Белки, измерение концентраци

Измерение спектров дисперсии оптического вращения (ДОВ) и кругового дихроизма (КД) получило широкое распространение как метод конформационного анализа оптически активных соединений. Особенно методы ДОВ и КД используются в органической химии, биохимии, энзимологии и молекулярной биологии. Данными методами исследуются белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, стероиды, углеводы и полисахариды, вирусы, митохондрии, рибосомы, фармакологические средства, синтетические полимеры, координационные соединения, неорганические и редкоземельные комплексы, кристаллы, суопензии и пленки и т. п. и решаются следующие задачи 1) определение по эмпирическим пра вилам конформации и ее изменений под действием различных физико-химических воздействий 2) изучение механизма и кинетики химических реакций (особенно ферментативных) 3) получение стереохимических характеристик 4) измерение концентраций оптически активных веществ 5) определение спиральности макромолекул 6) получение электронных характеристик молекул 7) исследование влияния низких температур на конформацию соединений 8) влияние фазовых переходов типа твердое тело — жидкость — газ на изменение структуры. [c.32]

Определение числа субъединиц, вступивших в реакцию. Число субъединиц, образовавших ковалентную связь с носителем, определяют измерением концентрации белка в пробах, обработанных 8 М мочевиной, сравнивая ее с исходной концентрацией иммобилизованного фермента. [c.388]

Возможно прямое определение белка путем измерения оптической плотности (поглощения) при 280 нм, основанное иа присутствии в белке остатков тирозина и триптофана. Зная удельный коэффициент экстинкции е (оптическая плотность 1%-иого раствора белка при 280 им и длине оптического пути 1 см), можно, исходя из измеренной экстинкции раствора белка неизвестной концентрации, установить содержание белка (в мг/1 мл). [c.356]

Метод Лоури приблизительно в 100 раз чувствительнее биуретового метода и в 10—20 раз спектрофотометрического метода измерения концентрации белка по поглощению света с длиной волны около 280 нм (ультрафиолетовая область). С помощью метода Лоури можно определить количество белка в растворе, если его содержание составляет 10—20 мкг в 1 мл, [c.20]

Рис. 24-20. Состав крови. Цельную кровь разделяют путем центрифугирования на плазму и клетки. Около 10% плазмы крови приходится на долю растворенных в ней твердых веществ, из которых около 70% составляют белки плазмы, около 10%-неорганические соли и около 20%-низкомолекулярные органические соединения. Основные компоненты каждой из фракций представлены справа. Количественный состав неорганических компонентов плазмы крови приведен на рис. 24-19, белков плазмы-в табл. 24-3 и небелковых органических веществ - в табл. 24-4. В плазме крови содержатся также липиды в количестве приблизительно 700 мг на 100 мл, которые связаны с а- и р-глобулинами (табл. 24-3). Кровь содержит и многие другие соединения, часто в следовых количествах к их числу относятся промежуточные продукты метаболизма, гормоны, витамины, микроэлементы и желчные пигменты. Измерения концентрации отдельных компонентов в плазме крови играют важную роль в диагностике заболеваний и наблюдений за ходом лечения.

Робертс поставил кинетические эксперименты с внедрением радиоактивных изотопов в рибосомы, а затем в растворимые клеточные белки, перейдя к масштабу времени 5—10 сек. Его опыты сделаны менее детально, чем опыты с синтезом гемоглобина. Растворимые белки все в целом осаждались трихлор-уксусной кислотой, и их радиоактивность измерялась без фракционирования. Рибосомы предварительно фракционировались в ультрацентрифуге, и носле разделения центрифугируемой жидкости на отдельные пробы проводилось измерение концентрации РНК (но поглощению света при 260 шц) и радиоактивности в каждой пробе. [c.457]

Концентрация субстратов — количество субстрата в г/молях, т. е. величина М. Такое измерение концентрации удобно, если в одной молекуле субстрата в ходе ферментативной реакции претерпевает превращение одна связь. Когда происходит превращение нескольких связей в одной молекуле субстрата (белки, полисахариды и др.),, то концентрацию субстрата лучше выражать в г-экв/л. Грамм-эквивалент — это число грамм-молей субстрата, деленное на число затронутых рментом связей. [c.109]

Обычным методом измерения концентрации ионов по электродному потенциалу является измерение концентрации водородных ионов (или pH) с водородным электродом. Титрование дает количество кислоты независимо ОТ степени кислотности раствора, измерение pH характеризует эту кислотность. Например,. на титрование 20 мл 0,1 н. соляной. кислоты идет столько же КОН, сколько на такое же количество уксусной. Измерение же pH покажет, что в нервом растворе pH = 1, а во втором — около 3. Для измерения pH можно применять индикаторы (стр. 502) однако в случае очень сильно окрашенных жидкостей, присутствия большого количества белков и солей или необходимости иметь очень точные данные для [Н ]— индикаторные методы не применимы и приходится обращаться к методам электрометрическим. [c.430]

Рис. 13-15. Согласованные подъемы и спады уровней MPF и циклина, связанные с клеточными циклами. Измерения концентрации циклина проводились в основном на яйцах морских беспозвоночных, где циклин составляет 5% белков, синтезируемых во время короткой

С повышением концентрации детергентов флуоресценция усиливается. Конечная концентрация SDS должна быть ниже 0,01%, Тритона Х-100 — ниже 0,001%, других детергентов — ниже 10 мкг/мл. Флуоресценция одноцепочечной геномной ДНК примерно вполовину менее интенсивна по сравнению с двухцепочечной ДНК эквивалентной концентрации. Поэтому при измерении концентрации одноцепочечной ДНК стандартная ДНК тоже должна быть одноцепочечной. Если проба содержит высокий уровень белков, которые могут увеличивать уровень шумов, предварительная обработка пробы Протеиназой К может снизить флуоресцентный фон. [c.184]

Это быстрый и удобный метод измерения концентрации растворенных белков, основанный на количественном связывании белков с красителем. Он не применим для измерения белка в рассеивающих образцах. Хотя число соединений, мешающих определению белка этим методом сравнительно невелико, краситель реагирует более или менее сильно с различными очищенными белками. Поэтому определение концентрации различных по составу белков этим методом лишь до некоторой степени количественное. К преимуществам метода можно отнести быстроту определения (10 мин) и высокую чувствительность. К недостаткам — варьирование результатов при определении концентраций различных белков и необратимое денатурирование порции белка, пошедшей на определение. [c.140]

Остается сказать о том минимуме основного оборудования, который должна иметь в своем распоряжении каждая лаборатория по очистке ферментов. Активность ферментов обычно измеряют с помощью спектрофотометрических или радиохимических методов. Если все определения проводят спектрофотометрическим способом, то можно обойтись и без сцинтилляционно-го счетчика. Спектрофотометр же обязательно должен быть в лаборатории, так как он требуется, кроме того, и для измерения концентрации белков (разд. 8.5). К оборудованию первой необходимости относится спектрофотометр с УФ-лампой, желательно с самописцем для записи хода реакций во времени. [c.11]

МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА [c.310]

К 0,5 мл раствора белка неизвестной концентрации (до 3 мг) добавляют 2,5 мл реактива. Перед измерением оптической плотности при 540 нм раствор выдерживают 20—30 мин. [c.341]

Для понимания поведения белков в центробежном поле полезно рассмотреть устройство ротора ультрацентрифуги (рис. 5.1), а также обсудить изменение концентрации белка в ячейке ультрацентрифуги в процессе седиментации (рис. 5.2). В результате постепенного изменения концентрации белка через некоторое время образуется четкая граница между растворителем и раствором белка. Измерение положения этой границы в зависимости от времени позволяет определить константу седиментации, являющуюся функцией молекулярной массы. За скоростью седиментации можно следить с помощью нескольких методов. Один из них заключается в следующем через кювету пропускают ультрафиолетовый свет (230— 290 нм) и регистрируют его поглощение (величина которого про- [c.126]

Ход определения. К 0,5 мл раствора белка неизвестной концентрации (до 3 мг) добавляют 2,5 мл реактива. Перед измерением оптической плотности при 540 нм раствор вьщерживают 20-30 мин. Количество белка в образцах определяют при помощи калибровочной кривой. В качестве стандартного раствора используют БСА (выбирают диапазон концентраций от 1 до 10 мг). [c.46]

Применение люминесценции для аналитических целей включает широкую область использования ее для идентификации веществ, для обнаружения малых концентраций веществ для контроля изменений, претерпеваемых веществом для определения степени чистоты веществ. Широко применяются измерения люминесценции при изучении кинетики обычных химических реакций. Высокая чувствительность метода позволяет фиксировать малую степень превращения, а иногда по люминесценции промежуточных соединений становится возможным установить механизм химической реакции. Люминесцентные методы используются в биологии, в частности, для исследования структуры белков методом флуоресцентных зондов и меток. [c.49]

Метод определения молекулярной массы по величине осмотического давления нашел широкое распространение для высокомолекулярных веществ. Измерение величин других коллигативных свойств в этом случае нецелесообразно, так как закон Рауля выполняется только при очень малых концентрациях растворенных высокомолекулярных веществ, при которых чувствительность мала например, 0,001 т раствор белка с молекулярной массой М=10 000 дальтон содержит 1 г вещества в 100 г воды. [c.147]

Проводят спетрофотометрические измерения концентрации примесного (загрязнение реактивов) Са + в среде инкубации с подходящим металлохромным индикатором. Анализируют причины отклонения от линейности зависимости скорости исследуемого процесса от концентрации белка митохондрий. [c.466]

В этом случае в ферментер периодически добавляют субстрат, а конечный продукт собирают только по завершении процесса. Добавление субстрата приводит к удлинению экспоненциальной и стационарной фаз и к увеличению биомассы и количества метаболитов, синтезируемых во время стационарной фазы (например, антибиотиков). Однако в стационарной фазе микроорганизмы часто синтезируют протеолитические ферменты (протеиназы), разрушающие все производимые ими белки. Поэтому, если целью ферментации является получение бел-ковьгх продуктов, нужно остановить процесс до его перехода в эту фазу. Прямое измерение концентрации субстрата в ходе ферментации часто бывает затруднено, и чтобы определить, в какой момент нужно добавить следующую порцию субстрата, приходится использовать другие показатели, коррелирующие с его расходованием, например количество синтезированных органических кислот, значение pH или количество образовавшегося СО2. Вообще говоря, ферментеры периодического действия с добавлением субстрата требуют постоянного и более тщатель- [c.352]

СО—обладающего характерным максимумом поглощения при 555 нм. Интенсивность окраски определяется в данном случае лишь количеством пептидных связей. Биуретовая реакция пригодна для определения белка в концентрации 0,25— 25 мг/мл, причем выход окраски стандартизуют по чистому белку. Биуретовую реакцию можно проводить в пробирках и в проточной системе. 0,1—4 мл раствора белка (1—5 мг белка) разбавляют до 5 мл раствором А (0,85%-ный хлорид натрия), прибавляют 5 мл раствора Б и полученную смесь нагревают на водяной бане при 32 °С в течение 30 мин. Количество белка определяют путем измерения оптической плотности при 555 нм. Раствор Б готовят следующим образом к раствору виннокислого калия—натрия (45 г) прибавляют при перемешивании 15 г сульфата меди uS04 5НгО, 5 г иодида калия и разбавляют до 1 л 0,2 М гидроокисью натрия (не содержащей углекислого натрия). Раствор гидроокиси натрия готовят путем нагревания до 90 °С 50%-ного едкого натра в течение 24 ч и после отделения от выпавшего углекислого натрия разбавляют прокипяченной водой. [c.456]

Определение белка методом Уодделя [12] основано на дифференциальном измерении поглощения при 215 и 225 ммк. Белковый раствор разбавляют раствором Na l (9 г/л) до тех пор, пока экстинкция при 215 ммк не станет меньше 1,5. Разность экстинкции при 215 и 225 ммк, умноженная на 144, показывает концентрацию белка в исследуемой пробе в мг/мл. При работе с индивидуальным белком при определенных условиях возможно точное измерение концентраций белка порядка 5 мкг/л. Из наблюдений Мерфи и Киса [13], Списа и др. [14] и Бендиксена [15] можно вывести некоторые важные замечания [c.270]

На рис. 120 приведены графики Гинье для кривых рассеяния от некоторых белков согласно исследованиям, проведенным Ритландом, Кайсбергом и Бименом [21 ]. Линейная зависимость указывает на то, что форма частиц заметно не отклоняется от сферической. Позднее те же авторы более подробно изучили сывороточный альбумин [22]. На рис. 121 приведены кривые рассеяния, соответствующие растворам этого белка различной концентрации. Из этих кривых видно, что даже при очень низкой концентрации белка происходит интерференция лучей, рассеянных различными частицами эти эффекты в значительной степени искажают рассеяние, свойственное самим частицам. Таким образом, измерения, результаты которых приведены на рис. 120, были выполнены с растворами слишком высокой концентрации. Тем не менее из каждой кривой можно получить кажущийся радиус рассеивающей массы. Для того чтобы получить истинный радиус рассеивающей массы, кривые следует экстраполировать к нулевой концентрации, как показано на рис. 122. При сравнении логарифмического графика экстраполированной кривой рассеяния сывороточного альбумина, в которую внесена поправка на коллимацию, с теоретическими кривыми для эллипсоидов (приведенными на рис. 119) оказывается, что радиус рассеивающей массы равен 29,8 А частицы имеют форму сплющенных эллипсоидов с соотношением осей 3,5 и характеризуются внутренней гидратацией, причем на 1 г белка приходится 0,37 г воды. [c.202]

Поглощение ультрафиолетового излучения. Большинство белков поглощает ультрафиолетовое излучение с длиной волны около 280 тр. Было показано1 [91—94], что это поглощение обусловлено тирозином, триптофаном и (в меньшей степени) фенилаланином. Таким образом, величина поглощения зависит от содержания этих аминокислот в белке. Измерение оптической плотности белкового раствора при 280 пу служит удобным и точным методом определения концентрации белка [95], если известен коэффициент экстинкции и в растворе нет других веществ, поглощающих свет с этой длиной волны. Рассматриваемый метод можно также применять для приближенного измерения общего содержания белков в смеси в тех случаях, когда допустимо использование среднего коэффициента экстинкции. Метод имеет то преимущество, что на поглощение света не влияют растворенные соли и многие другие вещества и что, следовательно, определение можно производить на образцах белковых фракций без всякой специальной их подготовки, Анализ производится быстро, причем требуются всего лишь доли миллиграмма белка. [c.20]

Применение измерений поверхностного давления для изучения макромолекул было рассмотрено Криспом [433] и Береджиком [434]. Этот метод труден особенно потому, что наиболее ценные данные могут быть получены при очень низких концентрациях образца, при которых проблема очистки от случайных примесей становится довольно серьезной. Для измерения самых малых значений поверхностного давления требуется исключительно тщательное выполнение эксперимента. Кроме того, решающее значение имеет образование поверхностного слоя таким способом, при котором отдельные молекулы правильно располагаются на поверхности гипофазы. Для глобулярных белков измерение поверхностного давления позволяет получить значения молекулярного веса, хорошо согласующиеся с результатами, полученными методом осмометрии [435, 436]. [c.155]

Белки в концентрации менее 2 мкг/мл определялись с помощью кумасси R (фирма Sigma). Белок осаждали на стеклянно-фибровый диск, промывали трихлороуксусной кислотой, обрабатывали реагентом кумасси и образовавшийся окрашенный комплекс растворяли в метанольном растворе NaOH для колориметрического определения при 590 нм [249]. Применение щелочи, рекомендуемое для снятия осажденного белка с подложки, улучшает последующее колориметрическое или радиометрическое измерение [101]. [c.298]

Это наиболее простой и быстрый метод измерения количества белка в содержаищх его нерассеивающих растворах. Преимуществами метода является быстрота и неизменность пробы до и после анализа. К недостаткам следует отнести то, что метод не является строго количественным, так как основан на поглощении тнрозиновых, фенилаланиновых и триптофановых остатков. Поэтому различные белки имеют разные коэффициенты поглощения, а если белок не содержит вышеуказанных аминокислот, то он не будет поглощать при 280 нм. Метод применим для измерения концентраций белка и в растворах смесей белков. [c.139]

Для большинства рутинных измерений можно с большой вероятностью допустить, что поглощение при 280 нм раствора белка с концентрацией 1 мг/мл даст значение Агво около 1 в кювете с рабочим расстоянием 10 мм. Более скрупулезные исследования показывают, однако, что поглощение одинаковых по концентрации белков может значительно различаться (табл, 12). [c.139]

М. Суспензию оставляют фильтроваться через складчатые фильтры на ночь. Фильтрат отбрасывают, осадок переносят на воронку Бюхнера и удаляют оставшийся фильтрат путем отсасываиия при пониженном давлении. Плотный осадок переносят в целлофановые мешочки и диализуют против проточной водопроводной воды в течение ночи. Полученный раствор объединяют, измеряют его объем и концентрацию белка (измерения по Лоури и по поглощению при 280 нм дают в данном случае сходные результаты), после чего разбавляют раствор холодной дистиллированной водой до 5% концентрации белка. [c.153]

На осмотическое давление сильное влияние оказывают заряд белка и концентрация электролитов буфера. Вследствие того, что молекула белка заряжена, а по обе стороны мембраны должна поддерживаться электроиейтральность, концентрации диффундирующих ионов по разные стороны мембраны могут различаться, что будет влиять на осмотическое давление. Однако этими эффектами можно пренебречь, если осмотическое давление измерять в изоэлектрической точке белка или же при значениях pH, отличающихся от изоэлектрической точки, но при высоких концентрациях электролитов. В настоящее время измерение осмотического давления с целью определения молекулярной массы используется редко. Экспериментально наблюдаемое осмотическое давление отражает среднюю молекулярную массу всех белков, присутствующих в рагтворе. Таким образом, только для чистых белков можно ожидать получения истинных значений молекулярной массы. В противоположность другим методам, имеющимся сейчас в распоряжении, этот метод совершенно не дает представления о гомогенности исследуемого препарата белка. [c.132]

Тирозин и триптофан (в незначительной степени также и фенилаланин) поглощают ультрафиолетовое излучение с максимумом поглощения при 280 нм. На этом основан спектрофотометрический метод измерения концентрации белков в растворах. Белки можно определять также колориметрически с помощью цветных реакций. В щелочной среде ионы двухвалентной меди образуют с пептидными группами комплексы, окрашенные в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Но чаще всего применяют более точный метод Лоури. Он основан на комбинации би-уретового реактива со специальным реактивом на ароматические аминокислоты. [c.53]

Оборудование, материалы, реактивы. Работу по выделению и очистке белков проводят в холодной комнате или специальном криостате при температуре О - 4°С (Рис. 4). Из оборудования основными являются центрифуги с охлаждением до О С и ниже, применяемые для отделения осадков гомогенизаторы для разрушения клеток, спектрофотометр, служаш ий для измерения концентрации белков и активности ферментов, а также обычное лабораторное оборудование весы, рН-метры, мешалки, градуированные цилиндры, пипетки и микропипетки, аппараты для приготовления льда или жидкий азот. Из реактивов необходимы различные буферные растворы, сульфат аммония, реактив Фолина-Чокальтеу, органические растворители и т.д. Жидкие химические реактивы должны быть перегнаны, сухие - перекристаллизованы. В работе желательно применять бидистиллированную воду. [c.50]

В настоящее время метод остановленной струи широко приме-ляется для решения многих задач химической кинетики установление механизмов химической реакции, определение стадий, лимитирующих протекание реакции обнаружение промежуточных комплексов, определение кинетики ферментативных реакций, установление числа и концентрации активных центров фермента, изучение быстрых конформационны5( переходов в белках и нуклеиновых кислотах. Метод требует быстрой регистрации это единственное существенное ограничение его применимости. Особое внимание при применении метода остановленной струи необходимо уделять тер-мостатированию, так как разница в температурах в кювете наблюдения и растворе смеси реагентов может привести к большим оптическим ошибкам, затрудняющим установление механизма наблюдаемой реакции. Точность определения констант скоростей данным методом примерно такая, как и при обычных спектрофотометрических измерениях кинетики химических реакций. [c.28]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология