Электрофорез изоэлектрическое фокусирование

Электрофоретическое оборудование обычно работает во влажной атмосфере, причем величины напряжения и силы тока, как правило, превышают безопасные пределы. Неправильное обращение с приборами уже привело к нескольким несчастным случаям со смертельным исходом. Омическое сопротивление человеческого тела, обычно составляющее 10 —10" Ом, существенно зависит от физиологического состояния человека и влажности кожи. Для человека опасен даже ток силой 10 мА, так как при поражении током пострадавший обычно не может сам отсоединиться от проводника. Ток силой более 25 мА вызывает серьезные повреждения в организме —остановку сердца, паралич дыхательных мышц, ожоги и т. д., которые могут привести к смерти. Учитывая, что сопротивление тела 10 Ом, напряжение всего лишь в 100 В способно привести к несчастному случаю в результате уменьшения сопротивления вследствие шока, сопровождающегося потоотделением и (или) повреждением кожи, опасно даже меньшее напряжение. Таким образом, приборы для электрофореза и изоэлектрического фокусирования, являющиеся источниками электрического тока, могут представлять опасность для жизни. Если источники питания стабилизованы, то опасность возрастает, так как напряжение во время разъединения проводов или разрыва проводящих соединений в электрофоретической камере увеличивается. При работе на приборе для дискретного электрофореза в полиакриламидном геле, который обычно снабжен стабилизованным источником питания, риск часто недооценивают. [c.327]

Изоэлектрическое фокусирование обладает наивысшей разрешающей способностью, когда-либо достигавшейся при разделении белков цо зар5 дам [58—64, 92]. Этот метод позволяет разделить белки, велйчины р/ которых различаются всего на 0,01 ед. pH. Иногда Для такого разделения бывает достаточно различия между двумя структурами на одну заряженную группу. При помощи метода изоэлектрофокусирования можно также обнаружить другй различия в зарядах, которые, строго говоря, не связаны с макроскопической егомогенностью белков. Вот некоторые из факторов, обусловливающих такие различия посттрансляционная модификация первичной структуры (например, дезамидирование), связывание лигандов, химическая модификация, вариации в небелковых компонентах, например липидах, углеводах и других простетических группах, ассоциация и диссоциация, изменения окислительно-восстановительного состояния металлоферментов. Если при анализе картины изоэлектрофокусирования иметь в виду эти факторы, то полученные данные могут приобрести дополнительную ценность, поскольку в принципе они позволяют обнаружить микрогетерогенность белковых структур. В настоящее время метод изоэлектрического фокусирования применяют в сочетании с другими электрофоретическими методами, например в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, для получения двумерных карт разделяемых компонентов. В одном направлении производят разделение белков в соответствии со значениями их рД а в другом — в соответствии с размерами их молекул, т. е. в соответствии с их молекулярными массами. При помощи этих методов можно охарактеризовать смеси, содержащие тысячи белков [94]. Еще несколько лет тому назад разделение с таким высоким разрешением было просто немыслимо, а в настоящее время этот метод анализа находит все более широкое и все более успешное применение в различных биохимических исследованиях. [c.126]

Движение подвижной фазы в тонкослойной хроматографии может быть ступенчатым, прерывным или непрерывным. Тонкослойную хроматографию можно комбинировать с тонкослойным электрофорезом, тонкослойным изоэлектрическим фокусированием, тонкослойной гель-фильтрацией и т. д. [c.6]

Даже если количество белка очень невелико, его молекулярную массу и субъединичный состав можно определить, используя ДСН-электрофорез в ПААГ. В случае двумерного электрофореза белки разделяют на отдельные фракции изоэлектрическим фокусированием в одном направлении, после чего следует ДСН-электрофорез во втором направлении. Этот метод может быть использован для разделения тех белков, которые в норме считаются нерастворимыми. [c.221]

Фракционирование белков можно осуществить методом изоэлектрического фокусирования. В этом случае электрофорез белков проводят в колонке со средой, в которой градиентно меняется значение pH. Там, где pH среды соответствует ИЭТ данного белка, он теряет заряд и перестает продвигаться вдоль колонки. Таким [c.122]

Разновидность электрофореза — изоэлектрическое фокусирование. Метод основан на электрофоретическом разделении смеси белков в градиенте pH с достижением изоэлектрической точки (ИЭТ) каждого белка и его фокусированием в отдельной зоне и применяется для быстрого и эффективного фракционирования больших количеств (несколько граммов) образца на начальных стадиях его очистки. [c.222]

Электрофорез в гелях, и особенно в полиакриламидном геле, занимает сейчас ведущее положение среди методов разделения макромолекул. Поэтому оправдано то углубленное внимание, которое авторы уделили данному вопросу. Оно нашло выражение в детальном описании многих модификаций метода, рассмотрении преимуществ и недостатков различных гелей, а также в обсуждении возможных причин артефактов, возникающих иногда при электрофорезе этого типа. В первой части книги рассмотрены также теоретические и практические аспекты новых видов электрофореза — изоэлектрического фокусирования и изотахофореза, причем хорошо очерчены возможные области применения этих методов, их сильные и слабые стороны. Все это позволит читателю уверен-но выбрать тот вариант электрофореза, который поможет ему наиболее удачно решить поставленные задачи. [c.6]

Разделять смеси белков посредством электрофореза начали еще в первые годы XX в. Однако до сравнительно недавнего времени этот метод применялся лишь в аналитических целях. В течение 30 и более лет широко использовался довольно Сложный аппарат Тизелиуса для электрофореза в свободном растворе, однако с его помощью не всегда удавалось добиться полного разделения компонентов. И до сих пор остается справедливым утверждение, что электрофорез — это в основном аналитический метод. Все современные более тонкие электрофоретические методы, такие, как гель-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез, были разработаны главным образом с целью улучшить способы анализа смесей белков. Тем не менее каждый из этих методов может быть приспособлен для препаративных целей с использованием десятков и даже сотен миллиграммов белковой смеси. [c.213]

На протяжении всей главы наряду с понятием электрофокусирование будет использоваться термин изоэлектрическое фокусирование . Для этой цели применяли и множество других терминов изоэлектрическое фракционирование, изоэлектрическое конденсирование, стационарный электролиз, непрерывный электролиз, изоэлектрический равновесный электрофорез. [c.298]

Следует особо указать на различие между изоэлектрическим фокусированием и электрофорезом. Спектр подвижности , создаваемый с помощью электрофореза, представляет собой картину распределения белков по величине молекул и суммарному заряду при данном значении pH. Существенное преимущество изоэлектрического фокусирования по сравнению с другими методами фракционирования состоит в том, что в ходе разделения зона белка сжимается, поскольку действующие силы стремятся уменьшить размывание зон вследствие диффузии. [c.299]

Изоэлектрическое фокусирование — это особый вид электрофореза, при котором происходит перемещение молекул через жидкостную колонку с постоянным гра- [c.275]

На ранних этапах исследования гемоглобинов применяли электрофорез с подвижной границей, а также электрофорез на бумаге и в блоках крахмального геля. С помощью этих методов были выявлены первые мутантные гемоглобины. Б настоящее время в качестве носителей при электрофорезе используют ацетат целлюлозы, агаровый, крахмальный и полиакриламидный гели. Кроме того, все более широкое распространение получает изоэлектрическое фокусирование. [c.320]

В зависимости от типа электролитических систем различают а) зонный электрофорез при постоянном значении pH, или просто электрофорез 48—57] б) изоэлектрическое фокусирование в градиенте pH [58—64] в) изотахофорез с ведущими и за- [c.111]

Белки с разным количеством ионогенных радикалов в полипептидной цепи имеют в растворе разные заряды, поэтому в электрическом поле будут двигаться с разной скоростью. Обычно для их разделения используют электрофорез в полиакриламидном геле. Перспективен также метод изоэлектрического фокусирования. [c.51]

Более совершенная идентификация белков Р была проведена методом двухмерного электрофореза с изоэлектрическим фокусированием белков в одном направлении и SDS-электрофорезом в присутствии разрушающих агентов во втором направлении [101]. Обнаружено, что два полипептида Р являются относительно основными, а один из полипептидов Р — относительно кислый. Эти данные сделали номенклатуру белков Р более совершенной до момента выяснения всех их функций [101, 274, 295]. Более быстро мигрирующий основной белок Р, кодируемый 1-м сегментом РНК, назвали РВ2, медленно мигрирующий основной белок Р, кодируемый 2-м сегментом РНК, — РВ1, а кислый белок Р, кодируемый 3-м сегментом РНК, — РА (см. табл. 1 и 3). [c.42]

Рис. 4-52. Фракционирование белков клетки Е. oli методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле Каждое пятно соответствует отдельной полипептидной цепи. Сначала белки разделяли соответственно их изоэлектрическим точкам методом изоэлектрического фокусирования слева направо Затем в присутствии ДСН их разделяли методом электрофореза сверху вниз в соответствии с молекулярной массой их субъединиц

Электромиграция третьего типа (стационарный, или вытесняющий, электрофорез) характеризуется тем, что через некоторое время после начала разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся два метода изоэлектрическое фокусирование (гл. 1.12) и изотахофорез (гл. 1.13). [c.15]

Изоэлектрическое фокусирование в столбиках полиакриламидного геля. Эта методика очень сходна с описанным Дэвисом [281] диск-электрофорезом, и поэтому для нее пригодны [c.148]

Существует три типа электрофоретических систем электрофорез по Тизелиусу (с подвижной границей) зональный электрофорез (например, в среде с капиллярной структурой) стационарный электрофорез (изоэлектрическое фокусирование, изотахофорез). В медицинской и фармацевтической практике чаще применяется зональный электрофорез на фильтровальной бумаге, пленке из ацетатцел-люлозы, агаровом, агарозном, крахмальном или полиакриламидном гелях. Электрофорез белков сыворотки крови ведут в буферной среде с pH 8,6, когда молекулы белка и липопротеинов заряжаются отрицательно и движутся к аноду. После заверщения электрофоретического разделения электрофореграммы фиксируются и окрашиваются. Затем производят визуальную и денситометрическую оценку разделения белков. Для окраски различных белков на электрофоре-граммах используют специальные красители, часть из которых представлена в табл. 5. [c.44]

В 1963 г. Мальмстрём с сотр. [56] опубликовал серию работ, в которых изложил результаты тщательно выполненных экспериментов с использовании классического термодинамического метода равновесного диализа, дополненного методом электронного парамагнитного резонанса. Уделяя особое внимание тому, чтобы показать, что равновесие действительно достигается, и обрабатывая свои данные новым методом графического анализа, эти исследователи заключили, что связывание железа трансферрином можно описать, предположив участие в связывании двух эквивалентных невзаимодействующих центров. Если это так, то напрашивается вывод, что трансферрин в растворах не полностью насыщен железом и должны сосуществовать три типа белковых частиц частицы с двумя связанными атомами железа, частицы только с одним связанным атомом и частицы, не содержащие металла [59]. Вернер и Вебер [21] на основании электрофоретических диаграмм, скорее интуитивно, различили три типа молекул в неполностью насыщенных железом растворах кональбумина. Однако они не сопоставили это наблюдение со своими заключениями, сделанными на основании исследования равновесия. Позднее это предположение было детально подтверждено для трансферрина с помощью фронтального электрофореза методом движущейся границы [59], а окончательно для кональбумина методом изоэлектрического фокусирования [60]. Было высказано предположение, что частицы, обладающие промежуточной подвижностью при электрофорезе и в опытах по изоэлектрическому фокусированию, могут представлять собой димер апопротеина и белка, насыщенного железом [61]. Однако позднее было доказано, что это предположение несостоятельно [41]. [c.341]

Возможность для дальнейшего улучшения разделения белков открывает сочетание изоэлектрического фокусирования с электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем ДСН, а также использование различных видов равномерных или скачкообразных градиентов концентрации полиакриламида. [c.228]

Ионообменная хроматография. Для разделения белков на субъединицы по суммарному заряду используют методы ионообменной хроматографии, электрофореза (разд. 1.3.2.3), изоэлектрического фокусирования и хроматофокусирования (разд. 1.3.2.4). [c.39]

Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем 1) сокращается длительность разделения 2) полностью подавляется термическая конвекция 3) применяется простое оборудование для ИФ 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте 7) достаточно небольшого количества образца 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярноситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. Другой недостаток метода — это низкая точность определения pH в зонах. В настоящее время этот метод (сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле доо пска-ется окрашивание. Для снижения молекулярно-сито<вого эффекта рекомендуется [23] концентрация геля 3,7%. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. Градиент pH можно измерить после разрезания столбиков с гелем и последующего элюирования сегментов небольшим коли- [c.323]

Электрофорез (электрофорез без носителя, электрофорез на носителе гель-электрофорез, диск-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, изотахоэлектрофорез, иммуноэлектрофорез ) Ионообменная хроматография Аффинная хроматография [c.347]

Весьма перспективными методами разделения белков (как и определения ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода изоэлектрического фокусировання-изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом pH. Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении pH равен нулю. При использовании [c.31]

Только при электрофорезе с подвижной границей и при зонном электрофорезе наблюдается постоянство pH во всей среде и постоянно расходящееся движение компонентов исследуемой смеси. Изоэлектрическое фокусирование может приводить к максимальным величинам pH при нулевой результирующей подвижности разделяемых компонентов. В условиях изотахрфореза [c.281]

Эта довольно простая картина осложняется неоднородностью в содержании как белка, так и железа. Содержащиеся в небольших количествах компоненты, обнаруживаемые при ультрацентрифугировании [22, 23, 25] и при гель-электрофорезе [51- 3], были идентифицированы как мономер, димер, тример и т. д., причем содержание мономера составляло 80—90% от массы всего препарата [22, 23, 41, 49]. Биологическое значение этого полимера не выяснено. Неоднородность ферритина и апоферритина наблюдали также посредством изоэлектрического фокусирования [54, 55]. По-видимому, она не связана с содержанием железа или полимера, а, возможно, обусловлена изменениями в ацетильной, амидной, ионизированной карбоксильной или других присоединенных группах или ионах. Средняя изоэлектрическая точка ферритина лошади 4,4. Кроме того, недавно было показано, что ферри-тины из различных органов одного и того же животного имеют [c.304]

Этот метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата (808-РАСЕ) фракционирует белки в основном по молекулярной массе. На основании результатов такого разделения ученые пришли к вьшоду, что глобулиновые запасные белки злаков характеризуются меньшей сортовой изменчивостью, чем проламины. Метод 808-РА0Е обнаруживает незначительные различия среди девяти сортов овса и лишь немногим более — методом изоэлектрического фокусирования (1ЕР). Более выраженной оказалась изменчивость при анализе проламинов (авенинов) из тех же сортов вышеупомянутыми методами. Крайне низкой оказалась также электрофоретическая изменчивость глобулинов риса. [c.384]

О Фаррел (O Farrell) разработал систему двумерного гель-электрофореза для анализа белковых смесей. Предложенный им метод представляет собой сочетание ДСП-электрофореза белков в полиакриламидном геле и изоэлектрического фокусирования [c.218]

Изоэлектрическое фокусирование применяется как в препаративном, так и в аналитическом вариантах. Для аналитических целей используют методики, очень сходные с диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, при этом полиакриламид с низкой степенью сшивки служит в качестве антиконвекционной среды. Для препаративного разделения можно использовать готовое оборудование или изготовить его самим. [c.276]

Два подхода должны оказаться очень полезными в дальнейших исследованиях с использованием мутантов вируса гриппа. Во-первых, первичное повреждение у большого количества нетекущих мутантов с повреждениями в отдельном сегменте РНК генома вируса гриппа должно быть установлено при тщательном изучении каждой из установленных стадий репликационного цикла. Использование коров для сравнения in vitro активностей вирионной транскриптазы ts-мутанта и вируса дикого типа должно оказать существенную помощь в расшифровке данных по инкубации при ограничите.11ьной температуре [274]. Недавно разработанные методы, в которых используются клонированные копии индивидуальных сегментов РНК [264], могут быть применены для проведения более прямого анализа фенотипа РНК но сравнению с тем, чтО было возможно до настоящего времени. И наконец, применение метода двухмерного электрофореза в геле в сочетании с изоэлектрическим фокусированием или электрофорезом в неравновесном градиенте pH дает значительные преимущества в характеристике изменений фенотипа в клетках, инфицированных мутантным ви- [c.240]

Важное значение имеет также плотность исследуемого раствора. Она должна быть равной или по крайней мере близкой к плотности ореды в месте его введения. В связи с тем что измерение плотностей жидкостей в малых объемах является трудоемкой процедурой, для создания условий, при которых исследуемый раствор и среда будут иметь одинаковую плотность,, применяются более простые методы. Свенссон и др. [1265] предложили в месте введения пробы создавать уступ плотности — крутой локальный градиент плотности. В этом случае достигается хорошее приближение к идеальной плотности пробы, так как она может быть любой в пределах плотностей верхнего и нижнего краев уступа . Обычно формирование слоя исследуемой пробы проходит успешно, если градиент плотности в месте ее внесения настолько крут, что расстояние между этим местом и слоем, имеющим одинаковую с пробой плотность, не превышает нескольких миллиметров. В этом случае раствор пробы почти лэминарно перемещается вверх или вниз до уровня равной с ним плотности и образует тонкую горизонтальную полосу. Если же градиент плотности слишком пологий и (или) расстояние между местом внесения пробы и слоем с равной плотностью велико, то перемещение пробы вплоть до достижения ею этого слоя будет сопровождаться конвекционными токами, ухудшающими качество стартовой зоны. Поскольку при электрофорезе в градиенте плотности в отличие от изоэлектрического фокусирования толщина стартовой зоны существенно влияет на качество разделения, правильное внесение пробы имеет исключительно важное значение. [c.27]

Поскольку скорость перемещеиия заряженных белков в электрическом поле зависит от фактической вязкости раствора, их движение будет ускоряться при восходящем и замедляться при нисходящем электрофорезе [1214]. Это необходимо учитывать при планировании экопери ментов. Например, если относительные электрофоретические подвижности разделяемых компонентов при данном pH относятся как 1 4 5, то восходящий электрофорез даст лучшие результаты. Для смеси белков с отношением относительных подвиж1ностей 1 2 3 4 разделение будет плохим как при восходящем, так и при нисходящем электрофорезе. В этом случае подвижности следует увеличивать или путем применения соли, создавая тем самым градиент электропроводности, или с помощью градиента pH (изоэлектрическое фокусирование). Можно также проводить электрофорез в среде, действующей как молекулярное сито (гели), чтобы фракционировать вещества не только по заряду, но и по размерам молекул. [c.28]

Рис. 39, Схта прибора для аналитического электрофореза в полиакриламидном геле (фирма Shandon Southern). )—электрический провод 2 —электрод, вмонтированный в крышку 5 —верхний электродный сосуд — уплотнительное кольцо для трубки 5 — калиброванные трубки для геля 5 —электрический провод 7 —узел нижнего электрода 5 —верхний электродный сосуд из комплекта для изоэле(Ктрического фокусирования 9 — вкладыш из комплекта для изоэлектрического фокусирования —нижний электродный сосуд.

Для изотахофореза белков желательно испольэовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изо-тахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования [1116], так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ [501]. Преимущество же изо тахофореза заключается в том, что в отличие от изо- [c.175]

В работе [45] описан другой метод десорбции связавшегося материала с матрицы с использованием изоэлектрического фокусирования. Аффинный гель помещается в предварительно фокусированный градиент pH, который получают электрофорезом плоского слоя амфолитсодержащего геля. Система работает при низкой силе тока и высоком напряжении. Хотя ни этот метод, ни электрофоретическая десорбция по существу не были оптимизированы, оба метода открывают возможность проводить десорбцию в мягких условиях даже в случае систем с высоким сродством, таких, как биотин — авидин и антиген — антитело. [c.121]