Активный центр ферментов рибонуклеазы

На рис. 5.1 представлен активный центр рибонуклеазы — фермента, гидролизующего РНК, которая состоит из множества мононуклеотидов. В каталитическом центре находятся два остатка гистидина Гис 12 и Гис 119. Оба эти гистидина участвуют в процессе катализа, причем Гис 12 образует комплекс [c.64]

Предполагают, что формирование активного центра фермента начинается уже на ранних этапах синтеза белка-фермента (см. главу 14) на рибосоме, когда линейная одномерная структура пептидной цепи превращается в трехмерное тело строго определенной конфигурации. Образовавшийся белок приобретает информацию совершенно нового типа, а именно функциональную (в частности, каталитическую). Любые воздействия, приводящие к денатурации, т.е. нарушению третичной структуры, приводят к искажению или разрушению структуры активного центра и соответственно потере ферментом каталитических свойств. Если при подходящих внешних условиях удается восстановить нативную трехмерную структуру белка-фермента (ренатурировать его), то восстанавливается и его каталитическая активность. Это было показано впервые на примере рибонуклеазы поджелудочной железы (см. рис. 1.13). [c.125]

В настоящее время установлено, что специфичность и каталитические свойства многих ферментов обусловлены наличием в молекуле фермента определенных активных центров или активных участков полипептидной цепочки. В ряде случаев установлен характер и порядок чередования остатков аминокислот в этих функционально наиболее важных участках. Так, особенно важную роль играет фрагмент полипептидной цепи, имеющий строение аспарагиновая или глютаминовая кислота —серин — глицин или аланин (холинэстераза, трипсин, тромбин и др.). От некоторых ферментов оказалось возможным отщепить часть молекулы без существенного снижения их каталитической активности. К числу таких ферментов принадлежат, например рибонуклеаза и ряд протеолитических ферментов. [c.124]

Пример 17-В. Свойства активного центра рибонуклеазы А. Структура активного центра панкреатической рибонуклеазы А была установлена путем изучения в спектрах ЯМР сигналов протонов в положении С-2 гистидиновых остатков при добавлении различных концентраций ингибитора — З -цитидинмонофосфата (З -ЦМФ), связывающегося с активным центром фермента, в определенном интервале значений pH. В этом ферменте имеется несколько гистидиновых остатков, но при добавлении З -ЦМФ (рис. 17-14) значительно меняются сдвиги только трех из них [c.505]

Таким образом, происходящая реакция сводится к образованию промежуточного ацилфермента, а затем к переносу ациль-ного остатка к молекуле воды, если протекает гидролиз, или к иному акцептору ацетильной группы. Серии, конечно, содержится в активном центре не всех ферментов. Так, например, у рибонуклеазы его нет, и в этом ферменте, как предполагается, два остатка гистидина выполняют функцию акцептора и донора протонов. Серии и гистидин, несомненно, являются не единственными остатками, необходимыми для работы активного центра. Имеются факты, говорящие об участии триптофана в активных центрах химотрипсина, трипсина, лизоцима, однако об этом пока еще известно мало. [c.84]

В данном разделе речь будет идти о таких ферментативных реакциях, в которых участвуют ферменты, не имеющие в активных центрах ионов металлов, и для которых достаточно точно установлен механизм нуклеофильного замещения у тетраэдрического атома фосфора в молекуле субстрата. В подобных случаях электрофильная атака в пуш-пульном механизме нуклеофильного замещения у фосфора обеспечивается за счет образования водородной связи между нуклеофильным центром реагирующей части молекулы фосфорсодержащего соединения и кислотной группой активного центра фермента. В качестве примера рассмотрим недавно опубликованные работы, посвященные механизму действия рибонуклеазы поджелудочной железы быка ниже будут обсуждены некоторые вопросы, связанные с фосфорилированием и дефосфорилированием активных центров эстераз. [c.577]

Рибонуклеаза по модели, описанной Картой и полученной с разрешением 0,2 нм в результате синтеза Фурье для семи различных производных с тяжелыми атомами (7294 измерения), представляет собой молекулу почкообразной формы размером 3,8 X 2,8 X 2,2 нм. Активный центр фермента находится в почечной борозде — характерной щели, разделяющей молекулу иа две половины и содержащей ответственные за каталитическую активность остатки гистидина (положения 12 и 119) и лизина (положения 41 и 7). [c.402]

Очевидно, что такая информация может представлять большую ценность при детальном изучении связывания субстратов и ингибиторов с активным центром фермента. К сожалению, этот подход неприменим для другого наиболее изученного фермента — рибонуклеазы (см. разд. 14.2.3), поскольку этот белок не содержит триптофана. [c.359]

Понятие о каталитическом и субстратном центре не следует абсолютизировать. В реальных ферментах субстратный центр может совпадать (или перекрываться) с каталитическим центром. Более того, каталитический центр может окончательно сформироваться в момент присоединения субстрата. Поэтому часто говорят об активном центре фермента, представляющем сочетание первого и второго. Активный центр у ферментов располагается на дне щели при двухъядерной структуре, например у лизоцима и рибонуклеазы, или на дне глубокой впадины, как у химотрипсиногена (см. рис. 34). [c.99]

Рассуждения Анфинсена касались рибонуклеазы. Вопрос об универсальности его представлений пока открыт, но, по-видимому, активные центры ферментов могут формироваться на высшем уровне , т. е. тогда, когда ход эволюции уже привел к значительному развитию структур высшего порядка. Постепенное развитие полипептидных систем привело к формированию активного центра, скомпонованного из различных фрагментов изогнутой полипептидной цепи (или цепей), и рождение этого центра положило начало процессам гидролиза, вероятно, ограничившим процесс наращивания цепей. [c.161]

Наличие предуготовленной для субстрата полости обнаружено рентгенографически и у других ферментов. Активный центр рибонуклеазы, расположенный в этой полости, содержит основные остатки Лиз и Арг, взаимодействующие с фосфатными группами РНК (рибонуклеаза катализирует гидролитическое расщепление РНК). Каталитический участок в той же полости образован двумя остатками Гис, осуществляющими основный катализ [89, 90]. Аналогичная полость обнаружена в папаине, активными остатками которого являются Цис 25 и Гис 159 [91]. [c.392]

По данным рентгеноструктурного анализа установлено, что молекула рибонуклеазы представляет собой компактную глобулу с довольно значительным углублением. В этом углублении и помещается активный центр фермента. [c.297]

На рис. 16.15И схематически показана область активного центра рибонуклеазы, содержащей связанный субстрат — динуклеозидфосфат В,рВ2. Этот рисунок сделан на основании молекулярной модели области активного центра фермента, представленной на рис. 16.15,Я. На рис. 16.15,/1 овалами обозначены В,, К, и р, — основание, рибоза и фосфатный остаток первого мономерного эвена динуклеозидфосфата, и В2 и К2 — основание и рибоза второго мономерного эвена. Кроме того, показано другое возможное положение основания второго звена (В2) и положение циклического фосфата (р, ). Когда фосфат находится в положении р,, остаток Ьу5-41 (расположенный вверху справа от фосфата) не может контактировать с фосфатной группой. Однако, когда фосфат находится в положении р,, остаток лизина способен вступать с ним в контакт. Н1 -12 локализован позади фосфатного остатка, тогда как №5-119 может занимать любое из четырех положений, обозначенных римскими цифрами от I до IV. Точное положение Н15-119 зависит, по-видимому, от того, какая молекула связана с ферментом. [c.80]

Рибонуклеаза (КФ 2.7.7.16) переносит З -фосфат-пиримидин-нук-леотидный остаток из положения 5 соседнего нуклеотида в положение 2 самого пиримидинового нуклеотида с образованием циклического 2, 3 -нуклеотида. В этом случае она выполняет трансферазные функции. Рибонуклеаза поджелудочной железы способна также осуществлять перенос фосфорильной группы положения 2 циклического нуклеотида на воду. В последнем случае суммарная реакция выражается в деполимеризации RNA, и рибонуклеаза действует как эстераза, расщепляющая фосфоуглеродные связи и освобождающая мононуклеотид [18]. В активном центре фермента каталитически активными группами являются два остатка гистидина 12 и 119 [19, 20, 21], расстояние между которыми составляет примерно 10 A [21]. Входящий в состав активного центра остаток лизина участвует в связывании фосфатной группы субстрата. Модели активного центра рибонуклеазы приведены в гл. И1 на рис. 33 и 34. [c.174]

Все эти особенности получают свое объяснение при рассмотрении активного центра рибонуклеазы, схема которого приведена на рис. 59. Видно, что реакционная часть молекулы, включающая остаток фосфорной кислоты и 2 -гидроксигруппу рибозы, располагается вблизи двух имидазольных колец остатков гистидина, Н1з-12 и Н1б-119 (номера показывают положение соответствующих остатков в полипептидной цепи фермента). Поскольку р/ имидазольных колец незначительно отличаются от 7, протонированная и непротонированная формы обоих колец присутствуют в соизмеримых количествах, т.е. в популяции молекул [c.202]

Примером химического строения ферментов может служить рибонуклеаза. Первый ферментный белок, первичная структура которого была определена в 1960—1962 гг.,— рибонуклеаза — фермент, катализирующий расщепление рибонуклеиновой кислоты, В 1969 г. осуществлен его химический синтез. Молекулярная масса кристаллической рибонуклеазы равна 13 683. Поли-пептидиая цепь этого фермента состоит из 124 аминокислотных остатков и четырех дисульфидных мостиков, которые, по-видн-мому, связывают между собой отдельные участки. полипептидной цепи рибонуклеазы и поддерживают третичную структуру белка. Концевыми аминокислотами рибонуклеазы являются лизин и валин. Установлено, что каталитическая активность рибонуклеазы зависит главным образом от наличия В ней двух гистидиновых остатков, а молекула фермента свернута таким образом, что эти два аминокислотных остатка — один в начале, другой в конце полипептидной цепи — оказываются в непосредственной близости один от другого. Если блокировать свободную аминогруппу остатка лизина, то также происходит полная потеря каталитической активности фермента. Это свидетельствует о том, что ферментативные свойства рибонуклеазы, а также других ферментов зависят от структуры определенных участков полипептидной цепи и их взаимодействия, т. е. от структуры активного центра фермента. [c.76]

Ферменты, как правило, работают в определенном диапазоне pH и. чарактери-зуются некоторым оптимальным значением pH, при котором при прочих равных условиях скорость реакции имеет наибольшее значение. Причины такого характера зависимости можно пояснить на примере кинетики гидролиза цитидин-2, 3 -фосфата, катализируемого панкреатической рибонуклеазой. Как следует из рис. 60, изображающего активный центр фермента на второй стадии реакции расщепления РНК, каталитически активной является форма фермента, у которой остаток имидазола, принадлежащий Н1з-12, протонирован и способен подать протон на атом 2 -0 циклофосфааного фрагмента, а остаток имидазола, принадлежащий Н18-119, не протонирован и способен принять протон у атакующей 212 [c.212]

Последовательность аминокислот в ферменте фактически расшифрована [П2—П51. Дальнейшее исследование позволило предположить, что остатки № П9 (гистидин), 121 (аспарагиновая кислота), 15 (аспарагин) и 41 (лизин)—все находятся в активном центре или близко от него [116]. Искусственно вызванная микрогетерогенность рибонуклеазы может быть следствием различий скорее во вторичной и третичной структуре, чем в первичной последовательности аминокислот [117]. [c.380]

При помощи блокирования функциональных групп рибонуклеазы и других методов было установлено, что в этом ферменте только один (в положении 41) из десяти остатков лизина принимает непосредственное участие в ферментативном катализе. Точно так же только один из 4 остатков (в положении 119) гистидина принимает участие в активном центре. Для активности фермента требуется также наличие свободных карбоксильных групп, так как при эстерификации последних фермент инактивируется. Отрезок из 20 остатков аминокислот на КШг-конце пептидной цепи необходим для функции рибонуклеазы, а отрезок пептидной цепи между 31 и 41 остатками отвечает за присоединение субстрата. [c.213]

Рибонуклеаза представляет собой пример фермента с высокими требованиями к структуре активного центра. Должны находиться в соседстве некоторые аминокислоты из различных участков цепи, и вся молекула рибонуклеазы должна иметь присущую ей конформацию. [c.215]

Имеются ли наблюдения, указывающие на существование водородных связей типа -Н в реальных биологических системах Такие водородные связи были обнаружены методом ядерного магнитного резонанса между остатками гистидина в активном центре фермента — панкреатической рибонуклеазе [249]. В дальнейшем ЯМР-методом было показано, что в полу-протонированном гистидине в водном растворе при этих условиях проявляется характерный стэкинг -эффект [250] (стопкообразная упаковка. — Прим. ред.). Последний может быть обусловлен взаимодействием между связями -М. Олдридж и Розе [251] на основании большого числа экспериментальных работ рассматривали водородные связи между имидазольными группами гистидиноБЫх- остатков белков в мембранах митохондрий. [c.304]

Действие панкреатической рибонуклеазы . Рибонуклеаза относится к ферментам, имеющим многофункциональную природу активного центра. Для рибонуклеазы характерно выполнение двух функций гидролазной и трансферазной. Рассмотрим механизм действия панкреатической рибонуклеазы, катализирующей гидролитическое расщепление рибонуклеиновой кислоты, иа примере гидролиза эфира цитидин-З -фосфата. [c.241]

Мур и Стайн установили (1960) первичную структуру рибонуклеазы, содержащей 1876 атомов С, Н, Ы, О и 8, Они открыли также важный принцип, согласно которому функциональные группы аминокислот, формирующие активный центр фермента, обладают аномально высокой реакционной способностью. [c.308]

Например, на рис. 2.12 показан полипептидный скелет бычьей рибонуклеазы А. Химическое исследование белка показывает, что 1,5-дифтор-2,4-динитробензол сшивает остатки лизина 7 и 41. Неожиданная чувствительность белка к модификации иодуксусной кислотой приводит к любопытному заключению гистидины 12 и 119 модифицируются по приншту или-или это можно объяснить тем, что они располагаются в активном центре фермента недалеко друг от друга. Сопоставляя сведения о последовательности и обе группы химических данных, легко видеть, что плоское расположение пептидной цепи исключается. Молекула должна быть уложена в пространстве более сложным образом, и результаты рентгеноструктурного анализа действительно подтверждают это. [c.70]

Для идентификации активных центров ферментов часто используют специфические реагенты, которые взаимодействуют с химическими группами, входящими в состав активного центра, в результате чего происходит полная инактивация фермента или значительное снижение ферментативной активности. В случае рибонуклеазы обнаружено, что иодаце-тат (I H OO ) при определенных условиях реагирует с ферментом в соотношении 1 1 (см. restfield et al., 1963). Из реакционной смеси были выделены два продукта реакции. Основной продукт представляет собой 1-карбоксиметилгистидин-119 (1- M-His" ), второй — З-карбоксиметилгистидин-12 (3- M-His ). Эти продукты имеют следующую [c.73]

Уделив внимание некоторым механизмам гидролиза, интересно сравнить их с механизмом реакции, происходящей в активном центре некоторых ферментов, катализирующих подобные превращения. Фермент бычья панкреатическая рибонуклеаза А (РНаза А) (М = 13 680, одна полипептидная цепь, состоящая из 124 аминокислотных остатков) катализирует деградацию РНК по двустадийному механизму [c.126]

При образовании 1- M-His фермент полностью теряет активность, тогда как при образовании второго аддукта модифицированный фермент сохраняет 15% исходной активности. На основании этих данных было сделано предположение, что в состав активного центра рибонуклеазы входят два остатка гистидина. Это предположение подтверждается экспериментами, в которых показано, что небольшие молекулы, например цитидин-3 -фосфат, связывающиеся в активном центре фермента, ингибируют процесс алкилирова-ния. Кроме того, при алкилировании не получено формы рибонуклеазы, в которой были бы модифицированы оба остатка гистидина. Это, вероятно, объясняется тем, что два остатка гистидина, расположенные далеко друг от друга в аминокислотной последовательности, в нативной структуре фермента пространственно близки. И наконец, вполне вероятно, что один или оба остатка гистидина, модифицированные иодацетатом, и некоторые ионизируемые группы, предполагаемые на основании рассмотренных выше кинетических исследований, идентичны. [c.74]

Исследования химическими и родственными им методами дают довольно хорошее представление о природе активного центра фермента. Наглядное представление о трехмерной структуре молекулы фермента и его активном центре дали рентгенокристаллографические исследования, которые выполнили Ричардс, УайкоФ. Карта, Белло и до. На рис. 16.14 представлена структура рибонуклеазы 8. Молекула фермента напоминает по форме почку и имеет размеры 38 х 28 х 28 А. С одной стороны молекулы имеется четко выражен- [c.78]

Сказанное можно пояснить на примере фермента, активный центр и механизм действия которого достаточно хорошо изучены и который будет ниже детально рассматриваться, — панкреатической рибонуклеазы. Этот фермент катализирует двустаДийный гидролиз фосфодиэфирных связей в РИК, сходный в общих чертах со щелочным гидролизом этих связей. На первой стадии происходит внутримолекулярная атака атома Р на 2 -011-группу примыкающего со стороиы 3 -кислородного атома остатка рибозы с образованием циклического 2, 3 -<1)осфата и разрывом межнуклеотидноП связи. Во второй стадии происходит гидролиз пятичленного фосфодиэфирного цикла. На примере одного из простейших субстратов рибонуклеазы — уридили.п(3 — 5 )аденозина — процесс можно записать в виде [c.200]

Методы белкового синтеза развиты в настоящее время в такой степени, что ферменты, молекулы которых имеют небольшие размеры, могут быть синтезированы в лабораторных условиях. Это дает возможность создавать новые модифицированные ферменты и критически анализировать роль различных групп активного центра. Так, например, установлено, что построенный из 70 аминокислотных остатков синтетический пептид, аналогичный рибонуклеазе 5, но несущий ряд делеций и, совершенно не содержащий дисульфидных связей, все же сохраняет заметную каталитинескую активность [61]. [c.121]

После образования фрагментов ДНК рибонуклеозидные участки удаляются при помощи специфичной рибонуклеазы или РНК-азы Н. Кроме того, в деградации праймеров принимает участие ДНК-полимераза I, обладающая как полимеразной, так и нуклеазной активностью. Этот фермент имеет два функционально значимых центра. В то время как нуклеазный центр катализирует деградацию праймера, полимеразный центр заделывает образовавшиеся бреши, достраивая дезоксирибонуклеозид-фосфатные участки. [c.452]

После успешной расшифровки строения рибонуклеазы К. Хнр-сом, У. Штейном и С. Муром [76] и Р. Редфилдом и К. Анфин-сеном [77] в 1956 г. впервые появилась возможность создания полной модели фермента, активные центры которого образованы фрагментами нолипептидной цепи. [c.177]

За последние годы достигнуты определенные успехи в изучении молекулярного механизма действия ферментов, участвующих в переносе фосфорильной группы. Так, в результате исследования строения активного центра рибонуклеазы поджелудочной железы быка было показано, что в состав активного центра этого фермента входят две имидазольные группы, одна из к-рых находится в виде основания, а другая — протонирована. Предполагается, что первое имидазольное кольцо участвует в образованш водородной связи с молекулой воды или оксигруииой спирта, в то время как вторая имидазольная группа, находящаяся в протонированном состоянии, образует водородную связь с эфирным кислородом. [c.254]

Полученные результаты позволили сделать определенные выводы о трех группировках активного центра, значения р/С для которых составляли 5, 6 и 6, 7. На основании зависимости этих величин от температуры был сделан вывод, что наименьшее значение р/С относится к карбоксильной группе (слабая температурная зависимость), а наибольшее — к имидазольной группировке (сильная температурная зависимость). Природа группировки с промежуточным значением р/С, равным 6, оставалась (и остается до сих пор) неясной. Сама величина р/С 6 может быть отнесена к имидазолу, но вместе с тем она не зависит от температуры, что характерно для карбоксила. Авторы предполагают, что это имидазол с аномальной величиной АН ионизации, однако признают, что для окончательного доказательства этого предположения, нужны дополнительные данные. В этой работе были установлены детали механизма действия рибонуклеазы, в том числе обнаружены реакции изомеризации свободного фермента и комплекса фермент—продукт. Тшатель-ность кинетического анализа, проведенного в этой работе, позволяет отнестись с доверием к предложенному авторами химическому механизму действия рибонуклеазы, хотя не вполне ясно, действительно ли все обнаруженные реакции изомеризации входят в последовательность каталитических реакций. [c.218]

Рибонуклеаза и папаин являются примерами простых ферментов, построенных исключительно из аминокислот в виде единой пептидной цепи. Однако большинство ферментов имеет простетические группы или показывает зависимость активности от наличия ионов металлов. По-видимому про-стетнческая группа в форме кофермента или металла или обоих вместе принимает участие в образовании активного центра. Выяснение структуры активного центра сложных ферментов представляет собой нелегкую задачу, и мы рассмотрим пример строения активного центра алкогольдеги-дрогеназы из дрожжей. [c.215]

Имидазольная группировка входит в активные центры таких ферментов, как холинэстераза, рибонуклеаза, трипсин, хи-мотрипсин и др. Особенной способностью к присоединениям обладает атом N3 имидазольной группировки, что приводит к ее ацилированию и фосфорилированию с образованием неустойчивых Ы-ацил- и Ы-фосфорилпроизводных в качестве промежуточных веществ при ферментативных превращениях. Однако несомненно, что строение активного центра в целом непосредственно связано с вторичной и третичной структурой бел- [c.217]

В результате исследования 1370—3731 строения активного центра рибонуклеазы (РНК-азы) поджелудочной железы быка было показано, что в состав активного центра этого фермента входят две имидазольные группы, одна из которых протонирована, а другая находится в виде основания. Авторы предположили следующую схему строения и механизма действия активного центра РНК-азы [374, 375]. На рис. 26, А (стр. 578) показано строение фермент-суб-стратного комплекса. Одно имидазольное кольцо (I) участвует в образовании водородной связи с молекулой воды или с оксигруп-пой замещенного спирта (общеосновной катализ). Другое имидазольное кольцо (И), находящееся в протонированном состоянии, образует водородную связь с эфирным кислородом. Участок (П1) соответствует области дополнительных связей между ферментом и молекулой нуклеофильного реагента. Специфичной является область (IV), где происходит взаимодействие между ферментом и пиримидиновым кольцом, по-видимому, с участием атома азота [376]. Таким образом, в переходном состоянии (см. рис. 26, Б), по-существу, имеет место пуш-пульный механизм, когда нуклеофильная атака на атом фосфюра кислородом активированной оксигруппы нуклеофильного реагента сопряжена с образованием водородной связи между кислородом отходящей группировки и кислотной группой фермента. На рис. 26, В показан комплекс фермент продукты. Если подходящим нуклеофильным реагентом является оксигруппа рибозы полинуклеотидной цепи РНК, то в результате реакции происходит удлинение цепи на одно звено (см. рис. 26 Г,). [c.577]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология