергии всех состояний на пути свертывания белка и мутантов. Реализация описанной процедуры приводит к эмпирическим зависимостям между важными для свертывания белковой цепи взаимодействиями боковых цепей и параметрами, по мысли Фершта, характеризующими кинетику, равновесное состояние и механизм ренатурации [И]. Каждая мутация, которая в [c.87]

Крупные открытия в науке обычно делаются при разработке фундаментальных проблем. Мы разделяем мнение большинства врачей о том, что последние достижения биотехнологии, нашедшие применение в самых важных отраслях медицины, оказывают и будут оказывать революционизирующее воздействие на диагностику, лечение и понимание основ патологии многих тяжелых заболеваний. Ориентируясь на читателей, не имеющих медицинской подготовки, мы расскажем о том, какую важную роль играют в клинической практике некоторые новые подходы, а также широко используемые методы диагностики. Мы по необходимости ограничимся лишь немногими примерами, но читатель может без труда дополнить их множеством других использованием в терапии белков, которые можно синтезировать при помощи видоизмененных методами генетической инженерии микроорганизмов, применением моноклональных антител, ферментов и т. д. Мы не обсуждаем использующиеся при этом технологические процессы сколько-нибудь подробно (о них речь идет в других главах) исключение составляет лишь раздел о синтезе инсулина человека дело в том, что инсулин был первым белком, полученным с помощью технологии рекомбинантных ДНК и испытанным на людях, а также первым или одним из первых) препаратом такого рода, нашедшим применение в клинике. [c.325]

Задача конструирования и производства генно-инженерных вакцин будущего может быть решена лишь как составная часть фундаментальной проблемы — создание методами генной инженерии искусственных белков с заранее заданными свойствами и структурой. [c.254]

Наконец сейчас достигнут новый уровень в развитии знаний по этому вопросу — он касается всех технических приемов и методов генной инженерии. Этот уровень прямо ориентируется на сам наследственный материал — нуклеиновые кислоты и особенно ДНК. В данной части главы после определения понятия биохимического полиморфизма будут рассмотрены различные причины появления множественных форм белков, а также ограничения основной методики, применяемой для демонстрации этого полиморфизма. [c.37]

Белковая инженерия может быть основана на химической модификации готового белка или на методах генетической инженерии, позволяющих получать модифицированные варианты природных белков. [c.182]

Как уже упоминалось, ПК в качестве лигандов могут обладать как групповой специфичностью (для белков хроматина, факторов управления трансляцией, нуклеаз и др.), так и индивидуальной (для индивидуальных мРНК, белков-регуляторов транскрипции и др.). Во втором случае на аффинном сорбенте должны быть закреплены вполне определенные участки генома. Это стало возмолшым после создания способов отбора и наработки в достаточных количествах строго идентичных фрагментов ДНК методами генной инженерии. В последнее время возникла еще одна область использования иммобилизованных НК — в качестве праймеров матричного синтеза. Эти приложения предъявляют разные требования к характеру фиксации НК на матрице. В первом случае расположение точек закрепления на молекуле НК может быть произвольным, во втором определенные и достаточно протяженные участки полинуклеотидной цепи должны быть свободны для комплементарного взаимодействия, а в третьем закрепление НК на матрице желательно осуществить лишь по одному определенному концу молекулы. Что же касается возможности реакций с активированными матрицами, то вдоль всей молекулы НК во множестве располагаются химически эквивалентные группы аминогруппы нуклеиновых оснований, гидроксилы сахаров и др. В особом положении находится только концевой остаток фосфорной кислоты или сахара. [c.387]

Интерфероны. Интерфероны—это ингибиторы размножения многих типов вирусов. Открыто несколько типов интерферонов (а, 3 и у), некоторые из них получены методами генетической инженерии. Это сравнительно небольшие сложные белки с мол. массой у разных видов животных и человека от 25000 до 38000—40000). Они образуются в клетке в ответ на внедрение вирусной нуклеиновой кислоты, ограничивая вирусную агрессию (инфекцию). Известно также, что группа видоспецифических а-интерфе-ронов синтезируется макрофагами, в то время как у-интерферон продуцируется Т-клетками и стимулируется интерлейкином-2 (см. Лимфо-кины ). Показано также, что у-интерферон в свою очередь повышает цитотоксическую активность макрофагов, Т-клеток и естественных кле-ток-киллеров. Интерфероны наделены антипролиферативной активностью и считаются основными защитными белками не только против вирусной инфекции, но и при опухолевых поражениях. [c.92]

Возникновение и быстрое развитие биотехнологии, приобретающей все большее значение в народном хозяйстве, базируется прежде всего на использовании микроорганизмов как продуцентов множества полезных веществ, как-то кормового белка, многих ферментов, антибиотиков, стероидных препаратов, аминокислот, витаминов и других. Возможности микроорганизмов в этом отношении чрезвычайно велики. На использовании микроорганизмов основаны методы генетической инженерии, позволяющие создавать новые штаммы, обладающие полезными свойствами и образующие ряд важных веществ. [c.5]

Применение методов генетической инженерии для улучшения аминокислотного состава запасных белков растений [c.149]

Разумеется, без достаточных экспериментальных подтверждений мы не можем настаивать на таком объяснении, однако это и не так уже существенно. Важен надежно установленный экспериментальный факт для элюции нативной ДНК (или двунитевой РНК, а также гибридных молекул ДНК—РНК) с оксиапатита требуется почти вдвое более высокая концентрация фосфатного буфера, чем для элюции денатурированной ДНК или однонитевой РНК. Это обстоятельство открыло возможность быстрого и надежного отделения двунитевых молекул нуклеиновых кислот от однонитевых, что сыграло очень важную роль как в изучении структуры генома (исследования кинетики ренатурации), так и в развитии современных методов генной инженерии (гибридизация молекул НК и др.). Как и в случае кислых белков, присутствие даже относительно высоких концентраций неорганических солей в элюирующем буфере практически не сказывается на процессах элюции одно- и двунитевых молекул НК с оксиапатита. Вместе с тем, варьируя концентрацию Na l или КС1 в буфере, можно управлять изменением конформации самих нуклеиновых кислот, а также характером их гибридизации (например, отделять истинные , полноценные, гибридные молекулы от несовершенных гибридов ). [c.230]

Одним из наиболее интересных и обнадеживающих результатов априорного расчета двух низкомолекулярных белков явилось совпадение почти с экспериментальной точностью значений двугранных углов ф, у, и и X (или координат атомов), рассчитанных и найденных опытным путем Безусловно, это достойный и эффективный финал длительного исследования. Допуская достаточность и справедливость всех положений использованной структурной теории, применимость для белков механической модели и эффективность разработанного для пептидов расчетного метода, трудно было все-таки надеяться на количественную близость теоретических и экспериментальных данных. Предполагалось, что на окончательных результатах существенным образом скажется ряд условностей в описании невалентных взаимодействий, в учете влияния среды и, по-видимому, главное, параметризации эмпирических функций. Неизбежным, особенно вначале, представлялось быстро прогрессирующее с увеличением длины цепи накопление ошибок, которое в конечном счете должно было сделать расчет природных полипептидов (даже при правильности всех исходных теоретических посылок) малоперспективным, подобно тому, как пока еще оказывается малоэффективным синтез белков на основе методов органической химии по сравнению с биосинтезом и методами генной инженерии. Почему же этого не произошло в расчете пространственных структур двух рассмотренных белков Случайно ли получено [c.468]

Крупные успехи, достигнутые за последнее время в химическом синтезе ДНК, открыли перед белковой инженерией принципиально новые возможности конструирование уникальных,, не встречающихся в природе белков. Для этого необходимо и дальнейшее развитие технологии, так чтобы изменение генов методами генетической инженерии приводило к предсказуемым изменениям белков, к улучшению вполне определенных функциональных их характеристик числа оборотов, Км для конкретного субстрата, термостабильности, температурного оптимума,. [c.182]

Разработанная система актуальна для теоретической и экспериментальной работы с белковыми молекулами, особенно в связи с развитием методов белковой инженерии при конструировании белков с новыми или измененными функциями. [c.151]

Основные методы генной инженерии были разработаны в начале 70-х гг. Суть этих методов — введение в организм нового гена. Такой ген может быть синтезирован заново, а может быть перенесен из другого организма. Если в геном бактерии встроить ген, кодирующий какой-либо белок, бактериальная клетка превращается в живую фабрику по производству этого белка. В ка- [c.215]

Методами генной инженерии удается объединить в одном геноме антигены многих вирусов, например, гриппа и бешенства, герпеса и гепатита В. Клетки, зараженные одним вирусом, приобретают временный иммунитет к заражению другим вирусом - такое явление называется интерференцией. Это сложный процесс, определяемый многими факторами, в том числе и синтезом в клетке специального белка - интерферона. До сих пор интерфероны выделяли из крови животных или из донорской крови, что являлось сложным и дорогим методом. Генноинженерный способ получения интерферона (выделение его гена и клонирование в плазмидных векторах) позволил практически решить проблему достаточного обеспечения интерфероном больных гриппом даже во время эпидемий. [c.62]

У молекулярной иммунологии, науки, переживающей буквально взрыв из-за вторжения в нее методов генной инженерии, еще масса нерешенных проблем. Как организм умудряется не вырабатывать антитела к собственным белкам По-видимому, есть какой-то способ отбраковки лимфоцитов. Гигантская проблема — поиск связи между иммунитетом и раком. Ведь эта болезнь так же, как и иммунитет, — удел позвоночных. Несомненно, между этими двумя важнейшими для жизни всех людей явлениями существует очень тесная связь. Эту связь изучают на всех уровнях, включая уровень ДНК. Нет сомнений, что открытие возможности перегруппировки генов в ходе развития проливает совершенно новый свет и на проблему рака. Но все это — вопросы, на которые еще предстоит искать ответы. [c.87]

Не вызывает сомнения, что методы генетической инженерии будут играть ведущую роль в развитии биотехнологии и найдут ней самое широкое применение. Уже сегодня с помощью бактерий и дрожжей мы получаем в больших количествах белки эукариот и вирусов, которые применяются в медицине и ветеринарии. В табл. 7.1 перечислены некоторые белки, для синте- [c.320]

Впрочем, одна э ача вырисовывается достаточно четко. Это — производств промышленным путем белка для корма скоту. Дело в том, что обычный корм (сено, зеленая масса кукурузы) обеднен белком, особенно некоторыми аминокислотами. Восполнение этого дефицита резко увеличивает эффективность усвоения обычных кормов. Это известно давно, и уже много лет некоторые аминокислоты производятся промышленным, микробиологическим способом и добавляются в корм. Методы генной инженерии позволяют сконструировать штаммы, обладающие невиданной ранее производительностью, так что задачу производства корма, оптимально сбалансированного по белку, биотехнология, несомненно, решит. [c.127]

В клетках, несущих соответствующие клонированные гены, можно также с высоким выходом получать большое количество разнообразных белков, полезных в сельском хозяйстве. Например, с помощью методов генетической инженерии была создана новая высокоэффективная [c.989]

Большие успехи в синтезе олиго- и полидезоксирибонуклеотидов в сочетании со знанием генетического кода позволяют химически синтензировать гены для произвольного белка с известной первичной структурой. Эти гены могут быть использованы для синтеза этого белка бактериями или клеточными культурами после введения его в клетки методами генетической инженерии (см. 7.11). [c.174]

Наиб, крупные достижения М. б. расшифровка структуры белков и нуклеиновых к-т (М. Перутц, Дж. Кевдрю, Дж. Уотсон, Ф. Крик, У. Гилберт) создание адапторной теории белкового синтеза (Ф. Крик) и теории регуляции синтеза белков в бактериях (Ф. Жакоб, Ж. Моно) открытие транспортной и матричной РНК, расшифровка генетич. кода (М. Ниренберг, G. Очоа) открытие обратной транскрипции (X. Темин, Д. Балтимор), прерывистой структуры генов и механизма созревания матричных РНК у эукариот развитие методов генной инженерии (П. Берг, [c.347]

Молекулярные основы фиксации азота всесторонне исследовались на К. pneumoniae, которая может служить модельной системой для изучения симбиотических бактерий семейств Rhizobium и Bradyrhizobium. Детально охарактеризована нитрогеназа, азотфиксирующий фермент. Молекулярно-генетические исследования показали, что фиксация азота бактериями — это сложный процесс в нем участвует семь координированно регулируемых оперонов, кодирующих в общей сложности 20 разных белков. Это делает пока невозможным создание с помощью методов генной инженерии растений, которые могли бы сами усваивать азот, и других азотфик-сирующих бактерий. [c.327]

Расширяющееся в настоящее время применение вакцин в ветеринарной медицине делает их производство важной сферой применения методов генетической инженерии. Однако их использование осложняется тем, что условием иммуногенной активности антигенных детерминант любого типа является экспонирование, определяющееся их поверхностным расположением и степенью доступности для взаимодействия с антителами. Иными словами, иммуногенные и антигенные свойства вирусных белков сильно зависят от их вторичной, третичной и четвертичной структур. Именно этот факт является причиной значительно более низкой иммуногенной активности субъединиц, в которых локализованы главные антигенные детерминанты. [c.252]

Чужеродный сегмент вырезается из донорной ДНК. ДНК-хозяин называется плазмидой. В клетках бактерий плазмидная кольцевая ДНК реплицируется независимо. Если конструкция работает успешно, клетки могут направлять синтез мРНК и в конечном итоге белка. Целью является видоизменить ДНК, закодировав ее для производства определенного белка. Бактерии, созданные методом генной инженерии, могут выращиваться как колонии идентичных организмов (клоны), вырабатывающих белок, информация о синтезе которого закодирована фрагментом исходной ДНК. [c.118]

В конце 70-х годов XX в. на основе технологии рекомбинантной ДНК получили гормон роста микробного происхождения. Было показано, то ГР оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животного, как и гипофизарный ГР. Гормон роста, полученный с помощью методов генетическсШ инженерии, при крупномасштабном применении вызывал уветачение удоев на 23 — 31 % при дозе 13 мг в день. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позволяющие использовать его один раз в две недели и даже в месяц. При ежедневной инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, свиней и овец удалось увеличить суточные привесы на 20 — 30% при значительном сокращении расхода кормов на единицу прироста. У молодняка свиней с ускорением роста увеличивалось содержание белка и уменьшалось содержание жира в тканях, что повышало качество мясопродуктов. [c.129]

Чтобы создавать рекомбинантные ДНК, несущие желаемый ген, необходимо прежде всего располагать этим геном. Для этого используют три основных способа. Во-первых, если известна первичная структура белка, получение которого желательно осуществить методами генетической инженерии, можно, основываясь на генетическом коде, построить нуклеотидную последовательность, программирующую этот белок, и осуществить химико-ферментативный синтез гена. Так, например, были осуществлены синтезы нескольких генов, кодирующих различные интерфероны. Во-вторых, можно выделить из тканей, в которых происходит экспрессия гена, информационные РНК, среди которых должна присутствовать и мРНК, кодирующая необходимый белок, провести с помощью обратной транскриптазы синтез комплементарной ДНК (сокращенно кДНК) и перевести ее в двунитевую структуру с помощью Д П<-полимеразы. Можно, наконец, вырезать желаемый ген непосредственно из ДНК того объекта, бело которого собираются продуцировать. Два последних подхода не дают сразу же индивидуального гена и требуют предварительного отбора из сложной смеси кДИК или фрагментов хромосомной ДНК. Эта проблема решается уяЛ на уровне илстои микроорганизмов, в которые введены новые наследственные программы, и пути ее решения будут изложены несколько ниже. [c.301]

Результаты этого эксперимента показали, что термостабильность фермента повыщается при образовании новых дисульфидных связей, при этом наиболее термостабильным является белок с максимальным числом таких связей. Однако некоторые варианты (С, Е и F), будучи более термостабильными, чем нативный фермент или фермент псевдодикого типа , не обладают ферментативной активностью. Возможно, это обусловливается искажением конформации белковой молекулы при образовании дисуль-фидной связи между остатками 21 и 142. Хотя создание новых белков с помощью методов генной инженерии часто представляет собой эмпирический процесс (т. е. далеко не всегда бывает ясно, замены каких именно аминокислот позволяют получить наилучший вариант), описанный эксперимент показывает, что получение термостабильных белков с дополнительными дисульфидными связями вполне реально. [c.169]

Методы генетической инженерии стали важным инструментом биохимических исследований. В частности, они не только открыли возмогкность получения значительных количеств ранее мало доступных белков, в том числе эукариотических, но и возможность внесения направленных точечных изменений в первичную структуру белков, т.е. закхены одного определенного аминокислотного остатка на любой другой произвольно выбранный аминокислотный остаток (в пределах 20 аминокислот, из которых могут строиться полипептидные цепи при трансляции). Это достигается путем замены соответствующего кодона в ге1ю, программирующем исследуемый белок. Такая процедура называется сайт-специфичным мутагенезом. [c.305]

В последние годы анализ первичной структуры белков на основе исследования нуклеотидной последовательности соответствующих генов принимает все большие масштабы. Первоначально такие исследования касались белков прокариотических организмов, в основном Е. oli, генетика которых хорошо изучена, и получение структурных генов не представляло большого труда. По мере развития методов генной инженерии появилась всгзможность выделять также структурные гены белков эукариот. [c.81]

Плодовые растения, содержащие тауматины. не плодоносят вне своего природного ареала, поэтому предпринимаются попытки получать сладкие белки для широкого практического использования с помощью методов генной инженерии. [c.294]

В настоящее время природа протон-проводящего пути бактериородопсина интенсивно изучается в различных лабораториях. Одним из наиболее эффективных подходов в- этом направлении является использование методов белковой инженерии, суть которых состоит в замене одних аминокислот белка другими путем изменения соответствующих кодонов в гене с помощью направленного мутагенеза. В лаборатории Г. Кораны получено около 15 мутантных генов. Детальное исследование полученных таким образом белков с измененной аминокислотной последовательностью позволит ответить на вопрос о вовлеченности тех нлн иных аминокислот в общий механизм функционирования ба <тернородопснна. Безусловно, важная информация будет получена нз данных рентгеноструктурного анализа по третичной структуре бактериородопсина с разрешением 0,250,3 нм. [c.610]

Вакцины — антигены, получают, клонируя гены возбудителя болезни в Е. oli, дрожжах, клетках насекомых и млекопитающих. В настоящее время клонирован ген поверхностного антигена HBS-внруса гепатита (сывороточного гепатита), ген белка оболочки VPI — вируса ящура. Вирус ящура существует в виде многих серотипов. Методом белковой инженерии удалось скомбинировать иммуногенные компоненты различных серотипов в рамках одной вакцины-антигена. [c.249]

Как известно, существуют стандарты безопасности новых видов продукции. К числу наиболее строгих из них относятся те, которые касаются медицинских препаратов, а также продуктов, потребляемых в животноводстве и особенно в пищев )й промышленности. Используемые при этом методы и требования хорошо обоснованы, и, хотя затраты на контроль велики, это не мешает выработке доброкачественных продуктов биотехнологии, например грибного белка для питания людей (гл. 3). Тем не менее сама возможность использования генетической инженерии вызвала в 70-х годах озабоченность общественности и стала предметом обсуждения. Правительства стран, в которых возникли такие дебаты, создали подотчетные обществу организации, призванные контролировать использование методов генетической инженерии. Естественно, что в разных странах для этой цели были разработаны как разные методы контроля, так и несколько неодинаковые стандарты. Спустя десять лет в результате накопления опыта использования новых методов биотехнологии, мониторинга и контроля стало очевидным, что первоначальные правила безопасности были излишне строгими. Эти правила для большинства обычных генетических манипуляций постепенно смягчились, В то же время для некоторых манипуляций правила, касающиеся условий и способов производства, остались очень строгими и будут по необходимости оставаться таковыми. В этом плане правительство Японии было [c.32]

Перед изготовлением сыра молоко разделяют на творожную массу и сыворотку. Для этого в молоко в тшательно контролируемых стерильных условиях вносят стартовую культуру, содержащую нужные микроорганизмы. Образующаяся в процессе ферментации молочная кислота начинает заквашивать молоко, вызывая коагуляцию (затвердение) казеина — растворимого белка, который содержится в молоке. Именно это происходит при свертывании молока. Добавление сычужного фермента, который содержит реннин, позволяет ускорить коагуляцию и более точно ее контролировать. Обычно сычужный фермент получают из телячьих желудков, однако сходную по свойствам протеиназу можно вьщелить из опреде -ленных видов грибов или пггаммов бактерий, модифицированных методами генной инженерии. Преимуществом таких новых ферментов является возможность их использования для приготовления кошерных и вегетарианских сыров. [c.76]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология