Карбоксипептидаза, анализ

Наиболее успешным методом определения С-концевых остатков является не химический метод, а ферментативный. Селективное удаление С-концевого звена осуществляется при помощи фермента карбоксипептидазы (из поджелудочной железы), которая расщепляет лишь ту пептидную связь,которая расположена в а-положении к свободной а-карбоксильной группе в полипептид-ной цепи. Анализ можно повторить на укороченном пептиде с тем, чтобы идентифицировать новый С-концевой остаток и т. д. [c.1049]

Определение С-концевых остатков в пептидах и белках разработано менее удовлетворительно, нежели определение iV-концевых. Предлагались многочисленные химические методы, но ни один из них не выдержал проверку временем. К счастью, с помощью двух панкреатических ферментов — карбоксипептидазы А и карбокси-пептидазы-В — можно получить некоторую информацию о С-кон-цевой последовательности. Карбоксипептидаза А преимущественно отщепляет аминокислоты с ароматическими боковыми группами, а большинство остальных аминокислот отщепляет гораздо медленнее. С-концевой Pro устойчив. Этот фермент хорош при идентификации С-концевых последовательностей у пептидов, образующихся в результате расщепления с помощью а-химотрипсина (см. разд. 23.3.6), так как такие пептиды на С-конце имеют ароматические аминокислоты. При обработке пептида или белка карбокси-пептидазой А возникают те же трудности, что и при использовании аминопептидаз для анализа iV-концевых последовательностей (см. разд. 23.3.4.1). Карбоксипептидаза В гораздо более специфич- [c.272]

Ход реакции гидролиза, катализируемого карбоксипептидазой, в большой степени зависит от свойств субстрата. Нативность белков может препятствовать гидролизу, поэтому при получении отрицательных результатов следует повторить анализ на денатурированном субстрате. i [c.292]

Хорошие результаты удается также получить при использовании масс-спектрометрии с ионизацией полевой десорбцией или бомбардировкой ускоренными атомами для анализа С-концевой последовательности пептидов в сочетании с ферментативным гидролизом с помощью карбоксипептидаз. [c.74]

С-Концевой анализ можно провести с помощью фермента карбоксипептидазы, который специфически отщепляет С-конце-вой остаток от белка. Эту аминокислоту затем можно идентифицировать. Далее процесс повторяют на оставшемся белке и определяют следующий остаток и т. д. до определения всей последовательности. [c.268]

Лизоцим был третьим по счету белком и первым ферментом, структура которого была установлена методом рентгеноструктурного анализа при высоком разрешении. В настоящее время аналогичным образов охарактеризованы структуры многих других ферментов, в том числе рибонуклеазы, карбоксипептидазы, папаи-на, химотрипсина и субтилизина. Лизоцим, однако, по-прежнему остается самым ярким примером применения рентгенографии для объяснения характера действия ферментов. [c.258]

Поскольку на пролин карбоксипептидаза не действует, после отщепления остатков треонина и аланина от нативного белка ВТМ действие фермента прекращается. В нитритных же мутантах действие карбоксипептидазы продолжается и после отщепления второго остатка, так как за ним следует лейцин. Таким путем было установлено, что под действием азотистой кислоты появляются мутанты, у которых произведена замена трех аминокислот из 158, в том числе замена пролина (третьего остатка от С-конца). Эта замена, вероятно, происходит в результате превращения цитозина в урацил на каком-то из участков цепи РНК, содержащей 6000 оснований. Анализ показал, что изменение даже одного основания может привести к мутации. [c.365]

В отличие от карбоксипептидазы большая часть природных белков не содержит ионов металла в активном центре. Ионы металлов часто образуют с белками обратимые комплексы. Бычий сывороточный альбумин (БСА) связывает до 20 ионов переходных металлов на молекулу. В соответствии с данными фиг. 78 можно ожидать, что при физиологических pH происходит связывание с имидазолом или карбоксильными группами, расположенными благоприятно для образования комплексов, что, по-видимому, и имеет место в данном случае. Однако из фиг. 78 следует также, что единственная сульфгидрильная группа в БСА должна быть местом преимущественного связывания металла. Так, каждый третий ион меди, приходящийся на молекулу БСА, по-видимому, связывается с сульфгидрильной группой. На высокую специфичность связывания с ионами металлов указывает также возможность получения для целей рентгеноструктурного-анализа производных гемоглобина и миоглобина, содержащих тяжелые атомы. [c.414]

По вопросу о связи между строением инсулина и его биологической активностью, а таклсе о значении отдельных частей молекулы инсулина для проявления активности имеются довольно обширные сведения. Так, отщепление С-концевого остатка цепи В бычьего инсулина (аланин), которое может быть осуществлено мягкой обработкой карбоксипептидазой [951, 1614] или трипсином [951], не сопровождается потерей гормональной активности. Напротив, отщепление С-концевого остатка цепи А (аспарагин) приводит к резкому снижению активности [951, 1614]. Дез-(Азр 21, А1а > )-инсулин был очищен с помощью противоточного распределения и охарактеризован аминокислотным анализом. Активность этого соединения в судорожном тесте на мышах составляла 5% (1,1—1,2 М. Е./жг) активности природного инсулина [2139]. [c.471]

Существование комплексов с мостиковым металлом также продемонстрировано с помощью рентгеноструктурного анализа (карбоксипептидаза) [23] (гл. 15) и инфракрасной спектроскопии (карбоангидраза) [24] (гл. 16). Однако данные, доказывающие существование мостиковых комплексов, полученные с помощью этих методов, не позволяют установить, участвуют ли такие комплексы в катализе. Выяснить это можно сравнением кинетических и термодинамических свойств мостикового комплекса с аналогичными параметрами, полученными при изучении самих процессов катализа. В связи с этим метод ЯМР имеет существенные преимущества перед другими методами (разд. 2.3). Однако важность этого критерия не может быть преувеличена, поскольку в одном случае был обнаружен комплекс с мостиковым металлом, не принимающий участия в катализе [25]. [c.446]

Наконец, схема координации при взаимодействии ферментов с ионами металлов и лигандами может быть изучена с помощью рентгеноструктурного анализа, хотя до сих пор этим методом была исследована детально только карбоксипептидаза [23]. Однако наряду с достоинствами этот метод обладает и рядом недостатков. Во-первых, рентгеноструктурный анализ можно применять для [c.450]

Атомные модели карбоксипептидазы А получены совмещением последовательности 307 остатков с картой электронной плотности при номинальном разрешении 2 А [1—3]. Фазы отраженных рентгеновских лучей были определены методом изоморфного замещения с помощью четырех производных тяжелых атомов при разрешении 2,8 А и двух производных с разрешением, промежуточным между 2,0 и 2,8 А. В двух ртутных производных ртуть замещала цинк в активном центре (табл. 15.1). При совмещении полипептидной цепи с картой электронной плотности не возникло чрезмерных трудностей, хотя для некоторых остатков, например 133—137, электронная плотность была существенно меньше, чем в среднем по цепи. Оказалось, что остатки 138 и 161 соединены дисульфид-ным мостиком [1]. Как и ожидалось, наибольшая электронная плотность соответствовала иону цинка. При анализе карты электронной плотности было обнаружено, что цинк имеет три лиганда, соответствующие остаткам 69, 72 и 196. Остатки 69 и 72 были правильно идентифицированы как His и Glx [1]. Отождествление остатка 196 с Lys или Glx оказалось ошибочным [22]. [c.508]

Фермент-субстратные комплексы идентифицируют и выделяют в чистом виде различными физико-химическими методами, что служит прямым доказательством их существования. Например, подробная информация о связывании карбоксипептидазы А с ее субстратом глицил-Е-ти-розином была получена с помощью рентгеноструктурного анализа. Для этих целей широко используется метод электронной микроскопии. Как [c.100]

Именно этим можно объяснить, например, то, что при анализе кинетических данных для реакций гидролиза гиппурилфенилглицина и брома-цeтил-DL-фeниллaктaтa, катализируемых карбоксипептидазой, авторы [24] получили отрицательные значения и К т(каж)- Это видно из данных, приведенных на рис. 102, если анализировать их с помощью уравнения (6.135). [c.252]

Рис. 102. Анализ кинетических данных гидролиза бромацетил-Ь, 1-фениляактата, катализируемому карбоксипептидазой [24], с помощью интегральной формы уравнения скорости (6.135)

А (Б. Меррифилд, 1969). Дальнейшее развитие получили аналит. методы стал широко использоваться автоматич. аминокислотный анализатор, созданный С. Муром и У. Стайном в 1958, существенно модифицированы хроматографич. методы, до высокой степени совершенства доведен рентгеноструктурный анализ, сконструирован автоматич. прибор для определения последовательности аминокислотных остатков в Б.-секвенатор (П. Эдман, Г. Бэгг, 1967) Благодаря созданию прочной методнч. базы стало возможным проводить широкие исследования аминокислотной последовательности Б. В эти годы была определена структура неск. сотен сравнительно небольших Б. (до 300 аминокислотных остатков в одной цепиХ полученных из самых разл. источников как животного, так и растит., бактериального, вирусного и др. происхождения. Среди них — протеолитич. ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилн-зин, карбоксипептидазы), миоглобины, гемоглобины, цитохромы, лизоцимы, иммуноглобулины, гистоны, нейротоксины, Б. оболочек вирусов, белково-пептидные гормоны и др. В результате были созданы предпосылки для решения актуальных проблем энзимологии, иммунологии, эндокринологии и др. областей физ.-хим. биологии. [c.248]

Карбоксипептидаза — это металлофермент, содержащий один атом цинка на молекулу белка. Карбоксипептидаза катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи в белках и олигопептидах и сложных эфиров а-оксикислот. Кинетический изотопный эффект растворителя равен 2 при гидролизе сложноэфирного субстрата О-(гранс-циннамоил)-ь-р-фениллактата и всего лишь 1,33+0,15 при гидролизе пептида Ы-(N-бeнзoилглицил)-L-фенилаланината [11]. По данным рентгеноструктурного анализа карбоксипептидаза представляет собой глобулярный белок, в котором содержится один атом цинка, координированный двумя остатками гистидина. Кроме того, в состав активного центра входят карбоксильная (01и-270), фенольная (Туг-248) и гуанидиновая (Aгg-145) группы. Последняя образует ионную [c.149]

В работе [153] проведен анализ структуры лизоцима, химо-трипсина, миоглобина, эластазы, рибонуклеазы, папаина и карбоксипептидазы. Указанные положения в целом подтвердились. Так, в лизоциме определено 17 поворотов цепи, причем в них входят практически все остатки Гли. Установлено, что наличие Гли является достаточным, но не необходимым условием резкого поворота. В семи поворотах из 16 в участках максимальной кривизны находятся Сер, Асп, Арг, Три. Эти же остатки соседствуют с поворотными остатками Гли. Аналогичные закономерности установлены для химотрипсина, эластазы, рйЬонуклеа-зы, папаина. Из 19 остатков Гли а-химотрипсина 17 располагаются в поворотных участках, в эластазе из 25 Гли 23 находятся в поворотах. Наряду с названными остатками в поворотах участвуют еще Тре, Асн, Лиз, Глн. Включение наряду с Гли одного из этих остатков, по-видимому, существенно для анализа поворотов. Для поворотов весьма важно также наличие водородных связей между боковым радикалом и основной цепью (Сер). [c.252]

Ферментативный гидролиз можно проводить различными способами, один из которых состоит в следующем в пластмассовой пластинке толщиной 10—15 мм, длиной 10 см и шириной 5 см высверливается 2 ряда углублений. Объем всех, кроме одного, углублений должен быть примерно 50 мкл, а объем крайнего верхнего — в 3 раза больше. Это углубление выполняет роль реакционного сосуда обозначим его через Р, а все остальные цифрами 1, 2, 3...п. Исследуемый пептид (около 0,05 мкмоль) в 0,1 М бикарбонате аммония вносят пипеткой в углубление Р. Во все остальные углубления наливают по 10 мкл 1 н. НС1. После этого в углубление Р добавляют соответствующий фермент (например, карбоксипептидазу А, кар-боксипептидазу В или их смесь, а в случае N-концевого анализа — амино пептидазу). Количество фермента составляет часть количества пептида. Сразу после добавления фермента 10 мкл смеси из реакционного сосуда переносят в углубление 1, где уже находится НС1. [c.257]

Этим функции белка как фермента или апофермента скорее всего не исчерпываются. Все рассмотренные ме-чанизмы предполагали достаточно статичное расположение функциональных групп белка в активном центре Это не совсем верно. Взаимодействие с субстратом нередко сопровождается изменением конформации белковой молекулы, и согласно теории, выдвинутой Кошландом, направленные конформационные изменения белка являются важным фак1чэром ферментативного превращения. В отдельных случаях такие изменения зарегистрированы с помощью рентгеноструктурного анализа. Например, карбоксипептидаза А была подвергнута рентгеноструктурному анализу как в отсутствие субстрата, так и в комплексе с глицил-1/-тирозином. Полость, в которой находится активный центр, существенно сужается при связывании этого субстрата, т.е, наблюдается отчет ливый конформационный переход. Кроме того, широко дискутируется и имеет в отдельных случаях убедительные подтверждения гипотеза, согласно которой фермент фиксирует субстрат в конс юрмации, существенно более близкой по своей геометрии к активированному комплексу реакции, чем конформация субстрата, преобладающая у несвязанных молекул. Это, естественно, должно приводить к снижению активационьюго барьера реакции и способствовать существенному ускорению превращения. [c.208]

Такие направленные изменения в белках (белковая инженерия) стали важным инструментом для установления роли отдельных аминокислотных остатков в формировании пространственной структуры белка и выполнении им своих функций. В качестве примера можно привести результаты исследования роли остатка тирозина-248, входящего в активный центр карбоксипептидазы А (см. 6.1). После установления пространственной структуры этого фермента с помощью рентгеноструктурного анализа высказывалась точка зрения, что гидроксигруппа этого остатка принимает участие в подаче протона на атом азота гидролизуемой пептидной связи и одновременно в удалении протона от молекулы атакующей воды. Однако, когда методом сайт-специфичного мутагенеза была осуществлена замена этого остатка тирозина на фенилаланин, оказалось, что каталитичесюш свойства фермента практически не изменились. Таким образом, роль гидроксигруппы тирозина-248 в катализе не подтвердилась. [c.306]

Взаимодействию фермента с субстратом предшествует сближение и ориентация субстрата по отношению к активному центру фермента. Затем образуются фермент-субстратные комплексы, реальное существование которых может быть зафиксировано различными способами. Наиболее наглядным и эффективным является метод рентгеноструктурного анализа. В качестве примера можно привести идентификацию фермент-субстратного комплекса карбоксипептидазы А и ее субстрата глицил-ь-тирозина. Метод дает возможность не только установить сам факт образования комплекса, но и определить типы связей. Более простым, но достаточно эффективным методом является спектральный анализ фермента и соответствующего фермент-субстратного комплекса. Таким образом, бьши, в частности, идентифицированы фермент-суб-стратные комплексы для ряда флавиновых ферментов. В последние годы широкое распространение получило применение синтетических субстратов, благодаря которым можно моделировать ряд стадий ферментативного процесса, в том числе и связанных с образованием фермент-субстратного комплекса. [c.69]

Для установления точной последовательности аминокислот четыре больших пептидных фрагмента, полученных из окисленной рибонуклеазы при гидролизе ее трипсином, подвергались гидролизу с химотрипсином [78]. Миллиграммовые количества были выделены и освобождены от солей для уменьшения потерь при последующем анализе. Эти пептиды были исследованы всеми доступными методами белковой химии (автоматический аминокислотный анализ [162], ступенчатое расщепление фенилизотиоцианатом [50, 156, 157], динитрофенилирование и определение К-концевых аминогрупп [57, 77], гидролиз концевых групп карбоксипептидазой [57] и лейцинаминопептидазой [161]). [c.415]

В гл. IV мы показали на двух примерах (см. стр. 148), что с помощью сефадекса G-25 можно определить число центров связывания в молекуле фермента, или сродство ферментов к различным реагентам, а также изучить влияние кофакторов на фермент (см. стр. 142). Аналогичным образом, измеряя способность к связыванию восстановленного ДПН, удалось найти эквивалентный вес семи дегидрогеназ (30 000— 40000) [20]. Иногда образуются стабильные комплексы фермента с реагентом, как, например, при действии свободной от цинка карбоксипептидазы на пептидный субстрат [21]. Этот комплекс, который с помощью гель-хроматографии можно отделить от избытка субстрата, уже не активируется ионами цинка. Очистка гель-фильтрацией на сефадексе G-50 является стандартным приемом при определении металла в карбоксипепти-дазе [22]. Лизоцим образует нерастворимый комплекс с продуктом, получающимся при действии этого фермента на- определенный гликопептид. Растворение этого комплекса (в растворе Na l) и последующий анализ с помощью гель-хроматографии на сефадексе (j-75, а затем на G-25 дает информацию о кинетике ферментативной реакции [23]. При добавлении цито-хромоксидазы к избытку цитохрома с и последующем разделении на сефадексе G-200 в некоторых случаях получают высокомолекулярную фракцию, содержащую эквимолярные количества обоих ферментов эта фракция есть по сути не что иное, как часть дыхательной цепи [24]. В некоторые ферменты цикла лимонной кислоты, для которых кофактором служит биотин, удалось ввести метку (С Ог) в результате реакции с соответствующими субстратами с последующей очисткой на сефадексе G-50 это дало возможность после деградации под действием проназы [c.214]

При этом анализу подвергают отщепляющуюся аминокислоту или непосредственно ее фенилтиогидантоин. Указанный принцип положен в основу работы секвенсоров, автоматически определяюш их аминокислотную последовательность в пептидных фрагментах, получаемых ферментативным расщеплением исследуемых белков. По Сэнджеру концевую аминогруппу П. маркируют 1-фтор-2,4-динитробензолом, подвергают П. гидролизу и определяют динитрофенильные производные аминокислот. С-Концевую аминокислоту можно отщепить с помощью карбоксипептидазы. Используют также полный гидразиполиз пептида. При этом все аминокислоты, кроме С-концевой, выделяются в виде гидразидов. Применяют также масс-спектрометрич. определение аминокислотной последовательности в П. Сведения об оптич. чистоте П. могут быть получены исследованием их атакуемости природными ферментами. [c.15]

В части 1 книги, посвященной структурным и электронным аспектам исследования роли ионов металлов в белках, сначала речь идет о возможностях и разрешающей способности рентгеноструктурного анализа белков. Здесь обсуждаются интересные и для неоргаников, и для биохимиков проблемы установления кристаллической структуры макромолекулярных веществ. При рассмотрении каждого примера сделана попытка соотнести кристаллографические данные с результатами, полученными такими методами, как измерение магнитной восприимчивости, электронный парамагнитный резонанс, поляризационная спектроскопия монокристаллов. В этой части рассматриваются гемовые белки, цинксодержащие металлоферменты, а также кобальт-, медь-, кадмий-, ртуть-, никель-, и марганецзамещенные карбоксипептидазы. Приведены данные по белкам, связывающим кальций. [c.9]

Карбоксипептидазы А и В образуются при гидролизе трипсином соответствующих прокарбоксипептидазных предшественников, синтезируемых в поджелудочной железе [187J. Из этих двух ферментов более подробно изучена карбоксипептидаза А, и проведено ее детальное исследование методом рентгеноструктурного анализа [29, 188, 189]. Карбоксипептидаза А быка (КПА) представляет собой фермент, содержащий 307 аминокислот в единственной полипептидной цепи, которая прочно связывает 1 г-ион Zn(II) на 1 моль фермента. Необходимость Zn(ll) для ферментативной активности была впервые продемонстрирована тем, что КПА, свободная от иона металла, неактивна, но активность восстанавливается при добавлении Zn(II) [190, 191]. По-видимому, фермент, не содержащий металла, в основном сохраняет структурные свойства активной КПА [191]. Позже на основе данных рентгеноструктурного анализа [29] было четко установлено, что роль иона Zn(ll) при гидролизе пептидов заключается в связывании субстрата. При протеолизе фермент проявляет стереохимическую специфичность, отщепляя С-конце-вую аминокислоту от пептидной цепи только в том случае, если С-концевая карбоксильная группа свободна и если аминокислота имеет L-конфигурацию [192, 193]. Обычно наблюдается более высокая активность, если остаток С-концевой аминокислоты содержит ароматическую группу или разветвленную цепь [194]. [c.76]

Си 11)-, Сй(П)- и Hg IГ -Зaмetцeнныe карбоксипептидазы. При замещении другими ионами металлов геометрия координации, подобная геометрии в Со(П)-замещенном или нативном ферменте, не обязательно должна сохраняться. Это утверждение основывается на общих тенденциях координационной химии других катионов металлов и на результатах спектроскопических исследований. Исследование монокристаллов Си(П)карбоксипептидазы А методом ЭПР [223, 224] показывает, что в отличие от поля искаженных тетраэдрических комплексов поле лигандов иона Си(П) плоское. Поскольку анализ сверхтонкой структуры спектра указывает на присутствие двух донорных атомов азота [223], вероятно, ион Си(И) связывается вблизи того же центра, что и ион 2п(П). С этим выводом согласуются данные рентгеноструктурного анализа Си(11) X ХКПА при разрешении 600 пм [195]. [c.87]

Корреляция относительного ряда пептидазной активности со структурой комплекса и электронной конфигурацией иона металла позволяет дать разумное описание электронных перестроек молекулы субстрата, которое совпадает с механизмом ферментативного действия, сформулированным на основе рентгеноструктурного анализа. Этот механизм не дает объяснения, почему в нативном белке находится ион 2п(П), а не более активный Со(И), и не дает исчерпывающего ответа на вопрос о природе каталитического действия карбоксипептидазы. Вероятно, однако, что механизм, постулированный Липскомбом и сотрудниками, правильно отражает природу центров связывания субстрата, включающих ион металла. Корреляция относительного ряда пептидазной активности с рядом прочности связи металл—лиганд [(3.7) и (3.8) ] может, следовательно, указывать на важную роль электронной структуры и геометрии координации катиона металла в протеолитическом действии металлокарбоксипептидаз. [c.97]

На основе рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением проведено сравнение стереохимических свойств трех типов взаимодействий металл—белок. Для установления структурных и электронных факторов, ответственных за регуляцию активности иона металла, рассмотрены координационные центры металл — лиганд в белках и прослежена связь между молекулярной структурой, стереохимией и электронной структурой и биологической ролью функции иона металла. Гидро( бное взаимодействие порфиринового кольца гемоглобина и миоглобина рассмотрено по данным измерений магнитной восприимчивости, спектроскопии парамагнитного резонанса и исследования поляризационных спектров поглощения монокристаллов. С точки зрения электронной конфигурации (1-орбиталей и геометрии координации обсуждается взаимодействие замещенных ионов металлов в карбоксипептидазе А с карбонильной группой субстратов при гидролизе пептидов. Предполагается, что спектральные изменения, зависящие от pH и наблюдаемые в спектре электронного поглощения, замещенного иона Со(П), каталитически активного в карбоангидразе, обусловлены образованием упорядоченной структуры растворителя вблизи иона Со(И), Корреляция между молекулярной структурой, определенной методами рентгеноструктурного анализа, и электронной структурой координационного центра металл — лиганды, оцененной из спектроскопических данных, указывает на происхождение структурной регуляции реакционной способности иона металла в белках и ферментах. [c.123]

Из анализа данных, приведенных на фиг. 79, а также из ряда других данных следует вывод, что в карбоксипептидазе координационные связи образуются сульфгидрильной группой цисте-инового остатка и аминогруппой. Из металлов, обычно встречающихся в биологических системах, карбоксипептидаза наиболее сильно связывает цинк и, по-видимому, именно поэтому относится к классу цинксодержащих ферментов. Концентрация ионов цинка особенно велика в поджелудочной железе, где происходит синтез карбоксипептидазы. Исходя из сравнительно высокой константы стабильности связи цинка с сульфгидрид-ной группой, можно ожидать, что цинк связан с серой и в других цинксодержащих белках судя по всему, это так и есть. Замещение иона цинка в карбоксипептидазе на ион другого двухвалентного металла часто дает активный металлсодержащий фермент, активность которого иногда превосходит активность нативного, цинксодержащего фермента. [c.413]

Теперь задача сведена к исследованию поочередно всех пептидов ферментативного гидролизата. Для этого сначала делаем аминокислотный анализ фрагментов, а затем пускаем в ход метод концевых групп Сэнгера или Эдмана. Короткие пептиды (до пентапентидов) расшифровываются сравнительно легко. Метод концевых групп может быть применен многократно и последовательно, т. е. после гидролитического отш епления меченного реагентом конца, можно действовать снова и метить следуюгцее звено с N-кoнцa пептидной цепочки. Можно также использовать карбоксипептидазу для отш епления С-конца. Комбинация этих методов позволяет однозначно расшифровать короткие пептиды за сравнительно небольшой срок. [c.27]

Группы могут быть тетрагональными свободные места занимают молекулы воды. Структура очень многих комплексов металлов с аминокислотами и короткими пептидами рассматривается в в обзоре Фримена [37]. Активность некоторых ферментов проявляется только при комплексообразовании с ионами металлов. Наиболее изученным из них является карбоксипептидаза, структура которой определена в результате рентгеноструктурного анализа кристаллов этого белка [38, 39]. Биологически активная форма фермента содержит один атом Zп , но активность сохраняется и ири замещении на Со +. Ион Zn . имеет [c.275]

Активный центр карбоксипептидазы (гл. 15) содержит атом Zn. Лигандами являются остатки His-69, His-196 и Glu-72, так что известными донорными атомами являются два имидазольных атома азота и один или оба карбоксильных атома кислорода из карбоксильных групп глутаминатной боковой цепи. В комплексах Zn (II) с аминокислотами и пептидами координационное число атома Zn почти всегда равно четырем (тетраэдрическая конфигурация), иногда — шести (о1ктаэдрическая конфигурация) или имеет промежуточное значение (неправильная координация). Если анализом структуры сложного белка [155, 156] показано, что координация тетраэдрическая, молекула Н О (или, возможно, га- [c.196]

В последнее время появилась возможность изучать физические свойства белков такими методами, как температурный скачок, которые позволяют исследовать процессы с временами, соизмеримыми с временами каталитического превращения субстрата на ферменте, так что стало возможным непосредственно установить взаимосвязь между скоростями субстратзависи-мых конформационных изменений и скоростями самой реакции. В настоящее время имеется ун е несколько свидетельств в пользу существования изомеризации ферментов и ферментсубстратных комплексов, которые могут представлять собой конформационные изменения такого рода [49—52]. Скорость мономолекулярной изомеризации глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы характеризуется константой порядка 1 с и является слишком медленной, чтобы этот процесс имел место при каждом обороте фермента по-видимому, этот процесс относится к явлениям контроля ферментативной активности. Рентгеноструктурный анализ лизоцима [28], химотрипсина [54] и карбоксипептидазы [55] дал прямое доказательство существования изменений в конформации фермента при взаимодействии с субстратами или ингибиторами. Гемоглобин, хотя и не является ферментом, но может быть поучительным примером использования всех этих методов для демонстрации конформационных изменений при взаимодействии этого белка с кислородом [56]. [c.243]

Наиболее конкретные и подробные экспериментальные данные о пространственной организации ряда глобулярных белков дал метод рентгеноструктурного анализа. В настоящее время этим методом установлена пространственная структура семи белков. Это — миоглобин гемоглобин химотрипсин лизоцим рибонуклеаза карбоксипептидаза А карбоксиангидраза С . Среди изученных белков самый низкомолекулярный — карбоксиангидраза С (33 аминокислоты) и самый высокомолекулярный — карбоксипептидаза А (307 аминокислот в цепи). За исключением гемоглобина, построенного из четырех цепей и имеющего, таким образом, четвертичную структуру, все остальные белки содержат одну ковалентно непрерывную полипептидную цепь. [c.154]

Известно несколько ферментов, катализирующих последовательное отщепление нуклеотидов от нуклеиновых кислот, начиная с определенного конца. Такие ферменты широко используются при определении последовательности олигонуклеотидов. Кроме того, ферменты эти можно с успехом использовать в тех случаях, когда необходимо осуществить полное расщепление РНК либо на З -нуклеотиды, либо на 5 -фосфорилированные нуклеозиды. Ферментом, атакующим нуклеиновые кислоты с 5 -конца, является экзонуклеаза селезенки, тогда как фосфодиэстераза змеиного яда и полинуклеотидфосфори-лаза атакуют полинуклеотид с З -конца, образуя фХ и ффХ соответственно. Однако все попытки использовать такие ферменты для определения последовательности у столь больших нуклеиновых кислот, как вирусные РНК (подобно тому как аминопептидазы и карбоксипептидазы были использованы для анализа белков), оказались обескураживающими. Следует отметить также, что эти экзо-нуклеазы наиболее активны в отношении немодифициро-ванных и незамещенных концевых групп. Так, экзонуклеаза селезенки не атакует 5 -фосфорилированные концы, [c.101]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология