Кривые титрования белков

Тот факт, что белки являются многовалентными кислотами и основаниями, определяет важное свойство их структуры. Значения рК кислотных групп в белках приведены в табл. 20,1. Значение р/С данной группы в белке меняется в широком диапазоне из-за влияния соседних частей белка, а также из-за электростатического действия зарядов на остаток молекулы белка. Если суммарный заряд молекулы белка положителен, как это имеет место в ряде кислотных растворов, то протону легче выйти из кислотной группы, и значения р/С понижаются. Если же суммарный заряд отрицателен, как в случае некоторых щелочных растворов, то протону труднее выйти из кислотной группы, и значения рК повышаются. Вследствие этого кривая титрования белка может быть более крутой, чем кривые титрования аминокислотных цепей. На каждом конце полипептидной цепи будет находиться а-карбоксильная или а-ами-ногруппа. Добавочные электрические заряды — это результат связывания ионов белком. В изоэлектрической точке число положительных зарядов равно числу отрицательных зарядов, так что в приложенном электрическом поле белок не движется. [c.602]

Составьте таблицу значений р/Са для кислых и основных групп, входящих в состав белка. Какие из этих групп больше всего влияют на кривые титрования белков [c.191]

Законы электростатики были с успехом использованы также при интерпретации кривых титрования белков, суммарный отрицательный или положительный заряд поверхности которых непрерывно меняется по мере роста числа присоединившихся протонов при переходе от высоких значений pH к низким [17]. [c.260]

Правда, в белке имеются различные кислые и основные группы, но формула (V. 5) остается приближенно правильной, если отнести значения Ка Кв наиболее сильным группам. Для полного определения молярного содержания различных ионо генных групп в белке и их констант диссоциации измеряют ход поглощения Н+ - и 0Н - ионов в широком интервале pH (примерно, pH 2—12), прибавляя к белковому раствору различные количества кислоты или щелочи и измеряя равновесное pH водородным или стеклянным электродом. При помощи этих кривых титрования белков определяют также максимальную емкость поглощения кислот и оснований, т. е. максимальное число зарядов на белковой молекуле. Например, для сывороточного альбумина человека при pH = 2 эта величина составляет 7]о = 100 элементарных зарядов на молекулу белка. [c.114]

Белки — полимеры аминокислот — являются полиэлектролитами. У макромолекулы белка много диссоциирующих кислотных и основных групп с различными значениями р/(. Так, например у р-лактоглобулина найдено ПО титрующихся групп на моль белка, т. е. приблизительно 7з аминокислотных остатков этого белка имеют ионную форму. В отличие от кривой титрования глицина, на которой имеются два перегиба в области pH = p/(i и рН = рК2, кривые титрования белков должны иметь множество перегибов. Большое количество перегибов на кривой титрования свидетельствует о том, что буферные свойства белков проявляются в широком диапазоне pH. [c.34]

Исходя из одних только теоретических соображений, получить уравнение, вполне удовлетворительно описывающее кривую титрования белка, невозможно. Для расчета кривой титрования белка часто пользуются следующим уравнением [c.104]

Уравнение (V. 4) часто используют при построении кривых титрования белков. В водных растворах при 25° х есть функция только ионной силы л(к = 0,33 и приведенное выше выражение для со приобретает вид [c.105]

Штриховая кривая на рис. 177 представляет попытку достигнуть соответствия с данными [рассчитанными по уравнению (31-8) для 1 и аа] с помощью уравнения (31-12). Мы видим, что в щелочной области достигается хорошее соответствие. Это объясняется тем, что предполагаемая кривая титрования белка в этой области pH имеет очень плоскую форму, так что 2 мало меняется с изменением pH. Однако в кислой области уравнение (31-12) дает значения, сильно отличающиеся от результатов, полученных с помощью точных уравнений. Следует заметить, что экспериментальные значения А" ) и /С отличаются от истинных характеристических констант по обе стороны. [c.654]

Перейдем теперь к кривым титрования белков. Как уже указывалось, такие кривые используются в первую очередь для определения числа различных ионогенных групп в белке. При этом следует учитывать, что измеренное значение рК некоторой группы в белковой глобуле может отличаться от значения рК аналогичной группы в одноосновном электролите из-за взаимодействия с остальными ионизованными группами белка. Как видно из приведенных выше значений рК ионогенных групп белковой молекулы, суммарный заряд молекулы положителен в области низких значений pH и отрицателен в области больших значений. Благодаря суммарному заряду молекулы наблюдаемые значения рК уменьшаются (за счет члена в фор- [c.35]

Типичная кривая титрования белка приведена на рис. 10. По оси ординат отложено число ионов [Н+], связанных с молекулой белка, при двух способах выбора начала отсчета. На правой шкале отсчет ведется от числа ионов [Н ], связанных молекулой в изоионной точке, в которой суммарный заряд молекулы равен нулю на левой шкале — от максимального числа связанных ионов [Н+] , определяемого по плато кривой титрования в области низких значений pH. Конец титрования в щелочной области (пунктир на рис. 10) обычно не удается хорошо определить, так как он лежит при значениях pH выше тех, при которых производятся измерения. [c.35]

Для разделения кислотной и нейтральной ветвей кривой титрования белка используется зависимость кривых титрования от температуры, характеризуемая теплотой диссоциации [c.36]

При помощи кривых титрования белков определяют также максимальную емкость поглощения кислот и оснований, т. е. максимальное число зарядов на белковой молекуле. Например, для сывороточного альбумина человека при pH 2 эта величина составляет По = 100 элементарных зарядов на молекулу белка. [c.102]

На фиг. 22 приведена типичная кривая титрования белка, на которой горизонтальными отрезками указаны средние диапазоны р/( для различных ионогенных группировок белков. Следует заметить, что эти диапазоны [c.213]

Фиг. 22. Типичная кривая титрования белка и наиболее вероятные пределы значений рК для ионогенных группировок, в скобках указаны приближенные значения теплот ионизации этих группировок в ккал/моль.

В заключение необходимо отметить, что при интерпретации кривых титрования белков возникает ряд трудностей, зависящих от целого ряда обстоятельств. Так, белки содержат очень большое число ионогенных групп, связывающих и отдающих протоны. Кривые титрования показывают, что на 1 г белка требуется около 1 ммоля кислоты и 1 ммоля основания. При молекулярном весе белка порядка 100 000 на одну белковую молекулу приходится, следовательно, около 100 кислых и 100 основных, групп. Однако точно установить число тех или иных основных групп затруднительно, поскольку на кривой титрования имеется некоторое перекрывание в области pH между 8 и 12. Следовательно, pH 8,5 принимается в качестве конечной точки нейтрализации а-аминогрупп и имидазольных групп до некоторой степени произвольно. На характере кривой титрования сказывается и взаимодействие белков с другими ионами, кроме водородных. В частности, белки образуют прочные связи с такими двухвалентными ионами, как ионы кальция, магния, фосфата и карбоната, а также одновалентными ионами хлора. Как уже говорилось, такое взаимодействие приводит к сдвигу изоионной точки и изменению электрохимических свойств белка-за счет нейтрализации ионогенных групп, что приводит к искажению-кривой титрования. Сдвиг изоионной точки особенно велик тогда, когда в растворе находятся ионы фосфатов, которые наиболее прочно связываются основными группами. [c.163]

Кривые титрования белков. Реакции белков с кислотами и щелочами играют важную роль в физиологии. Как уже отмечалось, около 80% буферной емкости цельной крови обязано присутствию белка. Помимо этого,. [c.158]

Белки и диффузный двойной слой. Абрамсон указал, что должна существовать связь между электрофоретической подвижностью белка кривой титрования белка он сформулировал следующее правило В растворах с одинаковой ионной крепостью электрическая подвижность данного белка при различной активности водородных ионов должна быть прямо пропорциональна числу связанных белком водородных (гидроксильных) ионов . Он указал, что молекула белка в растворе может рассматриваться как две концентрические сферы, из которых внутренняя сфера представляет поверхность молекулы белка, а внешняя сфера — распределение центров тяжести зарядов в диффузном ионном слое. Для этого случая [c.218]

Если толкование данных электрометрического титрования аминокислот и простых пептидов относительно несложно, то при интерпретации кривых титрования белков возникает ряд трудностей, зависящих от следующих обстоятельств. [c.83]

Используя уравнение (4.51), можно выявить диссоциирующие группы в белка.х или в аминокислотах и установить их число. Основываясь на известных характеристиках различных функциональных групп, можно по кривым титрования белка, полученным при двух температурах, определить число карбоксильных, имидазольных и других интересующих нас групп [19]. [c.248]

Применяют кислотно-основное титрование для определения рКа аминокислот и рКа диссоциирующих групп, входящих в белки. По кривым титрования белков, полученным при двух различных температурах, можно определить число карбоксильных, имидазольных и других групп. Титрование аминокислот и белков дает возможность определить их изоэлектрические точки. [c.120]

Ранее уже отмечалось, что белковые молекулы перемешаются в электрическом поле (при любом pH, кроме изоэлектрической точки). Методы, основанные на этом свойстве белковых молекул, широко используются прн изучении смесей белков. По кривой титрования белка можно составить представление о суммарном электрическом заряде молекулы при любом pH. Так как скорость перемещения молекулы в электрическом поле в значительной степени определяется ее суммарным зарядом, электрофоретическая подвижность белка зависит от pH, как, впрочем, и степень ионизации молекулы. На рнс. 5.22 приведены электрофоретическая подвижность и кривая титрования кристаллического яичного альбумина. Хотя форма и размеры молекулы оказывают влияние на абсолютную скорость перемещения в электрическом поле, определяющим фактором является все же суммарный заряд. [c.161]

Кривые титрования белков, являющихся полиамфолитами, имеют плавный характер, часто без заметных перегибов. Это обусловлено различными причинами. Макромолекулы белков содержат обычно несколько типов как основных, так и кислотных групп, каждый из которых имеет свое значение рК и характеризуется своей точкой перегиба на кривой титрования. Но даже одному типу групп соответствует несколько значений р/С в зависимости от окружения этих групп на поверхности или внутри белковой глобулы. Наконец, описанные выще электростатические эффекты, которые приводят к сглаживанию кривых титрования поликислот (или полиоснований), действуют так же и в случае полиамфолитов. [c.127]

Подобно аминокислотам, белки сочетают в себе как кислотные, так и основные свойства. Являясь амфотерными полиэлектролитами, белки тем не менее существенно отличаются от свободных аминокислот, кислотно-основные свойства которых обусловлены а-амино- и а-карбоксильными группами. В белках основной вклад в формирование кислотно-основных свойств вносят заряженные радикалы аминокислотных остатков, расположенные на поверхности белковой глобулы. Основные свойства белков связаны с такими аминокислотами, как аргинин, лизин или гистидин, а кислые — с аспарагиновой и глутаминовой аминокислотами. Что касается а-аминных и а-кар-боксильных групп аминокислот, то их ионизация не имеет существенного значения, так как подавляющее их число участвует в образовании пептидных связей. Кривые титрования белков достаточно сложны для интерпретации. Это связано, во-первых, с наличием большого числа титруемых групп, а также с тем, что рА для каждой титруемой группы в белке может существенно отличаться от таковой в аминокислоте. Это связано с электростатическими взаимодействиями между ионизированными группами белка, наличием близко расположенных гидрофобных остатков, а также влиянием водородных связей. [c.52]

Интерпретация кривых титрования белков сложна и не всегда однозначна. Эхо обусловлено двумя причинами. Во-первых, в каждой молекуле белка обычно содержится большое число титруемых групп (в среднем на 100 ООО единиц молекулярного веса приходится от 50 до 60 таких групп). Во-вторых, значения рйГц для каждой из титруемых групп в белках могут заметно отличаться от соответствующих значений рй для свободных аминокислот (см. табл. 8). Так, например, в белке, содержащем 10 остатков аспарагиновой кислоты, каждая из р-карбоксильных групп этой аминокислоты характеризуется своим особым значением рЛТ (варьирующим в пределах от 3 до 6). Такие различия в величине рЛГ для одних и тех же групп в белках (или в других заряженных макромолекулах) обусловлены главным образом тремя причинами 1) электростатическими взаимодействиями с другими ионизиро- [c.70]

Кривые титрования нуклеиновых кислот, казалось бы, должны выглядеть проще, чем кривые титрования белков, так как нуклеиновые кислоты содержат менее разнообразные титруемые группы. Однако форма этих кривых усложняется вследствие необратимых изменений. Некоторые типичные кривые, полученные Пикоком и сотрудниками для препарата дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), показаны на рис. 173. [c.640]

ИЗОИОИНАЯ ТОЧКА (изопротонная точка) — концентрация водородных ионов в растворе белка, при к-рой белок поглощает из раствора одинаковое количество ионов Н+ и ОН. Это определение приложимо не только к белкам, но и к другим амфотерным полиэлектролитам, напр, к полилизин-полиглутаминовой к-те, к сополимерам акриловой к-ты и 2-винилпиридина и др. Вследствие равного поглощения обоих видов ионов белок или другой амфотерный полиэлектролит при внесении в такой раствор не изменяет его pH, что является одним из методов экспериментального определения И. т. Дру-гой метод онределения И. т. заключается в том, что к белковому р-ру добавляют различные количества кислоты или щелочи и измеряют равновесное pH водородным или стеклянным электродом. По кривым титрования белков измеряют ход поглощения ионов Н и ОН" в зависимости от pH и определяют значение pH, при к-ром поглощение обоих ионов равно нулю (кривая поглощения пересекает ось pH). [c.74]

Перейдем теперь к кривым титрования белков. Как уже указывалось, такие кривые используются в первую очередь для определения числа различных ионогенных групп в белке. При этом следует учитывать, что измеренное значение рК некоторой группы в белковой глобуле может отличаться от значения рК аналогичной группы в одноосновном электролите из-за взаимодействия с остальными ионизованными группами белка. Как видно из приведенных выше значений рК иоиогенных групп белковой молекулы, суммарный заряд молекулы положителен в области низких значений pH и отрицателен в области больших значений. Благодаря суммарному заряду люлекулы наблюдаемые значения рК уменьшаются (за счет члена 0в формуле (22)) в области низких pH и увеличиваются в области больших pH. Сдвиг рК за счет электростатических взаимодействий может достигать 1,5. Электростатическое взаимодействие одинаковых титруемых групп (член 0,868 и а,п,- в формуле (22)) приводит к размытию областей титрования этих групп. [c.35]

Остановимся теперь на изучении электрохимических свойств белков. Мы уже упомипалп, что макромолекулы белков, как правило, несут па себе заряд. Результирующий суммарный заряд белковой макромолекулы представляет собой разность полон<и-тельных зарядов боковых групп лизина, аргинина, гистидина, а также концевых аминогрупп и отрицательных зарядов, которые несут боковые радикалы глютаминовой и аспарагиновой кислот, тирозина и цистеина, а также концевые карбоксильные группы полипептидных цепей. Так как все эти группы, как положительные, так и отрицательные, относятся к классу слабых оснований и кислот, то степень их диссоциации сильно зависит от pH. В принципе можно охарактеризовать каждый тип боковых групп своей константой диссоциации K или своей величиной показателя и можно ожидать, что, снимая кривую титрования белка, мы найдем ряд значений рН , при которых на кртшй титрования [c.123]

Если значение й сохраняется постоянным при помо щи ряда буферов различного pH, но имеющих одинаковую ионную силу, то подвижность сферической молекулы белка будет прямо пропорциональна заряду. Обычно, как мы видели, подвижность является функцией как заряда, так и толщины двойного слоя. Свободный заряд на молекуле белка в первом приближении равен сумме связанных водородных или гидроксильных ионов. Эти данные могут быть получены из кривой титрования белка кислотами и основаниями. Абрамсон сравнил заряд, вычисленный по уравнению (43), с зарядом, вычислент ным по кривой титрования, и получил хорошее совпадение. Лонгсвортс также показал пропорциональность между подвижностью и кривой титрования яичного альбумина в интервале pH от 3 до 12. Аналогичные результаты для р-лактоглобулина получены Каннаном, Пальмером и Кибриком. [c.219]

Во всех случаях химической модификации белка, при которых происходят удаление, введение, превращение или замещение заряженных групп, кривая титрования белка обязательно изменяется. Этот способ исследования является одним из основных методов установления природы ионизирующихся групп белка. [c.345]

Одним из затруднений является нерастворимость некоторых производных белка. Это приводит к необходимости титрования в гетерогенной среде, что дает неясные результаты. О влиянии формальдегида на те участки кривых титрования белков, которые расположены в щелочной области, было уже упомянуто выше вопрос этот рассмотрен также в статье IV т. II. При дезаминировании белков <=.-аминогруппа лизина превращается в алифатическую гидроксильную группу, которая не реагирует с кислотами и основаниями. При дезаминировании желатины конечная кривая титрования обнаруживает почти полную потерю групп, титрующихся в интервале рН 8,5—12, и смещение изоэлектрической точки в кислую сторону однако та часть кривой, которая соответствует карбоксильным группам, повидимому, не изменяется [155, 156]. Эти результаты давно уже привели к выводам, имеющим важное значение для интерпретации кривых титрования белков [157]. Поведение карбоксильных групп также можно было бы изучить, блокируя их путем обработки кислым раствором метилового спирта, что обеспечивает полную и специфическую этерификацию. Указанный метод был применен к инсулину, однако неизмененный гормон, к сожалению, осаждается как раз в области рК карбоксильных групп. Тем не менее Моммертс и Нейрат [84] нашли, что подавление буферного действия до нуля, указывающее на полное отсутствие титруемых карбоксильных групп, достигалось только в том случае, когда содержание метоксильных групп соответствовало исходному количеству карбоксильных групп. Таким образом, кривые титрования измененных белков можно использовать для оценки природы и числа ионизирующихся групп в исходном белке или для расчета количества введенного группоспецифического реагента. [c.346]

Во второй категории имеет место тот случай, когда комбинация металла с белком меняет свойства последнего. Если металл объединяется с белковой молекулой, то следует ожидать, что общий заряд комплекса будет отличаться от заряда, первоначально присущего белку. Такое изменение заряда может непосредственно влиять чисто электростатическим путем на сродство фермента к субстрату. Электростатический эффект может проявляться и иначе. Известно, например, что кривые титрования белков заметно изменяются после их связывания с металлами. В результате связывания группы, определяющие каталитическук> активность, могут иметь кривые диссоциации, заметно сдвинутые вдоль шкалы pH. Электростатический эффект связанного в комплекс металла может влиять на равновесие между мономерной и димерной формами ферментов (2Ф Фг). Если, например, Ф заряжен отрицательно, то комбинация с катионом должна способствовать образованию Фг. Если Фг — энзиматически активная форма, то присутствие металла должно увеличивать активность. [c.38]

В заключение следует упомянуть о таком способе анализа белков, когда в первом направлении пластины геля ведут фокусирование одних только амфолитов, т. е. формирование градиента pH. Затем в такой пластине проводят электрофорез белков в перпендикулярном направлении. Таким способом можно подобрать оптимальное значение pH для электрофоретического разделения смеси белков или провести анализ изменения подвижности данного белка в геле в зависимости от pH. Препараты для разделения во втором направлении можно наносить раздельно, и тогда миграция будет идти в параллельных треках при различных, изменяющихся от трека к треку значениях pH. Исходный препарат можно нанести и одной полоской поперек всего градиента pH. В этом случае будут получены кривые сигмоидного вида, содержащие информацию того же типа, что и кривые титрования белков. В частности, по ним можно обнаружить различия в аминокислотном составе различных вариантов одного белка [Gianazza et al., 1980]. [c.60]