Константы скорости ферментативных реакций и лимитирующие процессы

При выборе подходящего медиатора для амперометрического биосенсора весьма полезным может оказаться метод постояннотоковой циклической вольтамперометрии. Этот метод позволяет установить многие важные свойства медиатора. Обычно желательно, чтобы медиатор имел низкий окислительНо-восстановительный потенциал и высокую константу скорости электрохимической реакции. Последнее условие связано тем, что сигнал биосенсора не должен лимитироваться кинетикой электродных процессов. Оба параметра можно определять с помощью одноимпульсной циклической вольтамперометрии. По изменению формы вольтамперных кривых во времени можно оценивать также стабильность медиатора в зависимости от pH, давления кислорода, присутствия ингибиторов и мешающих примесей. Еще более важно, что метод дает качественную и количественную информацию об электрохимически сопряженных ферментативных реакциях, на которых основано функционирование медиаторных амперометрических биосенсоров. [c.203]

С другой стороны изучение ферментативных реакций в стационарном режиме имеет ряд существенных недостатков. Наиболее важным из них является то, что стационарная кинетика дает весьма ограниченную информацию о детальном кинетическом механизме ферментативной реакции. Стационарная кинетика, отражая лишь лимитирующие стадии процесса, практически не дает информации о быстрых , нелимитирующих стадиях превращения субстрата в активном центре фермента. Определение элементарных констант скорости многостадийной ферментативной реакции из данных стационарной кинетики не представ-ляется.возможным. Действительно, кинетика каталитической реакции, включающей п промежуточных соединений (схема 5.16), описывается 2 п + 1) константами скорости. Стационарная же скорость этой обратимой реакции независимо от числа промежуточных соединений, принимающих участие в механизме реакции, дается уравнением (см. гл. VI) [c.174]

Б. Константы скорости ферментативных реакций и лимитирующие процессы [c.159]

Предположим, например, что при расщеплении субстрата АВ фермент смещает электронную плотность по направлению от А к В. Эту гипотезу можно проверить, измеряя константы скорости ферментативного расщепления для ряда субстратов А В, где А — остатки различной электроотрицательности. Если специфичность фермента не позволяет варьировать структуру А, аналогичное исследование можно провести, варьируя структуру В. При этом, разумеется, необходимо располагать способом определения индивидуальной константы скорости для стадии расщепления данной связи в молекуле субстрата. Описанный метод находит весьма широкое применение. Он непригоден только в тех случаях, когда стадией, лимитирующей максимальную скорость процесса, являются конформационные изменения фермента или отщепление продукта реакции, а не перераспределение электронов в субстрате или его комплексах. [c.192]

Максимальная скорость ферментативной реакции характеризует самый медленный кинетический процесс (или группу самых медленных процессов), протекающий в активном центре катализатора. Действительно, из рассмотренной выше кинетической схемы реакции с участием произвольного числа п лабильных интермедиатов следует, что если существует какая-либо реакция, характеризуемая наименьшим значением константы скорости к. [см. схему (2.12) и уравнение (2.14)], то эта константа будет определять величину максимальной скорости реакции. Если к. kJ, ] = 2, г, то к.. Поскольку лимитирующие процессы [c.98]

Кроме того, за счет много-стадийности ферментативного процесса при одних температурах одна стадия может лимитировать скорость ферментативной реакции, а при других температурах— другая стадия. Поэтому температурные зависимости равновесной константы фермента- [c.186]

После того как было выяснено, что константа скорости реакции расщепления S—S-связи в тиосульфате является лимитирующим фактором, ограничивающим максимальную скорость всего процесса, появилась возможность решить вопрос о вероятном участии сильной нуклеофильной группировки фермента в этой реакций. Этот вопрос возник в связи с весьма значительным выигрышем в энтропии, который давала ферментативная реакция по сравнению с некатализированной реакцией тиосульфата с цианидом. Механизм двухтактного замещения благоприятствует реакции между двумя одноименно заряженными ионами, поскольку в этом случае заряд первого субстрата уходит в раствор вместе с продуктом реакции до того, как происходит реакция со вторым субстратом. Для реакции тиосульфата с цианидом этот электростатический энтропийный фактор сам по себе дает разницу в свободной энергии активации около 6 ккал/моль. Помимо того-, замена бимолекулярной реакции на мономолекулярную на стадии, лимитирующей общую скорость, должна снижать AG на 1,4— 2,4 ккал/моль за счет вклада неэлектростатической энтропии, определяющегося либо в соответствии с гипотезой о повышении концентрации до 10 AI (стр. 102), либо в соответствии с представлением об энтрЬпийном факторе отбора , равном 8 э. е. Если учесть небольшой дополнительный вклад строгой ориентации тиосульфат-иона в комплексе, то общий выигрыш энтропии будет весьма близок к величине общего изменения ДС. Если бы все перечисленные составляющие выигрыша энтропии могли быть реализованы, то для расщепления связи в субстрате с помощью нуклеофильной группировки фермента такой же силы, как цианид, было бы достаточно небольшого электрофильного смещения альтернативно реакция могла бы проходить с очень слабым нуклеофилом, но тогда должно было бы существовать сильное электрофильное влияние, например со стороны иона металла, связанного с ферментом. [c.208]

Все эти рассуждения в равной мере можно отнести и к анализу температурных зависимостей кинетических параметров ферментативных реакций (например, которые зачастую представляют собой комбинации констант скоростей индивидуальных процессов [см. уравнение (6.10)], в свою очередь обычно зависящих от pH среды см., например, (6.181)]. Поэтому изучение температурных зависимостей может представить интерес лишь в том случае, когда известен механизм протекания реакции и установлена его лимитирующая стадия. [c.264]

Если равновесие между Е и Е сдвинуто в сторону образования Е, а равновесие между ES и E S — в сторону образования E S (для того чтобы отметить это, мы воспользовались тонкими и жирными стрелками), то S должен связываться более прочно формой Е, чем формой Е, поскольку для соблюдения второго закона термодинамики необходимо, чтобы константа равновесия для полной реакции Е + S E S была одинаковой независимо от пути, по которому совершается переход от Е к E S. Если реакция рас-лада E S Е + Р протекает гораздо быстрее, чем реакции изомеризации Е ->- Е и ES ->-E S, то процесс связывания субстрата не может достичь равновесия. При низких концентрациях S форма Е изомеризуется в Е еще до того, как S успеет с ней связаться. При высоких же концентрациях S последний имеет возможность связаться с Е, прежде чем эта форма превратится в Е. Таким образом, кажущееся сродство фермента к субстрату растет при увеличении концентрации субстрата, или, иными словами, связывание субстрата является кооперативным. Важно подчеркнуть, что реакция E S- -Е -Ь Р должна быть быстрой если эта стадия настолько медленна, что лимитирует скорость ферментативного процесса, нарушения равновесия в связывании субстрата не происходит и насыщение субстратом не может быть кооперативным. [c.196]

На первой стадии процесса происходит трансформация исходного лимитирующего субстрата под действием фермента (или ферментной системы) Е с образованием ключевого метаболита У. Этот процесс представляет собой обычную ферментативную реакцию, и кинетика его описывается классическим уравнением Михаэлиса-Ментен. Ключевой метаболит 5 участвует в процессе репликации и в других параллельных процессах, приводящих к накоплению клеточного материала Р. Предположим, что скорость синтеза ДНК на матрице ДНК пропорциональна концентрации промежуточного метаболита 5 и может быть охарактеризована константой скорости а . По физическому смыслу это может быть константа скорости удлинения полимерной цепи на одно основание. Важным также представляется предположение о том, что скорость биосинтеза фермента Е и белков репликационного комплекса — относительно быстрые процессы, концентрации этих компонентов постоянны и не входят в уравнения скорости процесса. Любое из этих предположений может быть неоправданно, что существенно изменит кинетическое описание, однако это не затрагивает принципы излагаемого метода. [c.601]

Большинство экспериментальных кинетических исследований ферментов выполнено в режиме стационарной кинетики в условиях, когда скорость изменения концентраций лабильных интермедиатов существенно ниже скоростей образования продуктов или расхода субстратов. Как правило, постановка экоперимен 1ч)в в стационарном кинетическом режиме не вызывает сложностей. При этом из данных стационарной кинетики получают принципиально важную информацию о скоростях лимитирующих стадий ферментативных реакций. Максимальная скорость ферментативной реакции характеризует самый медленный кинетический процесс (или группу самых медленных процессов), протекающий в активном центре катализатора. Действительно, яз рассмотренной выше кинетической схемы реакции с участием произвольного числа п лабильных интермедиатов следует, что если существует какая-либо реакция, характеризуемая наименьшим значением константы скорости (см. схему (1.20) и уравнение (1.23)), то эта константа будет определять величину максимальной скорости реакции. Если / = 2,. .., п, /=7 1, то кат = - Поскольку лимитирующие процессы представляют наибольший интерес, информацию, получаемую методами стационарной кинетики, трудно переоценить. [c.33]

Можно выделить по крайней мере два лимитирующих процесса, которые могут приводить к наблюдаемым константам скорости. Согласно гипотезе Эйгена и Хаммеса [27] диффузионно-контролируемые стадии ферментативных реакций — в первую очередь стадии переноса протона, протекающие в циклическом режиме, должны характеризоваться константами 10 С". Из рис. 3.1 видно, что большая доля ферментов характеризуется именно этим значением констант скорости. [c.73]

Следовательно, сравнение эффективности и механизмов внутримолекулярных каталитических процессов и ферментативного катализа представляет определенный интерес. Этот метод сравнения следует считать принципиально новым. Так,пространственное сближение групп во внутримолекулярной или ферментативной реакции может изменить течение реакции, либо благоприятствуя механизмам, не наблюдаемым в простых бимолекулярных реакциях, либо приводя к другой лимитирующей стадии по сравнению слпмитрующей стадией бимолекулярной реакции. Прямое сравнение констант скоростей внутримолекулярной и ферментативной реакций (т. е. константы в схеме [c.134]

Как и в кинетике химической, исследования зависимости скорости реакции от темп-ры в интервале, когда не наблюдается тепловой денатурации Ф., позволяют оценивать энергетич. характеристику процесса, важную для понимания механизма действия Ф. Трудность интерпретации экспериментальных данных зависимости стационарной скорости реакции от темп-ры связана с тем, что ферментативные реакции представляют сложные последовательные процессы. Если измеряемая скорость лимитируется к.-л. одной из последовательных реакций, нанр. если ею является максимальная скорость реакции, определяемая одноступенчатым распадом фермент-субстратного комплекса К=А+г[Е]о, то исследование зависимости V= Т) позволяет оценить энергию активации этой стадии реакции. При возможности измерения констант скорости отдельных стадий реакции при различных темп-рах могут быть оценены соответствующие величины энергии активации. Изучение зависимости константы субстрата (К ) от темп-ры позволяет оценивать термодинамич. константы образования ЕВ-комплекса (ДЯ, АР, А8). Применение теории абс. скоростей реакций (теории переходного состояния) при анализе кинетики нек-рых ферментативных реакций позволило оценить энтальпию, энтропию и свободную энергию активации. Общий вывод из относительно небольшого пока числа таких исследований состоит в том, что высокая каталитич. активность Ф. объясняется как существенным снижением энергии активации, так и значительным благоприятным изменехгнем энтропии системы в ходе реакции. [c.210]

Хотя струйные методы позволяют проводить измерения при длительности реакции порядка миллисекунд, а не секунд, все же значительное число важных реакций не удается непосредственно исследовать этим методом и они нуждаются в еще более быстрой технике измерения. Даже медленные лимитирующие реакции в области максимальных скоростей процесса оказываются слишком быстрыми для измерений струйными методами. Помимо того, хотя скорость бимолекулярных стадий можно регулировать путем изменения концентрации, некоторые реакции, например ионные, вообще не поддаются прямому измерению с помощью струйных методов. Для того чтобы заполнить этот пробел в химической кинетике быстрых реакций, Эйген и его сотрудники разработали релаксационные методы, с помощью которых можно проводить кинетические измерения в промежутки времени порядка микросекунд. Эти мощные методы позволяют изучать бимолекулярные реакции, характеризующиеся константой скорости 10 М с . Они нашли применение и в исследовании многих ферментативных реакций (главным образом, в работах Хаммеса и сотрудников [12—17]). [c.185]

Можно выделить по крайней мере три лимитирующих процесса, которые приводят к наблюдаемым константам скорости. Согласно гипотезе, высказанной Эйгеном и Хаммесом (Eigen, Hammes, 1963), диффузионно-контролируемые стадии ферментативных реакций, в первую очередь стадии переноса протона, [c.35]

Хенкенс и Стюртевант [87] детально изучили кинетику взаимодействия цинка с апоферментом. Реактивация белка цинком сопровождается небольшими изменениями ультрафиолетовых спектров [87]. Измерения скорости комплексообразования проводились методом остановленной струи. Степень взаимодействия определя.лась по изменению оптической плотности и по увеличению ферментативной активности. Реакция имеет первый порядок как по апоферменту, так и по цинку. Значение константы скорости — около 10 л- моль -с . Эта величина примерно на два порядка меньше, чем при взаимодействии цинка с небольшими хелатирующими агентами, для которых получены значения 10 —10 л-моль -с [87 — 89]. В последнем случае считают, что скорость процесса лимитируется вытеснением воды из координационной сферы [87]. Скорость [c.579]

Эйген [151] представил зависимость lg (константа скорости транспорта протона) от Ар/С (разница в значениях р/С для донора и акцептора). По этим данным, скорость процесса только тогда лимитируется диффузией, когда р/С акцептора на 2—3 единицы больше, чем у донора. А если р/С донора выше, чем у акцептора, lgfe линейно уменьшается с увеличением Ар/С. Используя наименьшее значение для р/Са (- 7), можно заключить, что переход протона к молекуле Н2О из раствора требует значения р/С акцептора для Н3О+ около —1,7. Следовательно, для прямого перехода протона от координированной у цинка молекулы воды в раствор необходимо, чтобы Ар/С —9. Поэтому даже при самых благоприятных обстоятельствах к не может быть больше 10 —10 С . Тем не менее наблюдаемая на опыте константа скорости для ферментативной реакции псевдопервого порядка составляет 10 с . Некоторые исследователи предполагают транспорт протона от соседнего имидазольного ядра с образованием иона имидазолия [26, 27, 31—33]. Однако и в этом случае вопрос не снимается, так как передача имидазольного протона к воде из раствора также происходит с константой скорости порядка 10 с [151]. [c.616]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология