Седиментация равновесие в градиенте плотности

Метод равновесной седиментации в градиенте плотности основан на следующем. Если поместить в ячейку центрифуги смесь низкомолекулярных жидкостей (растворителей) различной плотности, то при сильном центробежном ускорении (более 10 м/с ) через некоторое время в кювете установится седиментационное равновесие, т.е. в радиальном направлении возникнет постоянный во времени градиент плотности. Если в таком бинарном растворителе содержится полимерный компонент с плотностью, промежуточной между плотностями элементов растворителя, то полимер начнет собираться в полосы в тех местах кюветы, где его плотность равна плотности бинарного растворителя. Чем ниже молекулярная масса, тем больше коэффициент диффузии и тем сильнее размывается эта полоса (изоденса). Для сополимеров (если сомономеры имеют разные плотности) в результате установления равновесия могут появиться несколько полос макромолекулы с различной плотностью соберутся в разные полосы. Следует отметить, что метод применим для молекулярных масс выше критической, иначе ширина полосы становится соизмеримой с длиной ячейки. [c.325]

Рис. 1.9. Принципиальная схема равновесной седиментации в градиенте плотности (плотности компонентов трех компонентной системы Р1<Рп<Р2)-а — положение компонентов при установившемся равновесии б — распределение плот" ности виг — интегральная С (х) и дифференциальная йС йх = / (х) кривые распределения концентрации полимера.

Отметим, наконец, что равновесная седиментация в градиенте плотности, как и обычное седиментационное равновесие, может использоваться для определений молекулярного веса [ср. формулы (6.112) и (6.117)]. Однако при этом следует считаться с тем, что локальная концентрация полимера в области изоденсы высока и пренебрежение термодинамической поправкой (пропорциональной второму вириальному коэффициенту Лг) приводит к сильным искажениям при расчетах. Так, в работе [84] для системы хлороформ — бензол было получено сильно завышенное, а для системы ДМФ — хлороформ — заниженное значение Л1 . Авторы объясняют это наличием агрегативных тенденций (Лг < 0) в первой системе и большими положитель- [c.493]

Седиментационное равновесие в градиенте плотности позволяет установить изменение градиента плотности в растворе полимера, который достигается в столбике жидкости, представляющей собой смесь легкого и тяжелого растворителей, при равновесии между седиментацией и диффузией под влиянием слабого центробежного поля. [c.123]

Центрифугирование в градиенте плотности. Конвекционные возмущения и взаимодействие между молекулами растворенного вещества сводятся к минимуму или совершенно исключаются, если центрифугирование проводят в непрерывном градиенте плотности. Существует два метода этого типа метод, основанный на измерении скорости седиментации, и метод седиментационного равновесия. [c.138]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Аналитическое ультрацентрифугирование полимеров [1, 2, 4, 12] включает в себя три следующих экспериментальных метода скоростную седиментацию, изучение седиментационного равновесия и процесса приближения к нему. Скоростная седиментация позволяет определить константу седиментации и полидисперсность образца. Седиментация макромолекул в зоне (зонное ультрацентрифугирование) — ценный метод обнаружения гетерогенности высокомолекулярного образца. Метод приближения к равновесию позволяет рассчитать молекулярную массу М и получить сведения о неоднородности полимера, а изучение седиментационного равновесия (состояния, достигаемого транспортным переносом макромолекул, хотя сам метод и не является истинно транспортным) — молекулярную массу (надежнее, но с большей затратой времени, чем в предыдущем методе) различных типов усреднения. Метод центрифугирования в градиенте плотности заключается в исследовании седиментации, состояния равновесия и приближения к нему в условиях искусственно создаваемого в кювете градиента плотности это — широко используемый метод определения молекулярной массы, наличия неоднородности и ее типа, служащий и для препаративных разделительных целей. [c.14]

Мол. веса с помощью ультрацентрифуг определяются тремя методами методом определения скорости седиментации, методом седиментационного равновесия и методом центрифугирования в градиенте плотности. [c.409]

Смесь тяжелых (черные кружочки), гибридных (заштрихованные кружочки) и легких (белые кружочки) молекул ДНК растворяют в концентрированном растворе хлористого цезия (мелкие точки). При центрифугировании хлористый цезий образует градиент плотности концентрация раствора соли увеличивается по направлению ко дну пробирки. Каждый вид ДНК образует полосы в том месте раствора, где ее плотность совпадает с плотностью раствора. Когда процесс седиментации приближается к состоянию равновесия, центрифугу останавливают, прокалывают дно центрифужной пробирки, а ее содержимое собирают по каплям в коллектор. Затем в каждой капле анализируют радиоактивность с помощью счетчика, а также определяют на спектрофотометре поглощение ультрафиолетовых лучей. [c.200]

В области равновесия частицы будут располагаться в виде полосы, ширина которой определится соотношением процесса концентрирования за счет седиментации — флотации и процесса диффузии. Ширина полосы будет тем меньше, чем круче градиент плотности среды (dp/dr) и чем больше масса частиц с увеличением массы уменьшается их склонность к диффузии. Распределение концентрации вещества в полосе описывается сим- [c.240]

Измерение молекулярной массы методом седиментацион ного равновесия 326 Определение молекулярной массы методом приближения к равновесию (метод Арчибальда) 328 Седиментационное равновесие в градиенте плотности 329 Измерение молекулярной массы методом седиментационного равновесия в градиенте плотности 331 Определение плотности путем седиментации в градиенте плот-ности 332 Приложение 344 [c.578]

Вещества, используемые для формирования градиента плотности. Для формирования градиента плотности необходимо иметь инертные, нетоксичные и быстрорастворимые в воде и солевых растворах вещества. Эти вещества должны обладать большим молекулярным весом и высокой плотностью при низкой вязкости. Высокая плотность градиентного раствора необходима для того, чтобы можно было формировать крутой градиент, а низкая вязкость градиента способствует более быстрой седиментации частиц, быстрому установлению равновесия и упрощает процедуру фракционирования содержимого градиентной пробирки. При анализе фракций эти вещества не должны мешать определению содержания белка и измерению поглощения в ультрафиолетовой области. И главное требование эти вещества должны быть индифферентны к вирусным частицам. [c.70]

Частицы будут двигаться к положению равновесия как из области более низкой плотности градиента, чем их плавучая плотность, так и из области более высокой плотности. Таким образом, наряду с седиментацией, может происходить и флотация. Это означает, что нет необходимости наносить тонкий начальный слой препарата и можно даже смешать его со всем объемом градиента. [c.240]

Метод седиментационного равновесия в качестве абсолютного метода онределения молекулярных весов полимеров обладает рядом достоинств. Силовое поле ультрацентрифуги обусловливает осаждение крупных частиц типа пыли, но в то же время практически весьма слабо влияет на низкомолекулярные включения в образце. На довольно малом количестве полимера можно измерить молекулярные веса, изменяюш иеся от нескольких сотен до нескольких миллионов, а также получить обш ую картину степени полидисперсности. Недостатки метода, обусловленные большим временем эксперимента и трудностями при исследовании достаточно низких концентраций образцов, применяемых для надежной экстраполяции к бесконечному разбавлению, могут оказаться не столь суш ественнымй, если применять идеальные растворители и использовать появившиеся возможности быстрого достижения равновесных условий седиментации. В то время как метод скоростной седиментации обладает большей чувствительностью к тонким характеристикам распределений по молекулярным весам, метод седиментационного равновесия применяют главным образом для определения средних молекулярных весов, хотя использование этого метода в случае смешанных растворителей (седиментация в градиенте плотности), как недавно было показано, перспективно для определения наличия в образце других типов неоднородности. [c.238]

В седиментационном анализе можно проводить два типа экспериментов. При анализе методом скоростной седиментации проводят определения скорости оседания и диффузии частиц при бioльшиx скоростях вращения ротора, тогда как при анализе методом седиментационного равновесия выжидают установления равновесия между процессами седиментации и диффузии в процессе центрифугирования при меньших скоростях вращения ротора. Теоретически неоднородность распределения по молекулярным весам в образце можно охарактеризовать с помощью обоих указанных методов, получая методом скоростной седиментации распределение по коэффициентам седиментации, а методом седиментационного равновесия — распределение по молекулярным весам. Распределение по молекулярным весам легче интерпретировать хими-ку-полимерщику, не имеющему специальной подготовки. Было показано, что детализированный характер распределения по коэффициентам седиментации можно получить методом скоростной седиментации в отсутствие дополнительных предположений о форме кривой распределения. Такие дополнительные предположения, как правило, необходимы при анализе методом седиментационного равновесия. Скоростное ультрацентрифугирование приобрело, следовательно, наиболее широкое распространение при исследовании неоднородности распределения но молекулярным весам полученные этим методом данные обычно комбинируют с результатами других измерений, преобразуя кривую распределения по коэффициентам седиментации в кривую распределения по мол екулярным весам, в ряде случаев более подходящую для целей исследования. Метод седиментационного равновесия применяется в основном в качестве способа определения абсолютных величин средних молекулярных весов, но применение этого метода для растворов в смешанных растворителях ультрацентрифугирование в градиенте плотности), как недавно было показано, позволяет оценить распределение полимера по плотности. [c.216]

Наномним, что нри центрифугировании в сахарозном градиенте разделение основано на различиях в скорости седиментации молекул, а не ни различиях в плавучей плотности. Это означает, что молекулы РНК, ДНК и белка при центрифугировании в сахарозном градиенте никогда не достигнут положения равновесия. Их плотность значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, п при длительном центрифугировании все они оседают на дно центрифужной пробирки. Поэ/ому центрифугирование в сахарозном градиенте не следует путать с центрифуг гированием в градиенте солей цезия, которое широко иснользуется для разделения молекул по их плавучей плотпостп. [c.127]

Пусть первоначально пробирка заполнена раствором s l одинаковой концентрации по всему объему. Выделим мысленно три молекулы 1, 2 и 3, находящиеся на разных уровнях внутри пробирки. Каждая из них будет испытывать действие центробежной силы, направленной перпендикулярно оси вращения ротора. Пока они находятся вдали от наружной стенки пробирки, их поведение будет точно таким же, как поведение молекул в пробирке бакет-ротора. На каждом из уровней начнет формироваться градиент плотности раствора. В сечениях 1 и 3, удаленных от стенки пробирки, со временем установится равновесие седиментации и диффузии молекул, как было описано для бакет-ротора. Очевидно, что равновесная плотность в сечении 1 будет ниже, чем в сечении 3, поскольку сечение 1 находится ближе к оси вращения ротора. [c.253]

Огромным достоинством равновесного центрифугирования в градиенте плотности является возможность разделения веществ в соответствии с их плотностью. Например, ДНК, содержащую изотоп можно отделить от N-ДНК. При седиментации до достижения равновесия в плотном растворе s l различие в плотности на 0,014 г/см приводит к разделению зон и N-ДНК на 0,5 мм в стандартной ячейке центрифуги при 40 000 об/мин. Другие изотопы позволяют достичь еще большего разрешения, что показано в табл. 11-1. [c.332]

При центрифугировании небольшого количества ДНК в концентрированном растворе хлористого цезия вскоре достигается равновесие. Действующие при этом противоположные процессы седиментации и диффузии приводят к установлению стабильного градиента концентраций хлористого цезия с непрерывным повышением плотности в центробеишом направлении. Макромолекулы ДНК сдвигаются под действием центробежной силы в зону, где плотность раствора равна собственной плотности ДНК. Этой тенденции противостоит процесс диффузии, в результате чего в условиях равновесия определенный вид ДНК оказывается сосредоточенным в узком слое. При наличии нескольких видов ДНК с различной плотностью каждый из них образует определенный слой в том месте, где плотность раствора хлористого цезия равна плотности данного вида ДНК. [c.65]

При воздействии на раствор полимера большой центробежной силы, что достигается в ульграцентрифуге, где создаются гравитационные поля до 250 ООО g, возникает тенденция к осаждению полимерных молекул (предполагается, что плотность молекул полимера выше плотности растворителя). Скорость осаждения (седиментации) пропорциональна молекулярной массе, и поэтому более тяжелые молекулы осаждаются быстрее. При равновесии устанавливается градиент молекулы более вькокой молекулярной массы располагаются ниже, а лее низкой — выше. [c.529]

Поскольку скорость седиментации частицы постепенно снижается по мере достижения ею той области градиента, где она имеет плотность одинаковую с плотностью раствора, для достижения равновесия центрифугировать требуется очень долго. Это особенно важно для маленьких мембранных везикул, таких, как хрома-тофоры, или для фрагментов цитоплазматических мембран клеток, разрушенных на прессе Френча, так как скорость седиментации этих частиц низка даже в отсутствие градиента. Если применять центробежные ускорения порядка 100 000—200 000 для более или менее хорошего разделения требуется не меньше 24 ч, а для полного — 72 ч. [c.150]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология