Хроматографирование ДНФ-пептидов

Для лучшего разделения соединений с близкими значениями R , а также для увеличения часто проводят хроматографирование в нескольких (обычно двух) системах растворителей, пропуская второй растворитель в том же направлении, что и первый. Это приводит к уплощению пятен разделяемых соединений в направлении, перпендикулярном пропускаемому растворителю, и способствует их лучшему разделению. Более полное разделение аминокислот и пептидов достигается при двухмерной хроматографии (второй растворитель пропускают в направлении, перпендикулярном первому) или при сочетании хроматографии (одно направление) и электрофореза (второе взаимно перпендикулярное направление). Последний метод носит название метода пептидных карт или отпечатка пальцев . [c.126]

К. Химическими превращениями с последующим исследованием продуктов реакции (например, гидролиз пептидов, полисахаридов и т. д. и хроматографирование продуктов гидролиза на бумаге) . [c.462]

Часть выделенного индивидуального дипептида растворяют в разбавленной соляной кислоте и полученную каплю подвергают действию нитрозных газов в течение 10 мин при 37° [40]. Свободная аминогруппа аминокислоты, карбоксил которой амидно связан в молекуле дипептида, под влиянием нитрозных газов замещается на гидроксил. После упаривания реакционной смеси, гидролиза остатка 6 н. соляной кислотой в капилляре и упаривания гидролизат хроматографированием на бумаге можно разделить на оксикислоту и аминокислоту. Нингидрин обнаружит присутствие только той аминокислоты, которая была связана в пептиде своей аминогруппой. [c.480]

Промежуточный связанный с полимером пептид после удаления растворимых реагентов и побочных продуктов не нуждается в очистке, что позволяет избежать традиционных процедур очистки (перекристаллизация, хроматографирование) и связанных с ними потерь. В принципе такой подход приемлем только в том случае, если все последовательные синтетические реакции идут количественно. Поскольку этого вряд ли можно достичь, метод синтеза на твердом носителе неизбежно приводит к окончательному продукту, загрязненному более короткими пептидами, в которых не-хватает одной или более аминокислот (дефект последовательности). Подобным же образом побочные реакции могут привести к загрязнению пептидами с искаженной и частично выполненной последовательностью. Поэтому успех синтеза на твердом носителе полностью зависит от того, возможно ли очистить конечный продукт от близких побочных продуктов. Для достижения даже умеренной чистоты продукта, получаемого на смоле, необходима очень высокая эффективность реакций образования пептидной связи. Так, для получения декапептида с правильной цепью с выходом 80% необходимо, чтобы выход на каждой стадии образования пептидной связи был около 98 % В случае пептида с 20 остатками аминокислот средний выход увеличивается до 99%. В обоих случаях остающиеся 20 % связанного со смолой пептида имеют более короткие пептидные цепи, в основном на одну или две аминокислоты меньше. Поэтому проблема очистки становится очень трудной. [c.407]

В заключение следует отметить, что при подготовке к работе смолы дауэкс-1 необходимо очень тщательно удалять хлорид-ионы. Присутствие в колонке хлорид-ионов вызывает появление хвостов , а попавший в пептиды пиридин-хлорид может помешать их дальнейшей очистке при хроматографировании на бумаге. Для удаления хлорид-ионов рекомендуется поместить смолу в колонку большого диаметра и промывать 0,5 н. раствором едкого натра до отрицательной реакции на хлорид-ион с нитратом серебра. [c.408]

Совершенно не ясно, каким образом вообще осуществляется взаимодействие между набухающими в воде гелями и ароматическими соединениями. Этот эффект можно подавить, вводя в элюент различные добавки. Создавая в элюенте высокую концентрацию роданида или мочевины, удается почти полностью нормализовать элюирование пикриновой кислоты и триптофана [52]. На сефадексе 0-25 в водно-спиртовой среде полифенолы ведут себя в соответствии с их молекулярным весом, ВТО время как в чистой воде они сильно задерживаются гелем [53]. Возможные активные центры геля не удается насытить путем добавления к элюенту ароматических соединений (например, 0,2 н. салицилата натрия) [42], однако в 1 М пиридине ди-нитрофенильные производные аминокислот появляются в элюате раньше, чем свободные аминокислоты. По-видимому, при хроматографировании в системе фенол — уксусная кислота — вода (1 1 1) гель уже не имеет сродства к ароматическим соединениям [54], Карнеги [55], работая на сефадексе 0-25 в этой системе (которая позволяет избежать побочных эффектов), сумел на ряде пептидов подтвердить обычную зависимость между объемами выхода и молекулярным весом (табл. 26). Он предполагает, что при молекулярном весе выше 400 имеет место собственно гель-хроматография, поскольку здесь уже не должен действовать эффект распределения [63]. Однако до сих пор все же не доказано, одинаков ли состав растворителя в гранулах геля и между гранулами. [c.130]

При хроматографии пептидов и белков на бумаге часто задний фронт бывает размыт (у пятен имеются хвосты ). Для улучшения разделения можно использовать технику многократного хроматографического проявления. После первого хроматографирования хроматограмму высушивают, затем ставят на повторное хроматографирование и т. д. (иногда до 10 раз). Задний фронт при такой процедуре обостряется, зоны становятся четкими, разрешение пятен улучшается. [c.239]

В настоящее время в исследовании белков, пептидов и аминокислот хроматография занимает одно из важных мест [179]. При решении многочисленных научных и практических задач исследователи чаще всего сталкиваются с необходимостью хроматографирования аминокислот и пептидов в виде их производных. [c.95]

Разделяют посредством БХ аминокислоты и пептиды преимущественно в виде водных растворов иногда целесообразно заменить воду на н-пропанол. Чтобы разделение было полным, в некоторых случаях, как установлено, следует помимо однократного элюирования провести еще и многократное элюирование (рис. 3.24). Полезно хроматографировать исследуемые пробы параллельно со смесью аминокислот известного состава. В лабораторных работах автора применялась стандартная смесь А, содержащая цистеиновую кислоту, лизин, аргинин, серин, глутаминовую кислоту, аланин, тирозин, метионин, фенилаланин, лейцин, а также стандартная смесь Б, в состав которой входили цистеиновая кислота, гистидин, аспарагиновая кислота, глицин, треонин, аланин, пролин, валин, изолейцин. В 10 мкл смеси находилось около 0,025 мкмоль каждой из перечисленных аминокислот. Хроматографирование неизвестной пробы вместе с такой стандартной смесью позволяет приближенно оценить содержание аминокислот или пептида в пробе. [c.122]

Кроме перечисленных выше способов, пептиды идентифицируются также по их аминокислотному составу. Для этого пептиды сначала выделяют путем хроматографирования на бумаге в чистом виде, затем производят гидролиз каждого пептида и хроматографирование гидролизата. [c.149]

Для идентификации простых пептидов применяются те же методы получения хроматограмм, что и для аминокислот. Простые пептиды наиболее целесообразно вымывать из хроматограмм, затем дезаминировать их, подвергать гидролизу и, наконец, идентифицировать полученные продукты повторным хроматографированием. Для этого готовят параллельно две двухмерные хроматограммы, из которых одну обрабатывают нингидрином обычным путем, а вторую тем же нингидрином, разбавленным 1 10. При этом на второй хроматограмме проявляется положение только наиболее интенсивных пятен, остальные же пятна, полученные на первой хроматограмме, можно интерполировать по положению более интенсивных. [c.158]

При расщеплении НЬ5 трипсином, расщепляющим только ли-зил- и аргинилпептидные связи, образуется набор пептидов, из которых только один отличается по поведению при хроматографировании и электрофорезе от набора пептидов гидролизата трипсина НЬА. В этом нона пептиде из НЬ5 имеется нейтральный остаток валина там, где в нонапептиде из НЬА находится отрицательно заряженный остаток-глутаминовой ки1. лоты. [c.672]

Карбо-п-фенилазобензилокси- и карбо-п-(п -метоксифенилазобен-зилоксигруппы окрашены, что облегчает разделение слоев при хроматографировании или противоточном распределении защищенных пептидов [158]. Эти группы, применявшиеся для защиты а-аминогрупп [107, 162, 163, 167] и са-аминогрупп [168], отщепляли путем каталитического гидрирования [107, 158, 167] и действием бромистого водорода в уксусной кислоте [106, 158, 163, 168]. [c.182]

Так как полиароматические гели почти не адсорбируют полярные соедин ния, их рекомендуют для разделения сильнополярных веществ воды, спирто гликолей, свободных жирных кислот, аминов, эфиров, альдегидов, кетонов, также низкомолекулярных алифатических, ароматических и хлорированнь углеводородов, а также серусодержащих соединений н других веществ. Вод как правило, при хроматографировании газов выходит раньше других вещест что особенно благоприятно для газо-хроматографического анализа веществ i водных растворов. Полиароматические гели используются также для определ ния фракционного состава полимеров (по МВ). Специальные хлорметилированн полиароматические смолы, расположенные в конце данной таблицы, предназн чены для синтеза пептидов в твердой фазе (по Меррифилду и др.). [c.172]

Аминокислоты II пептиды представляют собой гидрофильные соединения, трудно растворимые в безводных жидкостях. Обычно разделенпе этих соединений проводят на слое силикагель — гипс. Возможно также хроматографирование аминокислот в виде солей, но в этом случае применяют буферные слои силикагеля. Для разделения смесей аминокислот, пептидов и протеинов был использован слой сефадекс С-25, так называемый гельфильтр (стр. 18). [c.91]

Давно установлено, что присутствующие в бумаге примеси вредно влияют на процесс хроматографирования на бумаге. Например, при гидролизе бумаги ватман № 1, 2 и 4 получаются аминокислоты, которые могут привести к ошибкам при анализе пептидов. Катионы меди, железа, марганца также мешают предложены способы их маскировки и устранения. Рекомендуется в ряде случаев предварительное промывание бумаги кислотами, водой и другие методы обработки. Бумагу применяют в виде полосок, круншов или листов. [c.403]

После хроматографии на колонке с Дауэкс 50X2 чистота фракций определялась с помощью бумажной хроматографии и электрофореза при pH 6,3. Значение заряда пептида, определенное в этих условиях, имеет существенное значение для последующего выбора режима хроматографирования на анионообменной колонке. Дело в том, что непивды, обладающие положительным зарядом, хорошо разделяются при использовании буфера pH 9,3, в то время как нейтральные пептиды лучше разделяются при использовании буферных растворов с более низкими значениями pH (8 и 8,3). [c.172]

Зомзели с сотрудниками [44] использовали в качестве летучих производных К-ТФА-бутиловые эфиры. На одной колонке была разделена смесь 19 аминокислот, наиболее часто встречающихся в гидролизатах пептидов и протеинов. Программирование температуры [45] позволяет осуществить весь процесс разделения при хроматографировании на 2-метровой колонке с 1 % неопентил-гликольсукцината (в качестве стационарного растворителя) примерно за 40—50 мин. При этом наблюдается хорошее разрешение всех аминокислот за исключением лишь аспарагиновой кислоты и фенилаланина, которые разделяются только частично. [c.265]

Растительный материал (надзелшая часть травянистых растений, листья, цветки, плоды, корни, древесина или кора) экстрагируется водой для извлечения фенольных гликозидов [593, 595, 596, 652], водно-спиртовыми смесями (50, 70, 80%-ными) или спиртом (метанол, этанол) — для извлечения флавоноидов [135, 497, 571], ацетоном [214, 218, 294], а также метилэтилкетоном с водой [280] — для извлечения агликонов фенольного характера. Полученные экстракты упаривают в вакууме (иногда в атмосфере азота) до сухого состояния или до концентрированных растворов. Суммарные экстракты подвергают очистке от сопутствующих липофильных веществ, таких, как хлорофилл, липиды и др., промыванием петролейным эфиром, диэтиловым эфиром, хлороформом или бензолом [135]. Очищенные продукты растворяют или разбавляют дополнительно водой, и этот водный раствор после фильтрации используют для хроматографирования. Это типичный и наиболее простой пример первичной подготовки [106, 613]. В ряде работ [112, 135] водный концентрат подвергают дополнительной обработке и проводят осаждение водорастворимых примесей (пептиды, полисахариды и др.) путем разбавления водного раствора этанолом, метанолом илй ацетоном. Этот метод оказал большую услугу для отделения от водных растворов сапонинов, которые, солюбилизируя флавоноидные соединения, не давали возможности разделить их на капроне [47, 98]. [c.136]

Выбор ионита можно ускорить, если воспользоваться таблицами, в которых приведены характеристики ионитов различных типов, имеющихся в продаже (табл. 5.4—5.7). Более подробные таблицы приведены в работах [5, 25, 118, 123, 139]. Для разделения неорганических соединений пригодны ионообменные смолы (табл. 5.4) или неорганические иониты (табл. 5.7). Для хроматографирования низкомолекулярных ионогенных органических соединений (аминов и других оснований, кислот, аминокислот, пептидов, нуклеозидов, нуклеотидов) следует пользоваться ионообменными смолами. Однако они непригодны для анализа белков. Биополимеры (белки, нуклеиновые кислоты и их высокомолекулярные фрагменты) можно успешно разделять на ионообменных производных целлюлозы (табл. 5.5), полидекстрана и агарозы (табл. 5.6). Для высокоэффективной жидкостной хроматографии биополимеров предназначены биополимерные ионообменные производные макропористого стекла (табл. 5.6А) и гидрофильные макропористые оксиалкилмет-акрилатные полимеры (табл. 5.6Б). [c.251]

Техника получения бумажных хроматограмм была уже изложена в общих чертах выше. При хроматографировании аминокислот на бумаге было замечено (Консден и др., 1944), что аминокислоты вступают в реакцию с металлами (например, медью), которые способны образовывать соли с аминокислотами. Это обстоятельство мешает получению достаточно четких хроматограмм. Для устранения указанного дефекта к растворителям добавляют в небольшом количестве такие соединения, которые осаждали бы подобные металлы или образовывали с ними комплексные соедипепия. Такими добавками могут служить HgS, H N, NHg, а-бензоиноксим (купрон). Можно также предварительно обработать бумагу слабым раствором K4Fe(GN)g. Наиболее употребительными растворителями для бумажной хроматографии аминокислот и пептидов являются фенол и коллидин, предварительно насыщенные водой. [c.147]

Новым приемом в хроматографировании белков является использование в элюирующих растворах веществ, в сильной степени связывающих водород или вызывающих диссоциацию, как, например, мочевины и диметилформамида. Некоторые белки и крупные пептиды нерастворимы в концентрированных солевых растворах, или же их изоэлектрические точки лежат в зоне pH, используемой при хроматографировании. Разделение белков, имеющих близкие изоэлектрические точки, обычно улучшается при хроматографировании в зоне pH, близкой к их изоэлектрическим точкам [29]. В этих случаях добавление повышающих растворимость агентов, таких, как мочевина, может оказать хорошее влияние на разделение, если только при этом не происходит частичной денатурации белка. Обычно не учитывают, что диметилформамид является формили-рующим агентом [30], а также что концентрированные растворы мочевины могут содержать значительные количества реакционноспособных цианат-ионов. Необратимое инактивирование белков, вызываемое продолжительным выдерживанием белка в присутствии мочевины, обсуждалось Старком и др. [31]. [c.231]

Альмартецин, как показали результаты хроматографирования на бумаге, состоит из четырех пептидов, обладающих кислотными свойствами [615]. Разделение этих компонентов про- [c.246]

Хискот и др. [161] использовали слои целлюлозы для двумерного хроматографирования со смесями изопропанол—бутанол—1 н. соляная кислота (12 3 5) или -бутанол—бутанон— вода—аммиак (уд. масса 0,88) (80 5 17 3) для первого направления и 2-метил-2-бутанол—пропанон—метанол—вода—аммиак (уд. масса 0,88) (10 4 2 1 3 1) для второго направления. Пептиды обнаруживали реактивом Т-176. Бернс и Тернер [c.510]

Ричард [187] разработал методику двумерного разделения пептидов в одном направлении проводится хроматографическое разделение пробы, в другом — электрофорез. Адсорбентом служит силикагель G перед опытом предварительно выявляют лучший растворитель при разделении ферментативного гидролизата белков. Автор методики приводит список восьми систем растворителей. В качестве нейтральных систем можно использовать н-пропанол или 96 %-ный этанол и воду (7 3) в качестве основных систем — н-пропанол или 96 %-ный этанол и 34 %-ный гидроксид аммония (7 3) или хлороформ—метанол— 34 %-ный гидроксид аммония (2 2 1). К кислым растворителям относятся н-пропанол или 96 %-ный этанол—вода—уксусная кислота (7 2 1) или н-бутанол—вода—уксусная кислота (4 1 1). После выбора лучшего растворителя пробу подвергают хроматографическому анализу на тонкослойной пластинке размером 200x200 мм. Разделение предпочтительно вести методом восходящей хроматографии, однако при неудовлетворительном разделении можно прибегнуть и к непрерывному хроматографированию по методике Бреннера и Нидервизера [188] либо применить усовершенствованный прибор, описанный Ричардом. Пластинки затем удаляют и после 10-минутной сушки при 100 °С охлаждают и опрыскивают соответствующим буфе- [c.515]

Меррифилд и Вулли [1536, 1537], а также Тритч и Вулли [2321] более детально исследовали гидролизаты инсулина, обладавшие стрепогениновой активностью. В результате этих исследований им удалось выделить однородные пептиды, обладавшие высокой активностью. Гидролизаты инсулина были получены путем его частичного гидролиза концентрированной соляной кислотой в течение 20 час при 37°. Очистку и выделение пептидов проводили хроматографированием на ионообменных смолах. [c.345]

Конденсация фрагмента [Н (1 —2 )-6—8] с ранее описанным пентапептидом (Н 1—5) с помощью карбодиимидного метода привела с выходом 40% к разветвленному декапептиду [I (1 — 2 )-1—8], охарактеризованному количественным аминокислотным анализом и УФ-спектром. Формильную группу отщепляли действием 4 н. метанольного раствора НС1 в трифторуксусной кислоте или диметилсульфоксиде в течение 20 час при 20 [К ( —2 )-1—8] [2392]. Освободившуюся аминогруппу вновь количественно идентифицировали колориметрическим нингидриновым методом. Последующее омыление сложного эфира проводили обработкой 1,5-кратным избытком 1 н. едкого натра в диметилсульфоксиде в течение 20 час [L(l —2 )-1—8] образовавшуюся свободную карбоксильную группу определяли микротитрованием. Циклизацию синтезированного разветвленного декапептида осуществляли путем перемешивания при 20° раствора декапептида с 300-кратным избытком N, N -дициклогексилкарбодиимида в условиях высокого разбавления, причем выход неочищенного продукта реакции составил 20%. Защитные группы отщепляли действием натрия в жидком аммиаке. Полученный циклический пептид был очищен путем противоточного распределения (400 переносов вго/7-бутанол/0,1 н. соляная кислота) и хроматографирования на целлюлозном порошке (н-бутанол/ пиридин/ледяная уксусная кислота/вода, 30 20 6 24 м-бута-нол, содержащий 15% уксусной кислоты) с последующим обессоливанием на амберлите ШС-50 (ХЕ-64) в Н+-форме. [c.566]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология