Везикулы фосфолипидов

Получение препарата лецитиновых липосом. а. Метод быстрого удаления детергента. Препарат яичного лецитина освобождают на роторном испарителе от органического растворителя и растворяют в холате натрия, приготовленном на 50 мМ трис-НС1 буфере, pH 7,8, в молярном соотношении фосфолипид—детергент, равном 2 1 (м. м. лецитина — 800 Да, м. м. холата — 450 Да). Для удаления детергента раствор лецитина пропускают дважды через колонку с анионитом Dowex 1X4 (20—50 меш), уравновешенную 50 мМ трис-НС1 буфером, pH 7,8. Размеры колонки в случае использования 50 мг лецитина составляют 1x7 см. Выход липосом с колонки регистрируют по мутности вытекающего раствора, содержащего везикулы. [c.375]

Для более четкого понимания могут быть полезны два типа классификации. Согласно одному из них все мыслимые или существующие мембраны разделяются на два больших класса — природные (биологические) и синтетические мембраны. Это самое ясное из возможных отличий и в то же время очень существенное, поскольку оба типа мембран принципиально отличаются и по структуре и ро функциям. Хотя в нашей книге рассматриваются синтетические мембраны, в гл. II частично обсуждаются также и биологические мембраны. Последние могут подразделяться на мембраны живых организмов и мембраны, способные функционировать вне организма. Первые существенны для жизни на земле, они не включены в эту книгу, потому что тогда бы ее объем резко возрос. Второй тип биологических мембран (липосомы и везикулы фосфолипидов) становятся все более важными в современных разделительных процессах, особенно для медицины и медицинской биологии. Синтетические мембраны могут подразделяться на органические (полимерные или жидкие) и неорганические. Оба типа обсуждаются более детально в гл. III. [c.29]

Рис. 1 -10. Клеточные мембраны состоят из фосфолипидов. Поскольку эти молекулы имеют гидрофильные головы и липофильные (гидрофобные) хвосты , на поверхности раздела воды и масла они самопроизвольно будут располагаться головными концами к воде, а хвостовыми к маслу. В воде эти молекулы ассоциируют с образованием замкнутых двухслойных пузырьков (везикул), в которых липофильные хвосты контактируют друг

Добавление ионов Са в малой концентрации в суспензию мембранных везикул вызывает агрегацию, но не слияние последних. При достижении пороговой концентрации Са + происходит изотермический фазовый переход фосфолипидов из жидкого состояния в кристаллическое и индуцируется слияние. В везикулах из смеси различных фосфолипидов надпороговые концентрации Са2+ вызывают латеральное разделение липидов,, при этом кластеры, содержащие кислые липиды, переходят в кристаллическое состояние. Ионы М повышают температуру фазового перехода фосфолипидов в меньшей степени, чем Са +. Отсюда следует, что когда Са + вызывает слияние везикул, фосфолипиды в присутствии Mg2+ остаются в жидком состоянии, и наблюдается агрегация везикул. Эти опыты указывают на то, что дестабилизация бислоев при слиянии обусловлена образованием кластеров твердых липидов в жидком бислое. [c.88]

Рис. 25.3.4. Электронные микрофотографии водных дисперсий фосфолипидов (а, в) и бислойных везикул (б, г)

Из результатов, приведенных в табл. 25.3.6, ясно, что в везикулах из смеси фосфолипидов бислой асимметричен. Было показано [24], что фосфолипиды, с ненасыщенными углеводородными цепями предпочтительно оказываются во внешней области бислоя, состоящего только из фосфатидилхолина. Однако в случае смешанных бислоев (из фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина) избирательность по отношению к составу алкильных цепей не наблюдалась явно преобладала тенденция фосфатидилэтаноламина находиться на внутренней поверхности (см. [c.120]

Важный фактором, влияющим на скорость работы АТФ-аз, может быть электрический потенциал на мембране, если помпа электрогенна. Как и в случае пассивного транспорта I m. уравнение (6.11)], перенос положительного заряда замедлен при положительном потенциале по другую сторону мембраны и ускорен при отрицательном значении потенциала. Вопрос в том, происходит ли перенос заряда при работе ионных насосов. Данные, полученные на природных мембранах или реконструированных везикулах, состоящих из синтетических фосфолипидов и очищенных АТФ-аз, показали, что все три помпы Са -АТФ-аза, Na — К -АТФ-аза и Н -АТФ-аза переносят ионы вместе с зарядом (а не в обмен на другой ион, т. е. без суммарного переноса заряда). [c.134]

Так как фосфолипиды содержат фосфатные группы, с помощью ЯМР Р можно наблюдать фосфорсодержащие липосомы. Выше температуры фазового перехода при благоприятных условиях в искусственных мембранных везикулах можно наблюдать сигналы от различных фосфолипидов (рис.3.47). В малых везикулах удается различить линии, соответствующие фосфолипидам, находящимся на внутренней и внешней сторонах мембраны (химические сдвиги отличаются на несколько Гц), Для более надежного отнесения соответствующих резонансных линий фосфолипидов на внутреннюю или внешнюю поверхность мембраны, необходимо добавить парамагнитное вещество, для которого проницаемость мембраны невелика, и в основном будет наблюдаться связывание этого вещества с фосфолипидом, находящимся на одной из сторон поверхности. Резонансные линии липидов, связанных с парамагнитным веществом, в этом случае сильно уширяются и практически не наблюдаются в спектре. Спектры ЯМР Р липосом также являются подтверждением сделанного ранее вывода о том, что увеличение напряженности магнитного поля далеко не всегда обеспечивает более высокое разрешение, так как для ядер фосфора вклад в релаксацию за счет анизотропии химического сдвига будет значительным. В этом случае скорость релаксации возрастает как квадрат напряженности магнитного поля (см. формулу (1.38)),а разность значений химических сдвигов увеличивается с ростом поля линейно, поэтому уширение линий может компенсировать воз- [c.157]

Имеются сообщения [14] о приготовлении МЛВ в процессе фазовой инверсии. При таком способе в раствор фосфолипида в эфире вводят водный буфер, а затем эфир испаряется. МЛВ, полученные по этому способу, имеют большие внутренние пространства, чем везикулы, образованные при набухании в воде безводных фосфолипидов [14]. [c.333]

Если мицеллу в общем случае можно определить как замкнутый монослой, то везикула — это замкнутый бислой. Для везикулы не встает вопрос о возможности существования полости — она в данном случае естественна и заполнена тем же веществом, что и окружающая среда. Везикула в водном растворе или другой полярной среде представляет собой замкнутую углеводородную пленку с находящимися на ее поверхностях полярными группами (см, рис. 26), Поскольку раствор внутри везикулы изотропен, наиболее естественная форма везикулы — сферическая. Хорошо известны бислои и везикулы биологических фосфолипидов — анионных или цвиттерионных ПАВ, молекулы которых обычно имеют две углеводородных цепи с 16—18 атомами углерода и, обладая такой объемной неполярной частью, [c.219]

Как мы уже говорили, ферменты, ответственные за синтез фосфолипидов, располагаются на цитоплазматической стороне везикул эндоплазматического ретикулума. По мере синтеза фосфолипидов происходит их самосборка с образованием термодинамически стабильных бимолекулярных слоев, которые включаются в мембрану везикул. Липидные везикулы, происходящие от эндоплазматического ретикулума, по-видимому, перемещаются к аппарату Гольджи, фрагменты которого в свою очередь сливаются с плазматической мембраной. Мембраны аппарата Г ольджи и везикул эндоплазматического ретикулума асимметричны в поперечном направлении как по фосфолипидам, так и по белкам, и эта асимметрия сохраняется до слияния с плазматической мембраной. Внутренняя поверхность везикулярных мембран оказывается с наружной стороны плазматической мембраны, а цитоплазматическая остается на ее цитоплазматической стороне (рис. 42.10). Поскольку поперечная асимметрия в мембранах везикул, происходящих из эндоплазматического ретикулума, существует еще до слияния с плазматической мембраной, основной проблемой сборки мембран становится вопрос о том, каким образом интегральные белки асимметрично включаются в липидный бислой эндоплазматического ретикулума. [c.135]

Нужно отметить уникальную способность цитоплазматической мембраны менять свою форму и размеры при формировании эндоцитозных везикул. Внешний слой бислойной мембраны на тех участках, где рецепторы связали внеклеточный материал, сжимается и прогибается внутрь клетки, тогда как внутренний слой фосфолипидов на этом участке растягивается, становится выпуклым и замыкает бислойный пузырек — везикулу. Таким образом, внутренний слой плазматической мембраны становится внешним слоем везикулы, а внешний слой мембраны с ассоциированным внеклеточным материалом оказывается внутренним слоем везикулы. При экзоцитозе комплементарность внешнего и внутреннего слоев фосфолипидной мембраны обеспечивает обратный процесс прилипание внешнего слоя везикулы к внутреннему слою мембраны, выворачивание везикулы наизнанку и слияние ее фосфолипидного бислоя с цитоплазматической мембраной. При встраивании везикулы в цитоплазматическую мембрану сохраняется компонентный состав внешнего и внутреннего фосфолипидных слоев. [c.119]

Искусственные мембраны получают с помощью специально разработанных методик. Такие мембранные системы обычно состоят из одного фосфолипида (природного или синтетического) или их смеси. В соответствующих условиях (например, при мягкой обработке ультразвуком) эти фосфолипиды образуют сферические бислойные везикулы. Везикулы, ограниченные липидным бислоем, называются липосомами. [c.132]

Современные чувствительные калориметры позволяют измерять фазовые переходы в водно-липидных дисперсиях в небольших (несколько миллиграмм) порциях материала. Применение этого метода для исследования простых искусственных систем (мицелл, везикул, бислои которых образованы из фосфолипидов заданного вида) дало ценную количественную информацию о принципах организации бислоя. [c.74]

В. Р. Бишоп и Р. М. Бели в 1984 г. нашли в микросомных мембранах печени крыс переносчик для водорастворимых короткоцепочечных фосфолипидов. Транспорт этих липидов не регистрировался в клетках крови и липидных везикулах, а в микросомах был-весьма чувствителен к действию протеолитических ферментов и. [c.173]

Следует еще раз подчеркнуть, что Са-индуцируемое фазовое разделение фосфолипидов при слиянии происходит либо в бислое, либо только в наружном монослое мембранных везикул. Это может привести к образованию дефектов структуры бислоев и к прямому контакту гидрофобных хвостов фосфолипидов с водной фазой. Нестабильность таких участков способствует слиянию везикул на этих участках. Центры нестабильности локализуются на границах твердых доменов (мицелл) в жидком бислое. Слияние индуцируется либо за счет взаимодействия липидных мицелл, либо за счет локальных изгибов бислоев, либо за счет электрического пробоя бислоев. [c.89]

Липосомы, полученные указанными методами, представляют собой бислойные, униламеллярные, сферической формы везикулы диаметром 25—30 нм. Препараты липосом хранят в атмосфере азота или аргона при —20 °С в течение 1 мес. Перед использованием препарата определяют, возможно ли в нем перекисное окисление фосфолипида. С этой целью на спектрофотометре оценивают индекс окисленности, т. е. отношение поглощения суспензии липосом (2 мкмоль лецитина в 3 мл смеси этанол—эфир в соотношении 3 1) при 233 и 215 нм. Поглощение препарата липосом при 233 нм свидетельствует о присутствии в суспензии продуктов перекисного окисления лецитина. В работе ис- [c.375]

При исследовании внутриклеточного транспорта липидов, так же как и при изучении трансмембранного переноса, используются фосфолипиды, несущие радиоактивную или флуоресцентную метку. Внутри клетки липиды транспортируются двумя независимыми способами в виде везикул или отдельных молекул в комплексе с белками-переносчиками. Как уже отмечалось, биогенез мембран требует переноса липидов от мембран эндоплазматического рети- <улума и аппарата Гольджи к митохондриям, лизосомам, другим мембранным структурам и цитоплазматической мембране. По-видимому, возможен и обратный перенос липидов от органелл к микросомам. [c.174]

Компоненты мембран. Липиды представлены фосфолипидами и холестерином, имеюшими гидрофобные и гидрофильные группы. В мембранах находят гликолипиды. В водных растворителях фосфолипиды самоорганизуются в мицеллы, затем плоский бислой и везикулы. Везикулы, состояшие из фосфолипидного бислоя, называют липосомами везикулы с включением белков называют протеолипо-сомами. Фосфолипиды и гликолипиды в мембране расположены в виде бислоя. [c.101]

Изучение критического состояния липидного бислоя раскрывает биологический смысл этого явления. Считается, что на начальных этапах эволюции клеточных структур формировались липидные везикулы, мембраны которых, как это следует из рассмотренного выше, способны были обеспечивать такие важные функции клетки, как проницаемость и генерацию мембранных потенциалов ионной природы. Однако чистые липидные пленки хрупки, и их стабильность в сильной степени зависит от внешних условий. Для предотвращения разрушения липидного бислоя в состоянии стресса в клетке и выработалась система стабилизации. Во-первых, жирнокислотные радикалы, входящие в соотав молекулы природного фосфолипида, как правило, различаются по насыщенности один радикал представлен насыщенной жирной кислотой, второй — ненасыщенной. Это обеспечивает жидкостное состояние липидного бислоя во всем диапазоне физиологических температур, поскольку область фазового перехода таких липидов находится ниже О °С. Во-вторых, в большинстве мембран содержится холестерин, который, как известно, резко расширяет температурный диапазон фазового перехода, а при его эквимолярном содержании в количестве по отношению к фосфолипидам — даже исключает такой переход. В-третьих, образованию насыщенных продуктов в результате перекисного окисления препятствует набор мембранных антиоксидантов. И, наконец, специальные ферменты — фосфолипазы — способны полностью изменить фосфолипидный портрет мембраны, модифицируя как жирнокиолотные радикалы (фосфолипаза А), так и полярные головки (фосфолипаза Д). Совершенно очевидно, что нарушение какого-либо из указанных элементов этой системы стабилизации может разрушить биологическую мембрану, что может привести клетку в состояние патологии. [c.36]

Синтез АТФ из АДФ и Фн может происходить в мембранных везикулах и в отсутствие переносчиков электронов. Для этого необходимо лишь тем или иным образом создать трансмембранную разность электрохимических потенциалов Н+ на мембране, в которой находится АТФ-синтетаза. Такого рода процессы синтеза АТФ наблюдаются в липосомах из фосфолипидов, в состав которых помимо АТФ-синтетазы входит бактериородопсин (см. гл. XXIX), способный под действием света переносить Н+ через мембраны. Аналогично, синтез АТФ можно осуществить, создав разность АрН с помощью кислотно-щелочного удара или прикладывая разность электрических потенциалов. В действительности проблема состоит в том, чтобы понять, каким образом компоненты АрН+ взаимодействуют с Н+-АТФазой, не вовлекая непосредственно перенос электрона в ЭТЦ. [c.219]

Введение холестерина в везикулы фосфатидилсерина и фосфати-дилннозта в молярном отношении 1 I приводит к уменьшению максимального молярного отношения липид белок с 6 1 (без холестерина) до 4 I. Одним из следствий введения холестерина в модельные мембраны является увеличение толщины липидных бислоев, и, следовательно объема везикулы. Вышеупомянутое уменьшение отношения липид белок, возможно объясняется этим изменением оГл ема. Однако взаимодействие между цитохромом с и фосфолипидными везикулами, содержащими холестерин, легче нарушается солью, чем в отсутствие холестерина. Поэтому введение жшестерина наряду с уменьшением отношения липид белок вызывает и ослабление взаимодействия между цитохромом с и фосфолипидом. [c.280]

Механизмы асимметричного распределения липидов пока не установлены. Участвующие в синтезе фосфолипидов ферменты локализованы на цитоплазматической стороне мембран микросомных везикул. Таким образом, можно предположить, что существуют транслоказы, переносящие определенные фосфолипиды от внутреннего слоя к наружному. Кроме того, в обоих слоях могут присутствовать специфические белки, преимущественно связывающие те или иные фосфолипиды и приводящие к их асимметричному распределению. [c.132]

Содержание разных липидов в искусственных мембранах можно варьировать это позволяет проводить систематическое исследование влияния липидного состава мембран на ту или иную функцию. Например, можно получить везикулы исключительно из фосфатидилхолина или, наоборот, из смеси фосфолипидов известного состава с включением гликолипидов и холестерола. Можно строить мембраны из липидов с разными остатками жирных кислот. Это позволяет провести ситематические исследования влияния жирнокислотного состава на определенные функции мембран (например, на транспорт). [c.133]

Динамическая структура липидного бислоя наиболее полно изучена на примере искусственных бислойных везикул. Эти исследования показали, что молекула фосфолипида как целое может вращаться вокруг своей продольной оси и имеет достаточно высокую подвижность в слое с коэффициентами латеральной диффузии 10 —10 см /с. Полярные головки образуют на поверхности короткоживу-щие (10 —10 с) кластеры из 20—30 молекул, в результате чего могут возникать временные дефекты в структуре бислоя. Диффузия молекул воды через липидный бислой возможна при их попадании в эти свободные объемы между гидрофобными хвостами липидов. Молекулы фосфолипидов, находясь в бислое, могут осуществлять перескок из одного слоя в другой (флип—флоп). Однако в искусственных бислойных мембранах это происходит сравнительно редко из-за энергетической невыгодности переноса полярной головки через гидрофобный слой (Оеепеп, 1981). Только селективное взаимодействие с интефальными белками природных мембран может обеспечить быстрый переход фосфолипида из одного слоя в другой. Например, из печени быка был выделен белок, селективно взаимодействующий с ФХ и транспортирующий его с внешней стороны мембраны на внутреннюю, из искусственных везикул в плазматическую мембрану. После гидролиза этого комплекса был [c.110]

Липосомы, или фосфолипидные везикулы (пузырьки), получают обычно при набухании сухих фосфолипидов в воде или при впрыскивании раствора липидов в воду. При этом происходит самосборка бимолекулярной липидной мембраны. Минимуму энергии Гиббса отвечает замкнутая сферическая одноламеллярная форма мембраны. При этом все неполярные гидрофобные хвосты находятся внутри мембраны и ни один из них не соприкасается с полярными молекулами воды (рис. 1.11). Однако чаще получаются несферические многоламеллярные липосомы, состоящие из нескольких бимолекулярных слоев, - многослойные липосомы. [c.28]

Важная особенность мембраны — асимметрия бислоя, создаваемая за счет действия внутриклеточных ферментов, различий ионного состава цитоплазмы и интерстициальной жидкости, а также особенностей структуры молекул фосфолипидов и асимметричной локализации белков и липидов в бислое. Асимметрия бислоя — это фактор, обеспечивающий создание градиента кривизны, складок, сморщиваний, отшнуровку частей мембраны в виде везикул. [c.31]

Липидный состав одетых везикул изучен слабо. Во фракции одетых везикул мозга соотношение холестерин/фосфолипиды равно 0,1—0,3 (для сравнения плазмалемма — 0,3—1,2, мито- (ондрии — 0,03—0,09, ЭПР — 0,03—0,08). [c.47]

Еще один динамический параметр, который можно определить методом ЭПР, — это скорость латеральной диффузии фосфолипидов в мембранах пузырьков (везикул). При этом можно использовать подход, основанный на анализе спектров ЯМР фосфатидилхо-линовых пузырьков при наличии небольшого количества спин-меченного фосфатидилхолина (ФХ). Суть подхода заключается в том, что быстрая диффузия меченого ФХ должна существенно изменять ширину линий спектра протонного магнитного резонанса. В частности, линии уширяются в результате взаимодействий ядер с неспаренными электронами спин-меченных зондов (гл. 9). [c.468]

Для выяснения специфичности фосфолипидов в поддержании АТФазной активности был использован метод замещения эндогенных липидных компонентов саркоплазматического ретикулума в ходе центрифугирования обработанных детергентом везикул в градиенте плотности сахарозы (G, В. Warren et al,, 1974), Ответ был однозначным фосфолипидное окружение АТФазы не оказывает специфического воздействия на АТФ-гидролитическую функцию. Для сохранения активности фермента требуется лишь, чтобы с ним было ассоциировано не менее 30 молекул фосфолипидов. Более того, почти все эти фосфолипидные молекулы без ущерба для функции могут быть замещены неионным детергентом (W. Dean, С, Tanford, 1977). [c.55]

Метод реконструкции был впервые разработан Рэкером и Ка-гавой. Уже после выделения чистого комплекса при реконструкциях возникает ряд технических проблем. Во-первых, после встраивания в бислой комплекс должен сохранять каталитическую активность. Во-вторых, следует учитывать, что после реконструкции протонные помпы могут быть ориентированы в мембране случайным образом, что затрудняет измерение их протон-переносящей активности. Для включения комплексов в везикулы их обычно суспендируют в смеси холата и фосфолипидов, а затем медленно удаляют детергент с помощью диализа. Везикулы с встроенными в мембрану комплексами образуются самопроизвольно. Другой метод состоит в том, что комплексы в смеси с фосфолипидами обрабатывают ультразвуком (разд. 1.4). [c.116]

Клетки Я. halobium способны использовать энергию света для выброса протонов и синтеза АТР, несмотря на то что в них отсутствует хлорофилл. Было установлено, что перенос протонов происходит при работе бактериородопсина. Для этого выделенные пурпурные мембраны были реконструированы в замкнутые мембранные везикулы с помощью добавленных фосфолипидов. Такие везикулы имеют ориентацию мембраны, противоположную [c.146]

В 1973 г. Э. Рэкеру (США) удалось получить липосомы (везикулы из фосфолипидов), в которые была встроена АТРаза, выделенная из митохондрий сердца быка, и хромопротеин галофильной бактерии На1оЬас1епит ка1оЫит — бактериородопсин, обусловливающий создание протонного градиента за счет энергии света. Фосфолипиды для реконструкции мембран этих липосом были выделены из растений (соевые бобы). Полученные таким образом гибридные пузырьки на свету осуществляли фосфорилирование. [c.159]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология