Хроматография полинуклеотиды

Хроматография полинуклеотидов не привела к таким блестящим результатам, как при разделении моно- и олигонуклеотидов. Однако в сочетании с другими методами (противоточное распределение, специфические химические методы) хроматографический метод благодаря простоте и надежности широко используется для выделения, разделения и характеристики нуклеиновых кислот. [c.338]

Эту хроматографию можно применять во всех случаях, когда белки или пептиды содержат сульфгидрильные группы, чтобы их изолировать, разделить, иммобилизовать, если это, например, ферменты. Она пригодна также для иммобилизации или выделения полинуклеотидов, содержащих ртуть. [c.84]

Колонки для гель-хроматографии нуклеиновых кислот готовят обычным образом по аналогии с хроматографией низкомолекулярных веществ. Первое время гель-хроматографию на сильно сшитых сорбентах использовали вместо диализа для отделения высокомолекулярных полинуклеотидов от низкомолекулярных веществ с целью обессоливания, очистки [117], [c.80]

В органической химии сегодня можно выделить три особо важных направления исследований. Первое направление — это выделение, характеризация и установление строения природных соединений. На сегодняшний день выделено и идентифицировано много новых природных соединений — алкалоидов и терпенов из растений, антибиотиков из микроорганизмов и грибов, пептидов и полинуклеотидов из организмов животных и человека. Хроматография позволяет [c.153]

Хотя доступные в настоящее время препараты ДНК бактерий, животных и растений, несомненно, представляют собой многокомпонентные смеси, эффективного их фракционирования с помощью существующих методов добиться не удается. В отдельных случаях, однако, удается получить данные, указывающие на присутствие в суммарном препарате ДНК полинуклеотидов, отличающихся по своим свойствам от основной массы ДНК клеточного ядра и являющихся, таким образом, особыми разновидностями ДНК. Так, из препаратов ДНК бактерий при фракционировании с помощью противоточного распределения, центрифугирования в градиенте сахарозы, хроматографии на фосфате кальция или колонках с МАК получены фракции, свойства которых соответствуют свойствам одноцепочечной ДНК (см., например, предполагается, что такая ДНК является промежуточным продуктом при воспроизведении ДНК в клетке. [c.34]

Теоретические основы хроматографии нуклеиновых кислот до сих пор не разработаны. Поэтому выбор сорбентов и условий разделения ведутся чисто эмпирически. Ясно лишь одно, что различие зарядов полинуклеотидов может быть использовано только при больших различиях в длине цепи. Адсорбционные взаимодействия с ионитом существенно зависят от вторичной [c.335]

Другие методы разделения нуклеиновых кислот, описанные в литературе, не получили широкого распространения. К ним относится хроматография на гидроксилапатите [46], хроматография на магниевой форме катионита [47], и, наконец, разделение на синтетических полинуклеотидах, переведенных в нерастворимую форму [48]. [c.338]

Как было показано выше, целлюлоза была первым носителем в аффинной хроматографии. Обзор данных по применению целлюлозы для выделения антител и антигенов приведен в работе [81]. Данные о ковалентном связывании нуклеотидов, полинуклеотидов и нуклеиновых кислот обобщены в статье [33]. Хотя в настоящее время в аффинной хроматографии применяются и другие твердые носители, целлюлоза не потеряла своего значения. Трипсин, связанный с целлюлозой, по-прежнему ис- [c.40]

Хроматография нуклеиновых кислот на кизельгуре. со слоем основных полиаминокислот со с оем полинуклеотидов со слоем метилированного альбумина [c.332]

Значительное улучшение разделения олигонуклеотидов и низкомолекулярных полинуклеотидов может быть достигнуто ионообменной хроматографией в присутствии мочевины для устранения образования вторичных связей [569]. [c.366]

Влияние температуры. Зависимость хроматографического разделения от температуры обычно связывают с температурной зависимостью скорости диффузии растворенного вещества относительно центров ионного обмена и кинетики ионообменной реакции. Однако при хроматографии нуклеиновых кислот зависящие от температуры изменения конформации полинуклеотидной цепи могут вызвать количественно больший эффект с повышением температуры полинуклеотид плавится и большее число его участков становится [c.53]

Метод барьерного разделения [33]. Олигонуклеотиды специфически адсорбируются в тех зонах слоев ПЭИ-целлюлозы, которые содержат комплементарные им по основаниям полинуклеотиды. Образовавшиеся комплексы обладают заметной устойчивостью к нагреванию, которая обус- ловлена их фиксацией на ПЭИ-целлюлозе. Поскольку стабильность комплексов зависит от химического состава, длины цепи полинуклеотидов и температуры, с помощью хроматографии при различных температурах в присутствии комплементарного полинуклеотида можно не только разделять гомологичные олигонуклеотиды, ио и отделять их от других олигонуклеотидов. [c.47]

Аффинная хроматография [27—31] представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Сорбентом в этом случае служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. Когда раствор, содержащий выделяемое вещество (скажем, фермент), пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом (в данном случае фермента с субстратом) приводит к его удерживанию и, следовательно, к концентрированию. Поскольку сорбция носит обратимый характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Один из вариантов этого приема, который, строго говоря, уже не относится к области хроматографии, заключается в том, что иммобилизованный на геле фермент служит для непрерывного превращения растворенного в подвижной фазе субстрата. Разделение по методу аффинной хроматографии может быть основано на различного рода специфических взаимодействиях, таких, как связывание фермента с ингибитором, гормона с рецептором, антигена с антителом, а также гибридизация полинуклеотидов. Этот метод позволяет выделять даже целые клетки. [c.21]

В литературе описаны попытки использования сефадексов и биогелей, представляющих собой соответственно сшитый декстран и гранулированный полиакриламидный гель, для разделения компонентов нуклеиновых кислот за счет различного сродства их молекул к сорбенту [32, 33]. Однако в основном гель-хроматографию применяют для фракционирования нуклеиновых кислот и их компонентов в соответствии с размерами молекул этих соединений. Например, на колонке с сефадексом 0-10 нуклеозиды и нуклеотиды отделяются от неорганических солей (выходят со свободным объемом колонки) [34]. Аналогичным образом олигонуклеотиды, содержащие больше 10—15 нуклеотидных остатков, не задерживаются на сефадексе 0-25 или 0-50, а мононуклеотиды проникают в поры геля и поэтому элюируются значительно медленнее [3]. Именно этот метод широко используют для удаления избытка нуклеозидтрифосфатов из смеси биосинтетических олиго- и полинуклеотидов [35]. [c.167]

Используя различные виды хроматографии (бумажная, анионообменная, хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе и др.), из смеси полимеров удалось выделить полинуклеотиды двух типов [c.404]

После завершения реакции защитные группы можно удалить в мягких условиях, не затрагивающих фосфодиэфирной связи. На этом основан фосфодиэфирный метод синтеза полинуклеотидов. Продукт реакции — фосфодиэфир со свободной, потенциально уязвимой для воздействия, отрицательно заряженной группой. Далее, с увеличением длины полинуклеотидной цепи число отрицательных зарядов в соединении также будет увеличиваться. Поэтому в зависимости от условий реакции эти потенциально нуклеофильные центры могут участвовать в нежелательных побочных реакциях. Кроме того, такое многозарядное соединение слищком полярно, чтобы можно было проводить его очистку обычными методами органической химии, например с помощью хроматографии на силикагеле. Вместо этого необходимо использовать хроматографию на ионообменных носителях, обладающих меньшей емкостью (например, на ДЭАЭ-целлюлозе). Фосфодиэфирный метод пригоден для получения веществ лишь в небольших количествах. Однако нейтрализация зарядов путем этерифи-кации подходящими защитными группами перед фосфорилирова-нием нуклеозидов устраняет проблемы, упомянутые выше. В этом случае продуктом реакции конденсации является фосфотриэфир. Фосфотриэфирный метод позволяет работать с большими количествами веществ. Ниже описаны некоторые защитные группы, используемые для блокирования фосфата. [c.167]

Эта техника имеет преимущества перед распределительной и адсорбционной хроматографией, когда она используется для фракционирования больших количеств материала, растворенного в воде. Очевидно, что основное использование ионообменной хроматографии состоит в выделении и фракционировании полинуклеотидов и нуклеотидов, но величины рКа гетероциклических оснований таковы, что в интервале pH 4—10 некоторые нуклеозиды могут нести по меньшей мере частичный заряд и, следовательно, могут быть разделены этим методом. Для ионообменника используют два основных типа подложки либо полистирол, либо целлюлозу, и оба типа широко использовались для разделения нуклеозидов. В ероятно, наиболее широко используется метод. [c.73]

Ионообменная хроматография. Мор и Штейн [35] разработали метод хроматографии пептидов и аминокислот на И. с., который стал мощным средством анализа бетковых гидролизатов. Однако этот метод не всегда пригоден для белков и полинуклеотидов в связи с тем, что большие полимерные молекулы построены не по принципу плотнейшей упаковки, а И. с. имеют малую емкость. В таких случаях рекомендуют применять сорбенты на основе целлюлозы (см. следуюш,ий раздел). [c.70]

Нуклеиновые кислоты являются одним из наиболее сложных типов биополимеров. В природе встречаются двунитевые и од-нонитевые, циркулярные и сверхспиральные ДНК, рибосомаль-ные, информационные и транспортные РНК, гибриды РНК— ДНК. В процессе исследований приходится иметь дело с синтетическими монотонными или смещанными полинуклеотидами. Нуклеиновые кислоты всех типов являются полианионами даже при нейтральных значениях pH. Все эти факторы позволяют использовать при фракционировании все виды хроматографии ионообменную, адсорбционную, распределительную и гель-проникающую, а также все типы хроматографических сорбентов (см. табл. 38.2). [c.67]

Хроматографию на гидроксиапатите не применяют для выделения высокомолекулярной рРНК, поскольку при этом наблюдается деградация полимера [172] однако репликативные формы РНК и промежуточные формы, похожие в структурном отношении на ДНК, можно фракционировать на гидроксиапатите [71]. Тем не менее, несмотря на детальные исследования процессов фракционирования различных тРНК, вирусной РНК и полинуклеотидов [67], хроматография РНК на гидроксиапатите не нашла широкого применения. [c.84]

Хроматографию на МАК в сочетании с разделением на гидроксиапатите (в градиенте температуры) использовали для выделения природного полинуклеотида поли-с1(А—Т) из фракции нуклеиновых кислот семенников краба an er borealis <рис. 38.20) [176]. [c.90]

Метод анализа кривых элюирования применен в колоночной хроматографии олигоадениловой кислоты на агарозе со связанной полиуридиловой кислотой при нескольких температурах и концентрациях олигоадениловой кислоты. Теория кооперативного связывания олигонуклеотидов с полинуклеотидом была расширена таким образом, что эта хроматографическая система может быть описана теорией теоретических тарелок, как упоминалось в разд. 3.2. [c.55]

Обзор связанных аффинных лигандов, иреимущественно белковой природы, на целлюлозе п ее производных сделан Сильма-ном и Качальским [67], обзор связывания ферментов — Круком и сотр. [11], а связывания нуклеотидов, полинуклеотидов и нуклеиновых кислот — Гиламом [22]. В этих обзорах упомянуто много различных методов связывания. Поскольку в настоящее время целлюлоза находит ограниченное использование в аффинной хроматографии, здесь кратко отмечаются только некоторые из методов связывания. [c.178]

Хроматография гаироко применяется для разделения и очистки полинуклеотидов. Методы, разработанные для определения РНК и ДНК, будут рассмотрены в следующих главах подробное описание этих методов можно найти в соответствующих обзорах [32, 33]. При разработке методов хроматографирования были испытаны колонки из фосфата кальция [34—36], метилированного альбумина [37, 38], полиметакрилата магния (амберлит ШС-50) [39, 53] и като-2 (катионный крахмал) [54] наилучшие результаты были получены при использовании замещенных производных целлюлозы, например эктеола-целлюлозы (целлюлоза, обработанная апихлоргидрином и триэтаноламином) [19, 23, 31, 40—42] или ДЭАЭ-целлюлозы (диэтиламиноэтилцеллюлоза) [43, 44]. При использовании таких колонок наиболее эффективное разделение олигонуклеотидов, содержащих от двух до семи нуклеотидов, достигается путем градиентной элюции мочевиной. С успехом применяются также колонки с сефадексом, обладающим свойством молекулярного сита [45]. Для очистки информационной РНК употребляют колонки из ДНК [46, 47, 48, 49] (стр. 234). [c.34]

Читателю, специализирующемуся в области биохимии белков и нуклеиновых кислот, можно рекомендовать статью Гинодмана Хроматография белков иа ионообмен-ииках и фракционирование смесей, содержащих белки, на колонках с сефадексом в сб. Современные методы в биохимии , под ред. Ореховича В. Н., I, изд-во Медицина , М., 1964. В этой статье весьма подробно и полно рассмотрены практические приемы работы с колонками, заполненными различными гелями, а также некоторые теоретические положения гель-проникающей хроматографии. Данные, полученные при фракционировании дезоксирибонуклеиновых кислот на колонках с гелями, приводит в гл. Выделение и фракционирование нуклеиновых кислот Кирби в сб. Нуклеиновые кислоты , под ред. Збарского И. Б., изд-во Мир , М., 1966. В этом же сборнике Штэелин в гп. Хроматография олигонуклеотидов и полинуклеотидов на колонках обсуждает результаты фракционирования указанных соединений на колонках с ДЭЛЭ-целлюлозой и другими замещенными целлюлозными аниопообменииками, сефадексом и метилированным альбумином.— Прим. перев. [c.110]

Дальнейшее развитие ферментативных методов гидролиза позволит подробнее исследовать порядок чередования мономерных звеньев в цепи ДНК и РНК. Панкреатическая РНК-аза расщепляет цепь РНК между рибозой с присоединенным пиримидиновым основанием и впереди идущей фосфорной кислотой. Гидролизат содержит при этом немного мономерных единиц п значительные количества димеров, тримеров и тетрамеров. Разделение гидролизата РНК производится на DEAE-целлюлозе с элюцией солевым градиентом. Хроматография ди- и тримеров оказывается весьма эффективной. Количества мононуклеотидов и динуклеотидов каждого типа не сильно отличаются от ожидаемых по теории вероятности, если, зная концентрацию каждого тина мономеров в цени и считая их расположение случайньш, рассчитать выход каждого типа двойников после разрыва цепочки около всех пири-мидинов. На три- и тетрамерах уже обнаруживаются сильнейшие Отступления от статистики. Так, например, тринуклеотид АГЦ встречается в РНК из дрожжей в 2,5 раза чаще, чем ГАЦ. Подобные изомерные полинуклеотиды встречались бы одинаково часто, если бы звенья распределялись в цени по закону случая. [c.247]

Концевой полинуклеотид отщепляется одним из известных типов РНК-азы. Панкреатическая РНК-аза рвет цепь около пиримидиновых оснований. Так называемая ТРНК-аза (выделенная из препарата такадиастазы) рвет цепь селективно около гуанина. Далее выделяется с помощью хроматографии на DEAE-целлюлозе только радиоактивный полинуклеотид, он и есть концевой. [c.437]

Величины Rf, полученные для нуклеотидов на слоях PEI-цел-люлозы в различных растворителях, приведены в табл. 24.3. Пользуясь таблицами для выбора подходящих растворителей в зависимости от состава разделяемых смесей, чаще всего удается подобрать такие смеси, которые позволят добиться отличного разделения в две—пять стадий. Очень сложные смеси полинуклеотидов К- Рандерат и Э. Рандерат [68] анализировали методом двустадийной анионообменной хроматографии на тонких слоях полиэтилениминцеллюлозы. Насколько эффективен этот метод, предполагающий многостадийное элюирование, показывает рис. 24.1. Сначала авторы [68] проводили элюирование пробы растворами хлорида лития различной концентрации 2 мин 0,2 М раствором, затем сразу же (без промежуточной сушки) 6 мин 1,0 М раствором и в заключение 1,6 М раствором при общей длине пути элюирования 13,0 см. Все три элюирования велись в одном и том же направлении. После сушки в токе теплого воздуха при температуре < 50°С часть слоя, не нужную для элюирования во втором направлении, соскребали с пластинки, Далее пластинку погружали на 15 мин в 1 л безводного метанола, чтобы удалить хлорид лития. (Время от времени метанол перемешивали, чтобы ускорить растворение солей.) После этого пластинку осторожно (в мягких условиях) сушили, чтобы удалить метанол, и затем элюировали в три стадии буферными растворами муравьиная кислота—формиат натрия (pH 3,4). Сначала элюировали 0,5 М раствором (30 с), затем 2,0 М (2 мин) и наконец 4,0 М при общей длине пути элюирования 15 см. Промежуточной сушки пластинки и в этом случае не проводили. [c.130]

За последние пять лет разработаны различные методы тонкослойной хроматографии для разделения и количественного определения оснований, нуклеозидов и нуклеотидов (с принципами тонкослойной хроматографии можно ознакомиться в работе Мэнголда и др. [1]). Методика в. этой области постоянно изменяется в особенности это касается разработки подходящих хроматографических методов для разделения олиго- и полинуклеотидов. В этой статье описаны методы, которыми весьма успешно пользуются в лаборатории авторов. [c.31]

Олигонуклеотиды можно разделять с помощью тонкослойной хроматографии или электрофореза в тонком слое или же используя оба этих метода (в разных направлениях). Оптимальные условия для разделения сложных смесей олигонуклеотидов в тонких слоях еще не разработаны. Нами установлено, что продукты частичного гидролиза синтетических полинуклеотидов и нуклеиновых кислот хорошо разделяются на тонких слоях анионообменников [32, 33]. По-видимому, весьма перспективен в этом отношении также электрофорез на тонких слоях ионообменников [34]. Недавно описан метод разделения (картирования) продуктов гидролиза РНК панкреатической рибонуклеазой (ЕС 2.7.7.16) и рибонуклеазой Т (ЕС 2.7.7.26) иа слоях немодифицированной це.плюлозы [35]. [c.46]

Метод хроматографии на бумаге позволил получить новые данные по химии нуклеиновых кислот, и с его помощью было изучено строение последних. В этом смысле дапньп метод стал таким же ценным, как и электрофорез на бумаге и хроматография на ионообменных смолах. Полученные за последнее время данные свидетельствуют не в пользу тетрануклеотидной гипотезы. Из нуклеиновой кислоты ферментативным расщеплением были получены полинуклеотиды (от ди- до тетра-), которые после хроматографирования давали характерные пятна на бумаге и после элюирования могли быть подвергнуты более глубокому расщеплению вплоть до мононуклеотидов. Применение метода фракционирования в сочетании с методами хро--матографии и ионофореза па бумаге позволило с помощью специфических ферментов объяснить, какпм образом связаны в полпнуклеотидах компоненты, составляющие их остюву. [c.518]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология