Карбоксипептидаза для ферментативного анализа

Наиболее успешным методом определения С-концевых остатков является не химический метод, а ферментативный. Селективное удаление С-концевого звена осуществляется при помощи фермента карбоксипептидазы (из поджелудочной железы), которая расщепляет лишь ту пептидную связь,которая расположена в а-положении к свободной а-карбоксильной группе в полипептид-ной цепи. Анализ можно повторить на укороченном пептиде с тем, чтобы идентифицировать новый С-концевой остаток и т. д. [c.1049]

Хорошие результаты удается также получить при использовании масс-спектрометрии с ионизацией полевой десорбцией или бомбардировкой ускоренными атомами для анализа С-концевой последовательности пептидов в сочетании с ферментативным гидролизом с помощью карбоксипептидаз. [c.74]

Рассмотренный материал об аспартатных протеиназах, как и подобный материал о химотрипсине, трипсине, карбоксипептидазе и лизоциме, изложенный ранее [400], дает основание заключить, что появление уникальной количественной информации о пространственном строении ферментов и их комплексов не привело к концептуальному развитию энзимологии и переосмыслению сложившихся представлений о природе биокатализа. Ставшие доступными рентгеноструктурные данные не вызвали принципиальных изменений в понимании явления ферментативного катализа и не нашли строгого объяснения в рамках сформулированных в 1950-е годы концепций, равно как и наоборот — последние не получили на основе новых структурных данных своей объективной трактовки. Данные рентгеноструктурного анализа о трехмерных структурах ферментов не изменили направленность исследований каталитических реакций "от функции к структуре", которой энзимология следует с момента своего становления, т.е. более 150 лет. [c.105]

Ферментативный гидролиз можно проводить различными способами, один из которых состоит в следующем в пластмассовой пластинке толщиной 10—15 мм, длиной 10 см и шириной 5 см высверливается 2 ряда углублений. Объем всех, кроме одного, углублений должен быть примерно 50 мкл, а объем крайнего верхнего — в 3 раза больше. Это углубление выполняет роль реакционного сосуда обозначим его через Р, а все остальные цифрами 1, 2, 3...п. Исследуемый пептид (около 0,05 мкмоль) в 0,1 М бикарбонате аммония вносят пипеткой в углубление Р. Во все остальные углубления наливают по 10 мкл 1 н. НС1. После этого в углубление Р добавляют соответствующий фермент (например, карбоксипептидазу А, кар-боксипептидазу В или их смесь, а в случае N-концевого анализа — амино пептидазу). Количество фермента составляет часть количества пептида. Сразу после добавления фермента 10 мкл смеси из реакционного сосуда переносят в углубление 1, где уже находится НС1. [c.257]

Этим функции белка как фермента или апофермента скорее всего не исчерпываются. Все рассмотренные ме-чанизмы предполагали достаточно статичное расположение функциональных групп белка в активном центре Это не совсем верно. Взаимодействие с субстратом нередко сопровождается изменением конформации белковой молекулы, и согласно теории, выдвинутой Кошландом, направленные конформационные изменения белка являются важным фак1чэром ферментативного превращения. В отдельных случаях такие изменения зарегистрированы с помощью рентгеноструктурного анализа. Например, карбоксипептидаза А была подвергнута рентгеноструктурному анализу как в отсутствие субстрата, так и в комплексе с глицил-1/-тирозином. Полость, в которой находится активный центр, существенно сужается при связывании этого субстрата, т.е, наблюдается отчет ливый конформационный переход. Кроме того, широко дискутируется и имеет в отдельных случаях убедительные подтверждения гипотеза, согласно которой фермент фиксирует субстрат в конс юрмации, существенно более близкой по своей геометрии к активированному комплексу реакции, чем конформация субстрата, преобладающая у несвязанных молекул. Это, естественно, должно приводить к снижению активационьюго барьера реакции и способствовать существенному ускорению превращения. [c.208]

Взаимодействию фермента с субстратом предшествует сближение и ориентация субстрата по отношению к активному центру фермента. Затем образуются фермент-субстратные комплексы, реальное существование которых может быть зафиксировано различными способами. Наиболее наглядным и эффективным является метод рентгеноструктурного анализа. В качестве примера можно привести идентификацию фермент-субстратного комплекса карбоксипептидазы А и ее субстрата глицил-ь-тирозина. Метод дает возможность не только установить сам факт образования комплекса, но и определить типы связей. Более простым, но достаточно эффективным методом является спектральный анализ фермента и соответствующего фермент-субстратного комплекса. Таким образом, бьши, в частности, идентифицированы фермент-суб-стратные комплексы для ряда флавиновых ферментов. В последние годы широкое распространение получило применение синтетических субстратов, благодаря которым можно моделировать ряд стадий ферментативного процесса, в том числе и связанных с образованием фермент-субстратного комплекса. [c.69]

В гл. IV мы показали на двух примерах (см. стр. 148), что с помощью сефадекса G-25 можно определить число центров связывания в молекуле фермента, или сродство ферментов к различным реагентам, а также изучить влияние кофакторов на фермент (см. стр. 142). Аналогичным образом, измеряя способность к связыванию восстановленного ДПН, удалось найти эквивалентный вес семи дегидрогеназ (30 000— 40000) [20]. Иногда образуются стабильные комплексы фермента с реагентом, как, например, при действии свободной от цинка карбоксипептидазы на пептидный субстрат [21]. Этот комплекс, который с помощью гель-хроматографии можно отделить от избытка субстрата, уже не активируется ионами цинка. Очистка гель-фильтрацией на сефадексе G-50 является стандартным приемом при определении металла в карбоксипепти-дазе [22]. Лизоцим образует нерастворимый комплекс с продуктом, получающимся при действии этого фермента на- определенный гликопептид. Растворение этого комплекса (в растворе Na l) и последующий анализ с помощью гель-хроматографии на сефадексе (j-75, а затем на G-25 дает информацию о кинетике ферментативной реакции [23]. При добавлении цито-хромоксидазы к избытку цитохрома с и последующем разделении на сефадексе G-200 в некоторых случаях получают высокомолекулярную фракцию, содержащую эквимолярные количества обоих ферментов эта фракция есть по сути не что иное, как часть дыхательной цепи [24]. В некоторые ферменты цикла лимонной кислоты, для которых кофактором служит биотин, удалось ввести метку (С Ог) в результате реакции с соответствующими субстратами с последующей очисткой на сефадексе G-50 это дало возможность после деградации под действием проназы [c.214]

При этом анализу подвергают отщепляющуюся аминокислоту или непосредственно ее фенилтиогидантоин. Указанный принцип положен в основу работы секвенсоров, автоматически определяюш их аминокислотную последовательность в пептидных фрагментах, получаемых ферментативным расщеплением исследуемых белков. По Сэнджеру концевую аминогруппу П. маркируют 1-фтор-2,4-динитробензолом, подвергают П. гидролизу и определяют динитрофенильные производные аминокислот. С-Концевую аминокислоту можно отщепить с помощью карбоксипептидазы. Используют также полный гидразиполиз пептида. При этом все аминокислоты, кроме С-концевой, выделяются в виде гидразидов. Применяют также масс-спектрометрич. определение аминокислотной последовательности в П. Сведения об оптич. чистоте П. могут быть получены исследованием их атакуемости природными ферментами. [c.15]

Карбоксипептидазы А и В образуются при гидролизе трипсином соответствующих прокарбоксипептидазных предшественников, синтезируемых в поджелудочной железе [187J. Из этих двух ферментов более подробно изучена карбоксипептидаза А, и проведено ее детальное исследование методом рентгеноструктурного анализа [29, 188, 189]. Карбоксипептидаза А быка (КПА) представляет собой фермент, содержащий 307 аминокислот в единственной полипептидной цепи, которая прочно связывает 1 г-ион Zn(II) на 1 моль фермента. Необходимость Zn(ll) для ферментативной активности была впервые продемонстрирована тем, что КПА, свободная от иона металла, неактивна, но активность восстанавливается при добавлении Zn(II) [190, 191]. По-видимому, фермент, не содержащий металла, в основном сохраняет структурные свойства активной КПА [191]. Позже на основе данных рентгеноструктурного анализа [29] было четко установлено, что роль иона Zn(ll) при гидролизе пептидов заключается в связывании субстрата. При протеолизе фермент проявляет стереохимическую специфичность, отщепляя С-конце-вую аминокислоту от пептидной цепи только в том случае, если С-концевая карбоксильная группа свободна и если аминокислота имеет L-конфигурацию [192, 193]. Обычно наблюдается более высокая активность, если остаток С-концевой аминокислоты содержит ароматическую группу или разветвленную цепь [194]. [c.76]

Корреляция относительного ряда пептидазной активности со структурой комплекса и электронной конфигурацией иона металла позволяет дать разумное описание электронных перестроек молекулы субстрата, которое совпадает с механизмом ферментативного действия, сформулированным на основе рентгеноструктурного анализа. Этот механизм не дает объяснения, почему в нативном белке находится ион 2п(П), а не более активный Со(И), и не дает исчерпывающего ответа на вопрос о природе каталитического действия карбоксипептидазы. Вероятно, однако, что механизм, постулированный Липскомбом и сотрудниками, правильно отражает природу центров связывания субстрата, включающих ион металла. Корреляция относительного ряда пептидазной активности с рядом прочности связи металл—лиганд [(3.7) и (3.8) ] может, следовательно, указывать на важную роль электронной структуры и геометрии координации катиона металла в протеолитическом действии металлокарбоксипептидаз. [c.97]

Теперь задача сведена к исследованию поочередно всех пептидов ферментативного гидролизата. Для этого сначала делаем аминокислотный анализ фрагментов, а затем пускаем в ход метод концевых групп Сэнгера или Эдмана. Короткие пептиды (до пентапентидов) расшифровываются сравнительно легко. Метод концевых групп может быть применен многократно и последовательно, т. е. после гидролитического отш епления меченного реагентом конца, можно действовать снова и метить следуюгцее звено с N-кoнцa пептидной цепочки. Можно также использовать карбоксипептидазу для отш епления С-конца. Комбинация этих методов позволяет однозначно расшифровать короткие пептиды за сравнительно небольшой срок. [c.27]

В последнее время появилась возможность изучать физические свойства белков такими методами, как температурный скачок, которые позволяют исследовать процессы с временами, соизмеримыми с временами каталитического превращения субстрата на ферменте, так что стало возможным непосредственно установить взаимосвязь между скоростями субстратзависи-мых конформационных изменений и скоростями самой реакции. В настоящее время имеется ун е несколько свидетельств в пользу существования изомеризации ферментов и ферментсубстратных комплексов, которые могут представлять собой конформационные изменения такого рода [49—52]. Скорость мономолекулярной изомеризации глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы характеризуется константой порядка 1 с и является слишком медленной, чтобы этот процесс имел место при каждом обороте фермента по-видимому, этот процесс относится к явлениям контроля ферментативной активности. Рентгеноструктурный анализ лизоцима [28], химотрипсина [54] и карбоксипептидазы [55] дал прямое доказательство существования изменений в конформации фермента при взаимодействии с субстратами или ингибиторами. Гемоглобин, хотя и не является ферментом, но может быть поучительным примером использования всех этих методов для демонстрации конформационных изменений при взаимодействии этого белка с кислородом [56]. [c.243]

Влияние pH на скорость ферментативных реакций может быть обусловлено различными факторами. Ферменты, подобно другим белкам, являются амфолитами и имеют большое число ионоген-ных групп. Если функционирование фермента зависит от наличия некоторых специфических группировок, то каждая из них в дан-ных условиях должна находиться в определенном состоянии (не-ионизированном или ионизированном). Нередко оказывается возможным идентифицировать участвующие в катализе ионогенные группы активного центра путем анализа зависимости активности фермента от pH и сопоставления полученных данных с известными величинами р/С ионогенных групп белков (табл. 5.2). В качестве примеров можно указать на идентификацию каталитически активных остатков гистидина в активных центрах трипсина, химотрипсина и субтилпзина и тиоловой группы в активном центре папаина (гл. 9). На участие ионогенных групп в функционировании ферментов указывает также влияние ионной силы на скорость ряда ферментативных реакций (это влияние сильно выражено при действии карбоксипептидазы и уреазы). Такого рода эффект обычно наблюдается при неферментативном катализе, осуществляемом ионогенными соединениями. [c.260]

Предполагаемся, что многие ферменты в отсутствие субстратов находятся в неактивном состоянии и что функциональные группы их активных центров не ориентированы в пространстве надлежащим образом для взаимодействия с комплементарными группами субстрата. Однако при связывании специфического субстрата происходит такое конформационное изменение фермента и, следовательно, его активного центра, в результате которого соответствующие К-группы центра занимают необходимое для взаимодействия с субстратом положение это обеспечивает осуществ- ление каталитического процесса. Такие индуцированные субстратом конформационные изменения называют индуцированным со--ответствием его иллюстрирует схема, приведенная на рис. 8.8. Убедительные данные, свидетельствующие о конформационных изменениях щ)и связывании субстрата, основаны главным образом иа сравнении структур фермента, полученных методом рентгеноструктурного анализа, в присутствии и в отсутствие ингибиторов. В качестве примера можно указать на соответствующие данные для карбоксипептидазы (разд. 9.3.4) и лизоцима (разд. 9.3.3). Кроме того, ряд свойств ферментов, находящихся в растворенном состоянии, указывает на различие их конформации в присутствии и в отсутствие субстратов. Например, некоторые ферменты в присутствии субстратов утрачивают способность взаимодействовать со специфическими антителами многие ферменты в присутствии специфических субстратов оказываются более стабильными в отношении тепловой денатурации, у них изменяются показатели оптического вращения, они перестают диссоциировать на субъедини-ды у некоторых ферментов изменяются седиментационные характеристики. Принято считать, что в результате индуцированного со- ответствия может увеличиваться скорость некоторых ферментативных реакций однако обусловленное этим механизмом увеличение скорости, вероятно, относительно невелико по сравнению с соответствующими эффектами, обусловленными другими механизмами. [c.288]

Традиционный подход к анализу процессов ферментативного катализа, сформировавшийся на основании химических исследований задолго до определения кристаллической структуры ферментов, основывается на следуюш,их факторах общий кислотно-основный катализ катализ ионами металлов нуклеофильный катализ электростатический катализ эффекты подобия (сочетание внутримолекулярной реакции и правильной ориентации) напряжение (деформация субстрата) индуцированное соответствие (деформация фермента). Наличие всех этих факторов в настоящее время в той или иной степени установлено. Наиболее распространен общий кислотно-основный катализ [реакции, катализируемые дегидрогеназами, сериновыми протеазами (а также, по-видимому, тиоловыми протеазами и карбок-сипептидазами), рибонуклеазами, лизоцимом]. Ускорение реакций ионами металлов в его классической форме стабилизации аниона имеет место при функционировании карбоксипептидазы [c.413]