Методы лизиса клеток

В табл. 4.1 приведен метод эффективного лизиса клеток ли-зоцимом и дезоксихолевой кислотой (ДОХ). Клетки Е. oli, способные продуцировать рекомбинантные белки, переходящие в цитоплазме в нерастворимое состояние, могут приобрести устойчивость к лизису. Такое явление наблюдалось при выработке клетками Е. соИ активатора тканевого плазминогена [13]. При этом для достижения эффективного лизиса пришлось увеличить соотношение объемов лизирующего буфера и клеточной массы с 3 1 до 9 1. [c.99]

Для выделения нуклеиновых кислот из клеток обычно применяют мягкие методы их разрушения, включающие использование детергентов и лизоцима, хотя для разрушения некоторых микроорганизмов с прочными клеточными стенками может понадобиться пресс, стеклянные бусы или растирание клеток с абразивами (см. раздел 8.1.2). В некоторых случаях для ослабления клеточных стенок в растущие культуры (например, грамположительных бактерий) добавляют глицин, лизин или треонин. Иногда для тех же целей клетки грамположительных бактерий в растущих культурах обрабатывают антибиотиками, такими как пенициллин С или ме-тициллин, которые подавляют биосинтез пептидогликана клеточной стенки. Чувствительность к лизоциму микобактерий, содержащих высокий процент липидов и полисахаридов в клеточной стенке, может быть усилена их обработкой изопропанолом. При лизисе микроорганизмов, имеющих особенно прочные клеточные стенки, применяют поли(этиленгликоль) с последующим удалением из лизата, так как его присутствие мешает проведению дальнейшей очистки ДНК- [c.143]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

При попытках построения генетических карт бактерий для больших участков хромосомы необходимо измерять вероятность вхождения w x). Для этого были предложены различные методы. Один из них использует явление зиготной индукции профага. При конъюгации мужской клетки, несуш,ей профаг, т. е. лизогенной, и женской, нелизогенной, происходит часто переход профага в вегетативную форму и лизис клетки. Причина зиготной индукции в том, что генетическое веш,ество бактериофага попадает с отцовской хромосомой в материнскую клетку, которая не лизогеннаи, следовательно, чувствительна к фагу. Если конъюгировать клетки Н г(Л.+) с клетками Г (Я,"), отбирать в разные моменты времени пробы и засе- вать их на чашках Петри так, как это делается при титровании бактериофага [c.337]

Для количественного определения нуклеиновых кис лот в культурах бактерий по описанным ниже методи кам необходимо, чтобы клетки присутствовали в доста точном количестве в среде, не мешающей определению или чтобы их можно было собрать из ростовой среды отмыть от компонентов среды, мешающих определению и ресуспендировать в нужной концентрации в отсутст вие лизиса бактерий или гидролиза нуклеиновых кислот нуклеазами. Важным условием для точного определения содержания в них нуклеиновых кислот является полная экстракция нуклеиновых кислот из клеток. [c.334]

Теперь мы уже вполне подготовлены к тому, чтобы приступить к вопросу, поставленному в гл. VU, а именно к вопросу о молекулярном механизме возникновения тех изменений в последовательности нуклеотидов ДНК, которые приводят к мутациям. Действительно, исследование характера возникновения мутаций Т-четных фагов с использованием методов генетического анализа с высоким разрешением дает большие возможности для проникновения в природу мутационного процесса. Использование фагов имеет еще одно важное преимущество по сравнению с ис-лользованием бактерий. Мутации фаговой ДНК можно изучать как в том случае, когда она находится в состоянии покоя вне клетки в составе инфекционной фаговой частицы, так и когда она находится в реплицирующемся, внутриклеточном, вегетативном состоянии. Уже самые первые исследования Херши и Лурия показали, что частота спонтанных мутаций в покоящейся ДНК очень мала — столь мала, что в течение многих лет считалось (как потом оказалось, ошибочно), что внеклеточные фаговые частицы вообще не мутируют месяцами и даже годами. Таким образом, новые мутации появляются в основном во время вегетативного размножения фага в клетке-хозяине. Рассмотрим следующий пример. Культуру Е. oli заражают препаратом фага Т2/- с титром 10 частица/мл. Фагу дают размножиться в течение нескольких циклов, пока все бактерии в культуре не подвергнутся лизису, а титр фага не достигнет величины 10 частица/мл. Оказывается при этом, что с каждым циклом размножения доля г-мутантов во всей популяции фагов увеличивается (примерно с 10" в начале до 10 в конце). Следовательно, мутанты фага возникают в результате ошибок копирования при внутриклеточной репликации его генетического материала. Репликация ДНК родительского фага является очень точным процессом. И все же при репликации иногда происходит ошибка, порождающая в одной из вегетативных реплик изменение последовательности нуклеотидов, или мутацию. Мутантная реплика генетического материала включается затем при созревании в инфекционную фаговую частицу, которая в свою очередь заражает новую бактериальную клетку. В этой клетке очень точно копируется уже измененная информация, содержащаяся в мутантной частице поэтому все потомство такой частицы оказывается тоже мутантным. Поскольку репликация ДНК вегетативного фага происходит в соответствии с постулированным Уотсоном и Криком полуконсервативным механизмом, размножение фагового генома можно рассматривать как процесс бинарного деления и с точки зрения статистического анализа совершенно аналогичным процессу размножения генома бактерий. Следовательно, уравнение, связывающее долю мутантных особей п среди общего числа N потомков одного исходного родителя, возникших после g генераций, с частотой мутаций а [c.315]

При выделении ДНК используются органические растворители. В основе метода лежит лизис неядерных клеток крови (эритроцитов) под действием раствора хлорида и цитрата натрия (IX SS ). После удаления разрушенных неядерных клеток белые клетки крови лизируют доде- [c.102]

В основе этого метода лежит наиболее старая форма иммуноферментного анализа — комплемент-зависимый лизис эритроцитов. Эритроциты-мишени сенсибилизируются иммуноглобулином в такой форме, которая не связывает комплемент. Пробы, которые содержат ревматоидный фактор, связывающийся с сенсибилизированными клетками, могут быть обнаружены по лизису эритроцитов в присутствии комплемента. Этот тест наиболее чувствителен к ревматоидным факторам IgM-класса, но с помощью соответствующих модификаций (они будут обсуждаться ниже) можно увеличить его чувствительность и по. отношению [c.315]

Из числа умеренных колифагов наиболее подробно изучен фаг "к. Путем изучения развития вируса в ходе лизиса клетки (использовали целый ряд мутантов с супрессорно-чувствительными, условнолетальными, бессмысленными мутациями, выделенными Кэмпбеллом [60]) в геноме фага X удалось идентифицировать пе менее 18 генов. Этими методами было показано, что гены от Л до F ответственны за функции, связанные с синтезом белка фагового отростка, а гены от G до / отвечают за формирование головки. Ген i кодирует фаговый лизоцим [62]. Все эти гены, таким образом, попадают в категорию поздних генов в отличие от ранних генов , таких, как ген N, детерминирующий репликацию ДНК. Была проделана большая работа по выяснению роли этих различных генов и последовательности их транскрипции. Установлено, что разные гены транскрибируются с одного или с другого конца цепи и транскрипция таким образом идет в противоположных направлениях (фиг. 72) [496]. [c.278]

Инфекционность облученных нуклеиновых кислот была изучена в экспериментах с ДНК и РНК, изолированных из бактериофагов. Термином инфекционность обозначают способность вирусной ДНК или РНК индуцировать образование бактериальной клеткой новых полноценных фагов. Методически эксперимент выглядит так бактерии обрабатывают лизоцимом, и они теряют часть клеточной стенки — образуются сферонласты, которые можно инфицировать нуклеиновой кислотой, выделенной из бактериофага. Если в инфицированной бактерии возникают новые полноценные фаги, то бактериальная стенка разрывается и из лизировавшей бактерии высвобождается 100—200 бактериофагов количество вирусных частиц, высвободившихся из лизированных сферопластов, в определенных пределах пропорционально количеству молекул ДНК или РНК, сохранивших инфекционные свойства. Так как высвободившиеся фаги лизируют новые сферопласты вблизи места своего -возникновения, то на сплошном газоне бактериальных клеток, выращенных на агаре, образуется пятно лизиса — бляшка (количество бляшек можно подсчитать визуально), — их число служит количественным критерием инфекционности вирусной нуклеиновой кислоты. Этим методом определяют инактивацию вирусной ДНК в результате облучения. Результаты одного из таких экспериментов приведены на рис. 1П-3. [c.63]

Как было отмечено в разд. III, при типировании сывороток анти-Н-2 любым методом необходимо ставить контроли. В любом случае включают контроль среды и комплемента (чтобы исключить возможность лизиса, обусловленного средой, комплементом или сочетанием обоих этих факторов). И наконец, в качестве контроля специфичности реакции и активности комплемента вводят активную сыворотку анти-Н-2 известной специфичности и титра. Кроме этих внутренних контролей, необходим контроль клеток-мишеней, используемых в опыте, с помощью известной сыворотки анти-Н-2, взятой для сравнения с испытуемой специфичность испытуемой сыворотки контролируют также клетками-мишенями другой Н-2-специфичности. Обычно используют клетки двух типов [c.227]

Сообщение Д Эрреля вызвало сенсацию среди медицинских микробиологов, поскольку он высказал идеи о роли фагов в развитии естественного иммунитета и об их использовании в борьбе с инфекционными болезнями. Несмотря на такие весьма ошибочные заявления, Д Эррель довольно близко подошел к современному представлению о фагах. С самого начала своих исследований Д Эррель считал, что фаги — это особые невидимые фильтрующиеся, самовоспроизводящиеся вирусы, облигатно паразитирующие на бактериях. В течение двух-трех лет со времени своего открытия он разработал метод точного подсчета, или титрования, фагов, а к 1923 г. он описал их жизненный цикл следующим образом фаговые частицы прикрепляются к поверхности бактерии и затем проникают в клетки, где они размножаются, образуя потомство многих вирусных частиц. После разрушения, или лизиса, клетки эти частицы выходят в окружающую среду вполне готовыми к новому заражению. [c.252]

II. Отторжение красителя. К прижизненным красителям, используемым для оценки целостности мембран, относят трипановый синий, эозин V, нафтоловый черный, нигрозин (зеленый), эритрозин В и зеленый прочный. Для оценки жизнеспособности более надежным способом является окрашивание клеточных суспензий, поскольку при окрашивании прикрепленных клеток они могут открепляться от субстрата и теряться. Главным недостатком этого метода является невозможность выявления клеток с нарушенной способностью к размножению. Так, было показано, что клетки, не способные к клонообразованию, характеризуются 100%-ной выживаемостью при тестировании на отторжение красителя [34]. Метод, однако, удалось обновить, и введенные в него технические усовершенствования позволили в какой-то степени разрешить присущие ему проблемы. В методе, предложенном Вейзенталем с сотрудниками [35], выбран 4-дневный период исследований, в течение которого клетки с нарушенной способностью к размножению теряют целостность мембран. Артефакты, связанные с размножением жизнеспособных клеток или лизисом погибших клеток, корректируются путем добавления в суспензию фиксированных утиных эритроцитов в качестве внутреннего стандарта. При сравнении трех методов анализа подсчет клеток, определение жизнеспособных клеток и определение отношения числа жизнеспособных клеток к числу эритроцитов — выявляется повышенная чувствительность последнего метода (рис. 8.5). Этот метод с равным успехом был применен к солидным опухолям, клеткам выпотов и злокачественным клеткам крови. [c.270]

Поступление ионов Ag+ можно обеспечить растворением солей серебра, контактом воды с металлическим серебром, посеребренными зернами кварца. Наиболее эффективным методом обогащения воды серебром является электрохимическое растворение серебряного анода. Преимущество соединений серебра перед остальными обззараживающими реагентами заключается в том, что их бактерицидное действие сохраняется в течение длительного времени, т. е. они являются одновременно и консервантами. Воздействие серебра на микробиальную клетку осуществляется в два этапа. Сначала происходит сорбция серебра на поверхности клетки, затем наблюдается проникновение его в клетку, что ведет к инактивации ферментов. Соединения серебра вызывают у кишечной палочки лизис цитоплазмы, повреждение нуклеотидов и отторжение содержимого клетки от оболочки. Бактерицидное действие серебра проявляется при концентрации его в воде более 0,04 мг/л. При концентрации серебра 0,1—0,2 мг/л кишечная палочка отмирает через 40—50 мин. Эффективность действия реагента зависит также от дозы вводимых ионов Ag+ и времени контакта с водой. Полное обеззараживание достигается при двухчасовом контакте. Доза вводимого серебра колеблется от 0,04 до 0,2 мг/л. [c.157]

Несколько лет назад я отмечал, что выделение ДНК из спермы рыб резко падает после облучения электронами, если для очистки использовать метод с детергентом (додецилсульфат натрия) [20]. Со временем мы склонились к мнению, что эти потери связаны с образованием сшивок между молекулами ДНК- Однако последующие наблюдения показали, что обработка спермы облученной рыбы трипсином уничтожила разницу в количестве выделенной ДНК, хотя количество белка должно быть очень малым [21]. Было высказано предположение, что аналогичные потери нуклеиновой кислоты в результате сшивок с белком можно вызвать ультрафиолетовым излучением. О таком эффекте сообщается в двух работах. Smith [и] нашел, что если облучать культуры Е. соИ и клетки экстрагировать с детергентом (додецилсульфат-натрия), то количество выделенной ДНК заметно уменьшается с увеличением дозы ультрафиолетового излучения (рис. 3) [22]. Автор проверил, что это не было связано с нарушением лизиса клеток. Можно видеть, что такой эффект выражен значительно сильнее, чем образование димеров тимина. Smith указывает, что этот эф- [c.122]

Разрушение (лизис) клеточных стенок с применением детергентов и ферментов проводят обычно с небольшими порциями биомассы, причем эти методы дают более стандартную обработку для каждой клетки в суспензии, так как концентрации детергентов и ферментов практически одинаковы в любой порции пробы. Как правило, время лизиса не превышает 15—30 мин Рассмотрим этот метод на примере Es heri hia oil. Для лизирования клетки суспендируют в ТЕ-буфете (50 мМ трис-НО.. pH 8,0 и 10 мМ. ЭДТА) из расчета 3 мл буфера на 1 г сырой биомассы и нагревают до 37°. Добавляют 1 мл раствора лизоцима (свежеприготовленный раствор в ТЕ-буфере, 10 мг/мл) на каждые 5 мл суспензии ил эквивалентное количество сухого лизоцима и инкубируют 10— 20 мин при 37° с легким покачиванием. Быстрее клетки лизируются при повышении действующей концентрации лицозима до 10 мг/мл. В таких условиях удовлетворительного лизиса можно достичь в течение 5 мин даже при 4°. [c.137]

Молекулярное клонирование [34, 39]. Ключевым методом явилось молекулярное клонирование фрагментов ДНК, или генная инженерия в узком смысле слова. Этот метод, впервые описанный П. Бергом в США, позволяет нарабатывать большие количества любого отрезка ДНК, встраивая его в ДНК бактериальной плазмиды или бактериофага и заражая такой рекомбинантной ДНК бактерию-хозяина. Чаще всего в плазмиду или фаг встраивают либо фрагменты эукариотической геномной ДНК, либо кДНК, полученную в результате обратной транскрипции мРНК. Когда работают с плазмидами, то обычно используют такие, которые несут ген устойчивости к какому-либо антибиотику В результате на среде с антибиотиком растут и дают колонии лишь те бактерии, в которые проникли рекомбинантные плазмиды. Когда работают с фагом, то следят за возникновением бляшек, т. е. очагов размножения фага, ведущего в лизису (разрушению) бактерий. Каждая колония или бляшка, полученная из одной исходной клетки, содержит один тип плазмиды [c.30]

Для секвенирования ДНК по методу Сэнгера ее клонируют в однонитевых фагах. Основа метода Сэнгера — синтез радиоактивных копий однонитевой ДНК от фиксированного олигонуклеотида-затравки в присутствии нуклеотидспецифичных терминаторов синтеза ДНК. Чтобы облегчить выделение однонитевых матриц, Дж. Мессингом сконструирована серия векторов на основе фага М13, содержащего в капсидах однонитевую ДНК. Биология размножения М13 чрезвычайно удобна для создания таких векторов. М13 реплицируется в клетке в виде двунитевой репликативной формы, которую можно легко выделить и использовать для клонирования чужеродной ДНК как обычную плазмидную ДНК. В то же время такие рекомбинантные клоны выделяют и из суспензии зрелых частиц фага в однонитевой форме. Сконструированные Мессингом векторы содержат полилинкер, т. е. последовательность, являющуюся мишенью для нескольких рестриктаз, для клонирования ДНК в области фагового генома несущественной для его размножения кроме того, при вставках чужеродной ДНК изменяется цвет фаговых негативных колоний (пятен лизиса на газоне бактериальной культуры) на среде с индикаторным красителем. Для секвенирования олигонуклеотид- [c.285]

Розеточные методы [4—8] фиксация антимышиных иммуноглобулинов на эритроцитах быка (с помощью хлорида хрома) и обработка в розетках выделяемыми клетками, предварительно покрытыми специфическими моноклональными антителами (продуцируемыми мышиной гибридомой) выделение связавшихся клеток достигается селективным лизисом эритроцитов. [c.247]

Штамм %1776 бьш сконструирован специально для работы с рекомбинантными ДНК в ответ на выраженное некоторыми учеными беспокойство о возможной опасности этих экспериментов. С помощью стандартных генетических методов в ДНК бьша внесена мутация (dap), в результате которой клетки могли синтезировать клеточную стенку только в тех случаях, когда в среду добавляли существенный ее компонент—редкую диаминопимелино-вую аминокислоту. Эти и другие мутации, приводящие к повреждению белков, необходимых для образования клеточной стенки, делают клетки %1776 очень чувствительными к некоторым антибиотикам и к лизису солями желчных кислот (в кишечнике животных) и ионными детергентами. Эта же чувствительность приводит к необходимости использовать специальные процедуры для проведения успешной трансфекции. [c.229]

Этот метод применим для клеток с тонкой стенкой или лишенных ее, а также для лизирования протопластов и сферопластов микроорганизмов. Нагруженные высокой концентрацией соли или углеводов клетки подвергают ферментативному лизису в присутствии лизоцима и затем разводят в 10—50 раз дистиллированной водой. Действующие концентрации в значительной степени зависят от свойств исследуемого внутриклеточного фермента, вида микроорганизма, соединения, примененного для создания высокого осмотического давления внутри клеток и других факторов. [c.138]

Ha рис. 12.7 представлены типичные результаты измерений упруговязкой релаксации ДНК. Обратите внимание на чрезвычайно большие времена релаксации молекул, массы которых составляют 10 и более а.е.м. Отличное согласие с экспериментом, полученное для ДНК с известными молекулярными массами, показывает, что формула (12.34) правильна. Данный метод с успехом использовали для определения молекулярных масс ДНК вплоть до зничений, близких к Ю . Гигантские молекулы ДНК с такой молекулярной массой (примером которых могут служить молекулы, выделенные из целых развернутых хромосом бактерий или эукариот) настолько непрочны, что их невозможно даже переместить из одного сосуда в другой. Для того чтобы их исследовать, необходимо клетки, содержащие такую ДНК, подвергнуть лизису непосредственно в ротационном вискозиметре и освободить ДНК in situ от связанных с ней белков посредством обработки детергентами и ферментативного расщепления. Для смешивания этих реагентов с клеточным лизатом можно использовать только конвекцию, поскольку любое перемешивание недопустимо. Естественно, приходится ограничиваться очень малыми скоростями ротора, чтобы уменьшить вероятность разрыва молекулы в градиенте скорости. Угол, на который повернется ротор за промежуток времени между включением вращающего момента и началом процесса релаксации, должен быть минимальным это всегда менее одного оборота. [c.282]

В агар добавляют также большой избыток тех же эритроцитов. Агар разливают тонким слоем в чашки Петри и инкубируют последние 1 ч при 37° С. За этот срок ан-тителопродуцирующие клетки секретируют некоторое количество антител, которые присоединяются к окружающим клетку эритроцитам. Затем на чашки наслаивают раствор комплемента и снова инкубируют их прп 37° С. Комплемент диффундирует в агар и, связываясь эритроцитами, сенсибилизированными антителами, вызывает их лизис. При просмотре чашек невооруженным глазом будут видны круглые зоны просветления в агаре, число которых соответствует числу антителопродуцирующих клеток. Метод может быть применен для определения клеток, продуцирующих антитела против самых разнообразных антигенов. Антигены или гаптены при этом фиксируют на иоверхностп эритроцитов, засеваемых в агар. После связывания антител против соответствующего антигена эритроциты в присутствип комплемента лизируются (так называемый пассивный гемолиз). [c.260]

Изящный метод отбора колоний микроорганизмов или клеток в культуре, продуцирующих определенный антиген, связан с использованием индикаторных эритроцитов с закрепленным на их поверхности белком А. Такие клетки вносят в агар, на котором растет культура, одновременно с антисывороткой к нужному антигену и комплементом. Антитела через белок А связываются с поверхностью эритроцитов. В местах нахождения клеток, секретирующих антиген, он образует со связанными антителами иммунные комплексы. На них садится комплемент, что приводит в конце концов к лизису эритроцитов. Искомые колонии или клетки-продуценты антигена обнаруживаются по красным ореолам в местах их локализации [Smith, Hammarstrom, 1979]. [c.293]

При выращивании культур питательную среду меняют каждые 2—3 дня. Через 24 часа культивирования можно наблюдать около кусочков ткани первые выросты, состоящие из прозрачных, тонких клеток. К 6-му дню все эксплантированные кусочки окружены более или менее широким поясом выросших клеток. Одновременно с пышным разрастанием молодых клеток на 4—5-й день вокруг кусочков ткани образуются участки просветления от растворения растущими клетками сгустка плазмы. Этот так называемый лизис плазмы является небольшим осложнением при культивировании по этому методу. Особенно большой лизис плазмы отмечают обычно в культурах с растущими эпителиальными клетками. Вследствие разжижения сгустка плазмы культуры мо- [c.55]

Метод состоит в следующем. Питательную среду сливают, а клеточный монослой заливают 10%-ным раствором дезоксихолата натрия в насыщенном растворе мочевины в воде (1 г мочевины на 1 мл бидистиллированной воды при 22 ) примерно 1—2 мл на 3X10 клеток. Клетки обрабатывают 30—60 минут при комнатной температуре. Лизис контролируют под микроскопом. Клетки разрушаются в течение нескольких минут, а лизис наступает после разбавления смеси до 5—10% конечной концентрации лизата, Разведение можно производить исходной культуральной жидкостью, стерильной водой или физиологическим раствором, охлажденными до 4 В этих условиях происходит полный цитолизис Центрифугирование лизата при 10 ООО об/мин не ведет к образованию осадка, характерного для обломков клеток. Наряду с этим происходит гидролиз клеточных белков и нуклеиновых кислот, так как ну-клеазы и протеазы в данных условиях резистентны к мочевине [483]. Низкомолекулярные вещества из лизата удаляют при помощи диализа в течение суток против бидистиллированной воды Полного удаления мочевины можно достичь с помощью уреазы, [c.39]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология