Лаборатория очистки ферментов

ЛАБОРАТОРИЯ очистки ФЕРМЕНТОВ [c.10]

Лаборатория очистки ферментов 11 [c.11]

Лаборатория очистки ферментов [c.13]

Практическая работа в лаборатории сопровождается проведением семинаров, где рассматриваются теоретические вопросы, связанные со способами очистки ферментов, оптимизацией методов определения активности, а также вопросы ферментативной кинетики растворимых и иммобилизованных ферментов. Обсуждаются и основные экспериментальные результаты, полученные студентами. [c.196]

Остается сказать о том минимуме основного оборудования, который должна иметь в своем распоряжении каждая лаборатория по очистке ферментов. Активность ферментов обычно измеряют с помощью спектрофотометрических или радиохимических методов. Если все определения проводят спектрофотометрическим способом, то можно обойтись и без сцинтилляционно-го счетчика. Спектрофотометр же обязательно должен быть в лаборатории, так как он требуется, кроме того, и для измерения концентрации белков (разд. 8.5). К оборудованию первой необходимости относится спектрофотометр с УФ-лампой, желательно с самописцем для записи хода реакций во времени. [c.11]

При очистке ферментов лишь в редких случаях можно избежать центрифугирования. В промышленных масштабах для отделения осадка обычно используют фильтрационные системы, но в лаборатории более удобна центрифуга. Принципы и методы центрифугирования изложены ниже (разд. 1.2). В большинстве случаев нужна стандартная постоянно работающая центрифуга с охлаждением до 0°С или немного ниже при этом эффективность центрифугирования, выражающаяся произведением относительной величины g на емкость в литрах, должна быть порядка 10 ООО— 15 ООО. Можно использовать множество центрифуг других типов — от настольных до препаративных ультрацентрифуг. Но они не всегда нужны и вряд ли будут применяться при очистке ферментов так же часто, как типовая центрифуга, описанная выше. [c.11]

Для многих исследователей, занимающихся очисткой ферментов, большая часть этого раздела будет малоинтересна, так как им не приходится выбирать исходный материал. Причины этого могут быть самые различные — например, лаборатория может работать только с каким-то одним органом или видом и единственной заботой в этом случае будет обеспечение достаточного количества сырья в нужное время и сохранение его в замороженном виде перед использованием. [c.34]

Наконец, реальную опасность при выделении полисахаридов представляет деструкция под действием ферментов. Ферменты, содержащиеся в источнике, из которого выделяют полисахарид, обычно инактивируют нагреванием, кипячением с метанолом, замораживанием и т. п. Растворы полисахаридов могут служить средой для роста микроорганизмов, попадающих туда из воздуха лаборатории. Для предотвращения расщепления полисахаридов ферментами микроорганизмов к растворам прибавляют толуол, тимол или хранят их при низкой температуре. О предосторожностях при использовании ферментных препаратов для очистки полисахаридов было сказано выше. [c.488]

Вскоре после первой статьи та же группа исследователей опубликовала работы по фракционированию полипептидов [12], белков [12, 13, 59, 102], пептидов [59, 102], аминокислот [95, 103], поли- и олигосахаридов [131]. В этой же лаборатории были сделаны и другие работы, посвященные многочисленным и разнообразным применениям метода ГПХ, например для очистки гормонов [58] и ферментов [59], для разделения макромолекул и низкомолекулярных соединений [102], а также посвященные некоторым специальным задачам, например исследованию сорбции [42], влияния на результаты фракционирования скорости потока элюента, размера частиц геля, объема и вязкости образца [187] и автоматизации метода [11]. [c.115]

Исследованиями лаборатории А. В. Благовещенского и др. было показано, что энергия активации данного фермента не зависит от степени его очистки, следовательно, и от реальной концентрации. Было установлено, что полученные различными методами и обладающие различной активностью ферментные препараты (перокси-даза из хрена) имеют одно и то же значение н-. Исследование фермента каталазы из листьев различных персиков при 15°С показало, что активность одного из них выражалась = 43 -1U-5, активность другого имела А = 89 т. е. их активности отличались боль- [c.99]

Раздел Энзимология рассчитан на студентов, уже иознакомиз-" шихся с некоторыми современными методами химии белка определением концентрации белка, хроматографией, электрофорезом и др. Основная цель его состоит в том, чтобы дать возможность студентам приобрести навыки экспериментальной работы, необходимые для начинающего энзимолога. В ходе практикума студенты осваивают методы выделения и очистки какого-либо фермента, а также изучают свойства полученного препарата. В связи с этим приводятся общие указания по работе с ферментами, способам их очистки, правилам определения каталитической активности и кинетических свойств. Во второй части раздела описываются методы выделения ферментов из пекарских дрожжей и животных тканей (скелетных мышц, печени). Поскольку современные методы очистки ферментов включают большое разнообразие приемов, в ряде случаев для получения одного и того же фермента дается описание 2—3 методик, которые могут быть использованы в соответствии с уровнем оснащенности лаборатории. Кроме того, для ферментов из разных источников приводятся различные методы выделения. [c.196]

В последние 10 лет в нескольких лабораториях были разработаны методы получения высокоочищенной карбоангидразы из эритроцитов [34—42]. Они заключаются в осаждении гемоглобина смесью хлороформ—этанол [37, 39, 42] с последующей хроматографией на колонке, заполненной ДЭАЭ-целлюлозой [34, 37, 42], ДЭАЭ-сефадексом [43] или гидроксилапатитом [37, 39, 42]. Белок хорошо переносит лиофилизацию, и в большинстве методов она используется на той или иной стадии выделения. Накопленный опыт препаративной работы выявил некоторые особенности методов очистки фермента. Обработка смесью хлороформ—этанол существенно не меняет большинство физико-химических свойств. Но, как показал рентгеноструктурный анализ, воздействие этой смеси на фермент С человека снижает качество кристаллов [22, 23]. Для удаления гемоглобина лучше использовать гель-фильтрацию [37] или хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе [43]. Качество кристаллов повышается, если проводится электрофоретическая очистка фермента [23] и если не применяется лиофилизация [22, 23]. [c.562]

Следует сказать, что процедуру очистки фермента трудно уместить в нескольких параграфах, тем не менее полезно рассмотреть типичную схему очистки, чтобы понять, каким образом применяются различные хроматографические методы. В качестве примера рассмотрим очистку ДНК-полимеразы I из Е. соИ. Метод предложен Паулем Эиглундом, который модифицировал первоначальную методику, разработанную в лаборатории Артура Корнберга. [c.219]

Химики-органики развили методологию синтеза для того, чтобы лучще понимать механизмы органических реакций и создавать новые соединения. Биохимики в свою очередь изучают процессы жизнедеятельности, применяя биохимические методы исследования (очистка и определение активности ферментов, метод радиоактивных индикаторов в системах in vivo). Первые владеют методами, позволяющими получать аналоги соединений, присущих биологическим объектам, но часто затрудняются определить, какой синтез был бы полезен. Вторые способны оценить, что именно было бы полезно синтезировать в лаборатории, но не обладают нужной квалификацией для рещения этой задачи. Очевидна необходимость согласованного подхода, и химики-биоорганики часто работают в двух лабораториях в одной — синтезируя, в другой — изучая биологические объекты. В результате переплетения химических и биологических подходов была выработана качественно новая концепция построения моделей для изучения и разделения различных параметров сложного биологического процесса. Многие биологические реакции, а также действие (специфичность и эффективность) участвующих в них [c.13]

В наших лабораториях мало применялся ферментативный гидролиз протеинов. Причина этого лежит в неуменьи разделять ферменты, идентифицировать, очищать от примесей. Действие смеси ферментов, добываемых нами из желудочного сока животных, из секретов желез, из клеток организмов, не позволяет вести процесс распада строго по стадиям от протеина до аминокислоты аналогично ходу его в организмах, отклоняет реакцию в сторону получения вторичных образований и даже не исключает одновременно и синтеза (Данилевский). Только в самое последнее время Вильштетером, а за ним другими исследователями открыты способы очистки и изолирования ферментов один от другого. Эти успехи в области исследования ферментов, даже при нынешнем начальном, далеком от совершенства состоянии, дали в руки исследователей новое средство к изучению белковых веществ. Реакции с протеинами приближены к естественным, имеющим место в организмах условиям, а это во многом поможет разобраться в трудно разрешаемой белковой проблеме. [c.18]

Белок, осажденный высаливанием, можно отделить от белков, оставшихся в растворе, центрифугированием или фильтрованием и вновь растворить, добавив воду или буферный раствор. Этим методом можно концентрировать растворы (после осаждения раст1ворить белок в меньшем объеме растворителя). Метод высаливания белков широко используется в научно-исследовательских лабораториях при выделении и очистке различных белков (ферменты, гормоны и др.) и в производственных условиях для получения белковых препаратов (лечебные сыворотки, кристалличеекиёОелки и др.). [c.24]

Шведский ученый Пер-Оке Альбертсон предложил использовать для разделения бактерий, вирусов, фрагментов клеток, мембран, ядер, белков, нуклеиновых кислот и любых других частиц биологического происхождения двухфазные водные растворы полимеров — иолиэтиленгликоля, декстрана и их производных [2, 279, 280]. Фракционирование в двухфазной водной системе основывается на избирательном распределении частиц между этими фазами, аналогичном распределению растворимых веществ. Метод Альбертсона получил широкое распространение и используется во многих биохимических и микробиологических лабораториях, так как позволяет в мягких условиях, без нарушения структурной целостности и изменения нативных свойств осуществлять выделение и очистку лабильных биологических объектов, а также дать определенную информацию о их строении. Реализация этого метода в промышленном масштабе, например, для выделения вирусов или получения чистых ферментов, не встречает, по мнению автора, принципиальных трудностей, однако в очистке воды он не может быть использован. Очевидно, и любая другая модификация экстракции жидкость — жидкость неприменима при микробной очистке промышленных сточных вод и, конечно, такой метод совершенно непригоден для водоподготовки. [c.194]

Существуют различные методы выделения брадикинина из продуктов расщепления белков плазмы трипсином или змеиным ядом и его очистки, разработанные в различных лабораториях. Методика, применявшаяся Эллиоттом и сотр. [661, 666, 668, 669], заключалась в обработке фракционированной смеси белков из сыворотки быка 0,1 и. соляной кислотой при 37° (для инактивации ферментов, разрушающих брадикинин) и в последующей их инкубации с трипсином в течение 6 час. Полученную смесь осаждали спиртом, а из фракции, растворимой в 74%-ном спирте, чистый брадикинин удалось выделить с помощью противоточного распределения, хроматографии на, карбоксиметилцеллюлозе (ацетатно-аммониевый буферный раствор pH 6,5 и 5) и электрофореза. Сначала на основании неточных данных аминокислотного анализа считали, что брадикинин имеет следующий аминокислотный состав Ser Gly Pro Phe Arg= 1 1 2 2 2. Результаты кислотного гидролиза, расщепления химотрипсином и разложения по методу Эдмана позволили приписать бради-кинину следующую структуру [c.105]

При очистке протеолитической системы щитовидных желез свиней, проведенной в лаборатории авторов этого раздела, была выделена кислая протеиназа с высокоспецифичной активностью и две почти гомогенные пептидазы, одна из которых ( АФАТ-аза ) гидролизует преимущественно К-ацетил-ь-фенилаланил-ь-тирозин, а другая ( цистеинилтирозиназа ) менее специфична, но высокоактивна по отношению к ь-цистеинил-ь-тирозину и ь-лейцил-ь-тирозину [109—113]. Когда очищенную кислую протеиназу из щитовидных желез свиньи инкубировали с частично очищенным тиреоглобулином крысы, меченным in vivo было найдено, что при этом выделяется МИТ, ДИТ и Т4, причем фермент был более активен при pH 5,3, чем при pH 3,5 [114]. Дальнейшие исследования фермента свиньи с использованием в качестве субстрата высокоочищенного тиреоглобулина свиньи, меченного in vivo позволили установить, что степени активности фермента с этим субстратом были обратны степеням активности, наблюдавшимся нри действии фермента на тиреоглобулин крысы, т. е. фермент был более активен при pH 3,5 [112]. Такое различие, вероятно, связано с различиями в структуре двух субстратов. В обеих сериях опытов очищенная пептидаза ( АФАТ-аза ) не оказывала заметного действия на интактный тиреоглобулин, однако с протеиназой действовала синергически, усиливая отщепление иодированных аминокислот, особенно МИТ и ДИТ, от тиреоглобулина. Интересно, что хотя очищенный тиреоглобулин свиньи не содержит иодированных аминокислот в N-концевом положении (раздел 3,6), иодированные N-концевые группы обнаруживаются в полипептидно-белковой смеси, образованной в результате обработки тиреоглобулина кислой протеиназой щитовидной железы [38]. [c.230]

Хотелось бы подчеркнуть, что научная работа Л.И. Патрушева не ограничивается теоретическими изысканиями и литературной деятельностью. Эту сторону научной работы ему удается плодотворно совмещать с экспериментальными исследованиями генетических явлений. Вместе со своими сотрудниками автор монографии внес заметный вклад в биотехнологию, получив одним из первых в России высокопродуктивный бактериальный штамм-продуцент термостабильной ДНК-полимеразы Ткегтиз адиа1киз и разработав эффективные методы ее очистки. В настоящее время этот фермент находит широкое применение во многих лабораториях у нас в стране и за рубежом. Являясь членом Международного общества по исследованию тромбозов и гемостаза (18ТН), Л.И. Патрушев разработал универсальную систему ал-лель-специфической ПЦР, которая, в частности, позволяет диагностировать мутации, ассоциированные с тромбофилиями, и с ее помощью впервые осуществил анализ генетической структуры российской популяции в отношении распространенности данных генетических маркеров. В этом направлении на стыке генетики и медицины он продолжает активно работать и в настоящее время. То, что Л.И. Патрушев знает о генетических методах не понаслышке, придает его книге особую ценность, так как читатель может найти в ней много советов и рекомендаций (см., например, раздел о полимеразной цепной реакции в первой части книги), которые могут оказать практическую помощь при проведении его собственных исследований. [c.7]

В высокоочищенном состоянии КФ получена из скелетных мышц [20, 23, 35], сердца [36, 37, 38] и печени 1[39—42], а в частично очищенном виде она выделена из ряда других тканей. В качестве объектов для выделения фермента были использованы ткани кролика, акулы, крысы, быка, а также человека. Разработанный Кребсом и др. [35] метод выделения КФ основан на изо-электрическом осаждении и дифференциальном центрифугировании. Дополнительные этапы очистки включают осаждение сульфатом аммония, гель-хроматографию на сефарозе 4В и ионнообменную хроматографию на ДЭАЭЦ [20, 23]. Описаны и другие методы выделения—с помощью гидрофобной хроматографии [43], хроматографии по сродству на иммобилизованной фосфорилазе, специфических антителах, на кальмодулин-сефарозе [44—46]. Очищенная до гомогенного состояния КФ из скелетных мышц представляет собой большую молекулу с м. в. 1,27x10 —1,33X10 [20, 23, 35 Коэффициент седиментации ее равен 23—26 5 [20, 23, 47, 48 При хранении фермента появляются агрегаты с коэффициентами седиментации 37 5 и 485 [23]. В двух разных лабораториях был определен аминокислотный состав молекулы КФ [20, 23]. Изо-электрическая точка фермента р1 равна 5,77 [21]. В спектре поглощения имеется максимум при 279 нм и минимум при 251 нм [21]. [c.56]

Хроматография на окрашенных адсорбентах — быстро развивающаяся область просматривая при подготовке этой главы новые публикации, в том числе и работы моей лаборатории, я убедился в том, что об этом методе следует подумать, прежде чем приступать к реализации плана очистки того или иного фермента, особенно если этот фермент связывает нуклеотиды. Что касается цибакрона голубого, то он, по-видимому, ничем особенным не отличается от других красителей по своей способности связывать белки он попадает в середину ряда красителей. Широкое распространение окрашенных адсорбентов обусловлено двумя важными факторами а) их относительно высокой связывающей емкостью и б) дешевизной. Если это играет важную роль для решения данной проблемы, хрома- [c.172]

Все используемые при конструировании гибридных молекул ДНК ферменты должны быть высокоочищенными, так как даже незначительные посторонние иуклеазные загрязнения могут приводить к побочным реакциям и резко снижать эффективность получения целевых генетических конструкций. Поэтому изучение ферментов, разработка методов их глубокой очистки, а также поиск новых ферментов, специфически действующих на нуклеиновые кислоты, активно продолжаются. Важной областью исследований, которой не всегда уделяется должное внимание, является оптимизация условий культивирования микроорганизмов — продуцентов ферментов нуклеинового обмена. В ряде лабораторий показано, что, оптимизируя параметры процесса культивирования путем применения методов математического планирования эксперимента, можно повысить удельный выход этих ферментов в десятки раз. [c.28]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология