Гистидин, идентификация

Хотя большинство исследователей, пользуясь методом Косселя, обычно выделяют аргинин и гистидин в виде солей для их идентификации, все же в литературе приводится большое число аналитических данных, где содержание этих двух аминокислот высчитано из общего азота очищенных фракций. Эти данные обычно превышают результаты, установленные по весу чистых солей в случае аргинина на 10—15%, в случае гистидина — на 20—30% [494, 422, 643 и др.]. [c.17]

Для обнаружения и идентификации аминокислот на хроматограммах помимо нингидринового теста могут быть использованы и другие цветные реакции. Так, гистидин и другие имидазольные производные можно обнаружить в виде красных пятен, применяя диазореакцию по Паули или варианты этой реакции. Пролин и оксипролин обнаруживаются в виде синих [c.42]

На рис. 16.20, Л и Б приведены две карты электронной плотности с разрешением 2 А. Одна из них соответствует плоскости, в которой находится ион цинка, а вторая — плоскости, расположенной сразу над ним. Наибольшей плотности на картах отвечает ион металла. Вокруг него заметны три координированные группы белка, электронные плотности которых хорошо совмещаются со структурой остатков гистидина (рис. 16.20,В). Так как аминокислотная последовательность пока не известна, идентификация должна считаться лишь предварительной. Интересно, что два из этих трех лигандов (на рис. 16.20, В они расположены левее) относятся к одному и тому же участку пептидной цепи и их разделяет только один остаток. [c.610]

В основе метода динитрофенилирования лежит реакция свободных ЫНг-групп белка или пептида с 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ) в щелочной среде, при которой образуются соответствующие динитрофенильные производные (ДНФ-производные). В реакцию с ДНФБ, кроме свободных а-ЫНг-групп, вступают также е-ННг-группа лизина, 5Н-группа цистеина, ОН-группы оксиаминокислот и имидазольный гетероцикл гистидина. ДНФ-производное белка или пептида подвергают полному кислотному гидролизу. Ы-концевые ДНФ-амино-кислоты экстрагируют из гидролизатов эфиром, отделяя их от свободных аминокислот и ДНФ-производных по другим функциональным группам аминокислот, которые растворимы в воде. Идентификацию [c.145]

Получены экспериментальные доказательства наличия в активном центре химотрипсина двух остатков гистидина и остатка серина, схематически представленных в трехмерной структурной модели предшественника этого фермента (рис. 4.3). Выявление химической природы и вероятной топографии групп активного центра—проблема первостепенной важности. Она сводится к определению природы аминокислот, их последовательности и взаиморасположения в активном центре. Для идентификации так называемых существенных аминокислотных остатков используют специфические ингибиторы ферментов (часто это субстратподобные вещества или аналоги коферментов), методы мягкого (ограниченного) гидролиза в сочетании с химической модификацией, включающей избирательное окисление, связывание, замещение остатков аминокислот и др. [c.123]

Белки дают ряд цветных реакций, обусловленных наличием определенных аминокислотных остатков нли общих химических группировок. Эти реакции широко используются для аналитических целей. Среди них широко известны нингидриновая реакция, позволяющая проводить количественное определение аминогрупп в белках, пептидах и аминокислотах, а также биуретовая реакция, применяемая для качественного и количественного определения белков и пептидов. (При нагревании белка или пептида, но не аминокислоты, с Си 01 в щелочном растворе образуется окрашенное в фиолетовый цвет комплексное соединение меди, количество которого можно определить спектрофотометрически.) Цветные реакции на отдельные аминокислоты используются для обнаружения пептидов, содержащих соответствующие аминокислотные остатки. Для идентификации гуанидиновой группы аргинина применяется реакция Сакагучи — при взаимодействии с а-нафтолом и гипохлоритом натрия гуанидины в щелочной среде дают красное окрашивание. Индольное кольцо триптофана может быть обнаружено реакцией Эрлиха — красно-фиолетовое окрашивание при реакции с п-диме-тиламинобенэальдегидом в Н 804. Реакция Паули позволяет выявить остатки гистидина и тирозина, которые в щелочных растворах реагируют с диазобеизолсульфокислотой, образуя производные, окрашенные в красный цвет. [c.32]

При изучении различных холинэстераз и при использовании разных субстратов было установлено, что величины рК лежат в пределах 5,8—7, а рКа 8,5—10 [16]. На основании этих, а также и некоторых других косвенных данных первоначально Уилсоном, а затем и другими авторами была высказана мысль о прямом участии в каталитическом действии холинстераз имидазольной группы гистидина, характеризующейся значением рК 5,6—7,0. (см. на стр. 112). Вопрос об идентификации кислотной группировки менее ясен. Вряд ли обосновано предположение Лейдлера об участии сульфгидрильной группы, поскольку рядом исследователей показано, что холинэстеразы не являются тиоловыми ферментами [119, 120]. В пользу предположения об участии в действии эстераз фенольного гидроксила тирозина в литературе были проведены некоторые другие доказательства [121]. [c.183]

Следует напомнить об известных трудностях идентификации функциональных групп активных центров ферментов по величинам рК, полученным из изучения зависимости скорости реакции от pH. Во-первых, одна и та же группировка в белках разного строения может иметь неодинаковое значение рК из-за влияния соседних групп. Некоторую помощь в этом случае может оказать измерение теплоты диссоциации ионогенных групп, рассчитываемой по измерениям температурной зависимости рК. К сожалению, для холинэстераз эти термодинамические константы достаточно надежно не измерены. Согласно данным Шукудза и Шинода [122], теплоты диссоциации основной группировки ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки крови человека составляют соответственно 8,5 и 6,5 ккал1моль. Эти величины выше или ниже найденной для диссоциации имидазольной группы гистидина в других белках (6,9—7,5 ккал моль [123]). Если признать, что в обеих холинэсте-разах в качестве основной группировки активного центра выступает имидазол гистидина, то трудно понять столь существенное различие в величинах теплот диссоциации. Во-вторых, даже если измерение активности фермента при разных pH рассматривать в качестве своеобразного титрования функциональных групп активного центра, то полученные результаты нельзя безапелляционно считать отражением прямого участия этих групп в каталитическом акте. Можно представить, что ионы Н и ОН -среды выполняют свою функцию, вызывая не только протонизацию или депротонизацию функциональных групп активного центра, но также и более общую функцию создания и поддержания специфической для каждого фермента третичной структуры. Можно думать, что в создании третичной структуры фермента большую роль играют ионные связи между такими группировками, которые расположены вне активного центра и непосредственно не участвуют в реакции с субстратом. Такие ионогенные группировки при взаимодействии могут сближать друг с другом (или наоборот удалять друг от друга) определенные функциональные группы белка, которые непосредственно участвуют в каталитическом акте. Внешне эта непрямая роль кислотно-основных группировок фермента будет отражаться в форме обычной зависимости кинетических констант (и, V, Кт) от pH, но по существу такая зависимость не дает оснований для решения вопроса, является ли она следствием влияния pH на конформацию белка в районе активного центра или диссоциацию группировки, прямо участвующей в реакции с субстратами. [c.184]

Абдергальден и Стикс [131] впервые получили динитрофенильные производные аминокислот при кипячении щелочных растворов аминокислот с 1-хлор-2, 4-динитробензолом. Соответствующее фторпроизводное, рекомендованное Сангером [132, 133], реагирует с аминокислотами в растворе бикарбоната при комнатной температуре и потому практически более удобно. Все N-динитрофенильные производные аминокислот скрашены в желтый цвет, что облегчает их идентификацию на хроматограммах. Некоторые аминокислоты реагируют более чем с одним молем реагента так, в реакцию с 1-фтор-2,4-динитробензолом вступают как а-, так и со-аминогрупны лизина и орнитина, имино-азот гистидина, фенольная группа тирозина и сульфгидрильная группа цистеина. Поэтому перечисленные аминокислоты образуют бис-динитрофенильные производные. [c.35]

Новая аминокислота тирозин триптофан I фенилаланин [ метионин лейцин I изолейцин валин 1 новая аминокислота пролин треонин гистидин I аланин новая аминокислота I серинI глицин аргинин лизин I глутаминовая кислота ] аспарагиновая кислота. Идентификация и определение (порядок — в первой, коллидиновой, хроматограмме) [c.271]

Применение динитрофенильных производных, введенных в практику Зангером [25] с целью идентификации и количественного определения концевых аминогрупп, позволяет получить ценные сведения о количестве открытых цепей в белке. Кроме того, такие меченые аминокислоты служат в качестве реперных точек при исследовании неполного гидролиза (1346). В этом отношении полезными являются также е -аминогруппы лизина. Путем неполного гидролиза, осуществляемого с помощью кислоты и различных типов ферментов, оказалось возможным разрывать длинные полипептидные цепи в различных точках и путем анализа установить единственно возможную конфигурацию. Этим способом Зангер и Таппи[99]и Зангер и Томпсон [100] определили порядок чередования аминокислот в двух типах цепей, входящих в состав инсулина (табл. 27). Такой подход к проблеме структуры белка был облегчен широким применением новейших микрометодов хроматографии на бумаге и силикагеле и ионофореза. Таким образом, оказывается, что одна из крупнейших проблем химии белка поддается изучению с помощью весьма простых и экономичных методов. Цепи в инсулине имеют различную длину, причем цепь с N-концевым фенилаланином (цепь В) состоит из 30 остатков, а соответствующая глициновая цепь (цепь А) — из 21 остатка. Порядок чередования аминокислот и их содержание даны в табл. 27. Можно отметить следующее. Цепь А не содержит лизина, гистидина, аргинина, треонина, фенилаланина и пролина все эти компоненты входят в состав цепи В, в которой, в свою очередь, совсем нет изолейцина. Не наблюдается ни регулярного чередования аминокислот, ни тенденции к чередованию полярных и неполярных групп. Три ароматические аминокислоты (фен.фен.тир.) расположены последовательно, и два остатка глутаминовой кислоты связаны с двумя остатками ци-стеина (глу.глу.цис.цис.). В обеих цепях содержится шесть цистеиновых остатков, четыре из которых расположены врозь, а только что упомянутые два — рядом друг с другом в молекуле нативного белка все они существуют в форме цистина, но какие из них расположены между пептидными цепями, а какие в самих пептидных цепях — неизвестно. Часть дикарбоновых кислот присутствует в виде амидов — четыре в цепи А и две в цепи В. [c.255]

Затруднения при идентификации С-концевых аминокислот с помощью гидразинолиза имеют место в том случае, когда такими кислотами являются тирозин, цистин, гистидин и триптофан, поскольку при этом обнаруживается большое сходство межд дин1ггрофенилнроизводными (Акабори и сотрудники [1]). Если сократить время гидразинолиза, то можно отщепить концевые ди- и трипентиды (Браупитцер). [c.488]

Мюллер [21] исследовал осаждение нитроиндандионом протеиногенных аминов, аминокислот, бетаинов и подобных биологических веществ и нащел, что бетаин, коламин, лизин и мочевина не осаждаются, между тем как р-аланин, кадаверин, путресцин, гистамин и гистидин тотчас дают осадок, а аргинин, карнозин, креатинин, тирамин и гликоколь, хотя и дают хорошие кристаллические осадки, но образуются они несколько медленно, так что часто осадок появляется только на следующий день. Точки плавления этих солей не резки. На применение нитроиндандиона для выделения и идентификации оснований животного организма указывают также Акерман и Мауэр [22]. [c.34]

Ларсен с сотрудниками [24] с успехом применили нитроиндандион для идентификации аминокислот в микроанализе. Для этого нагревают небольшое количество аминокислоты с насыщенным раствором нитроиндандиона на объективном стеклышке. Полученные кристаллы отсасывают, тщательно высушивают над микропламенем и в поляризационном микроскопе определяют коэффициент преломления. По кристаллографическим и оптическим данным можно определить следующие соединения /-аланин, /-аспарагиновую кислоту, /-цистеин, /-глутаминовую кислоту, глицин, /-гистидин, /-оксипролин, 3,5-дийод-/-тирозин, /-изолейцин, /-лнзпн, /-пролин, /,/-сер,ин и /,/-валин. [c.35]

Методы выделения и идентификации мономеров дают информацию о молекулярной массе олигомера и его субъединиц, их количестве и свойствах, позволяют получать препараты для определения первичной структуры. Если удается получить белок в виде кристаллов, изучение первичной структуры удобно вести параллельно с помощью секвенирования и физических методов (например, рентгеноструктурного анализа), поскольку сопоставление получаемой информации существенно ускоряет ход анализа [158]. Однако такая возможность представляется редко. Часто именно получение достаточно чистых препаратов белка или субъединиц, пригодных для проведения аминокислотного анализа, и составляет одну из главных проблем, поскольку исследуемый белок может присутствовать лишь в незначительных количествах в сложной смеси сопутствующих белков и продуктов их деградации или же исходная смесь может содержать белки с очень близкими свойствами. Если белок плохо растворим и требует более жестких условий для солюбилизации, гетерогенные препараты могут быть получены уже на начальном этапе выделения. Причиной появления гетерогенности можег быть, по-видимому, изменение суммарного заряда из-за дезамидирования амидных групп аспарагина и глутамина, карбами-лирование е-аминогрупп некоторых остатков лизина ионом цианата, присутствующим в растворах мочевины [38], неспецифическая модификация остатков метионина и гистидина при алкилировании цистеина. [c.16]

Причины возможных ошибок в определении аминокислотной последовательности многообразны. Так, гистидин менее устойчив в условиях реакции, чем другие аминокислоты, и преждевременное расщепление связей по остатку гистидина может привести к его потере (пропуску) в полипептидной цепи или, что более обычно, к появлению гетерогенности в последовательности [59, 61]. Неполное отщепление аминокислоты при обработке безводной кислотой, неудовлетворительная экстракция тиазолинона или его частичная деструкция могут быть причинами ошибочной идентификации на данной стадии аминокислотного остатка, являющегося остаточным от предшествующего. Вероятность ошибки возрастает в тех случаях, когда Ы-концевыми становятся остатки пролина или триптофана, дан-спльные производные которых разрушаются в процессе гидролиза. Усложняет процесс идентификации возможная экстракция [c.358]

Рнс. 4.9. Реакция аминокислоты с 1-фтор-2,4-динитробензолом (реагентом Сенгера). Реагент назван в честь нобелевского лауреата (1958 г.) биохимика Фредерика Сенгера, который использовал его для определения первичной структуры инсулина. Вначале арилируют (с количественным выходом) всех свободные аминогруппы, после гидролиза пептида образуются 2,4-динитрофенил-производные аминокислот, обладающие яркой желтой окраской. Количественный анализ этих производных осуществляют спектрофотометрическими методами. С динитрофторбензолом реагируют также Е-аминогруппа лизина, имидазольная группа гистидина, ОН-группа тирозина и 8Н-группа цистеина. Динитрофе-нильные группы не отщепляются при кислотном гидролизе и используются для идентификации N-кoнцeвыx аминокислот в полипептидах. [c.38]

Влияние pH на скорость ферментативных реакций может быть обусловлено различными факторами. Ферменты, подобно другим белкам, являются амфолитами и имеют большое число ионоген-ных групп. Если функционирование фермента зависит от наличия некоторых специфических группировок, то каждая из них в дан-ных условиях должна находиться в определенном состоянии (не-ионизированном или ионизированном). Нередко оказывается возможным идентифицировать участвующие в катализе ионогенные группы активного центра путем анализа зависимости активности фермента от pH и сопоставления полученных данных с известными величинами р/С ионогенных групп белков (табл. 5.2). В качестве примеров можно указать на идентификацию каталитически активных остатков гистидина в активных центрах трипсина, химотрипсина и субтилпзина и тиоловой группы в активном центре папаина (гл. 9). На участие ионогенных групп в функционировании ферментов указывает также влияние ионной силы на скорость ряда ферментативных реакций (это влияние сильно выражено при действии карбоксипептидазы и уреазы). Такого рода эффект обычно наблюдается при неферментативном катализе, осуществляемом ионогенными соединениями. [c.260]

Метод ЯМР особенно ценен для определения р/Са гистидино-вых остатков в белках. Сигналы от протонов при углеродных атомах С-2 и С-4 сдвинуты в слабопольную область по отношению к сигналам от остальных атомов данной белковой молекулы и могут быть разрешены в растворах ОгО. При протонировании происходит изменение величины химического сдвига и, следовательно, гистидиновые группы можно легко оттитровать. Когда в белке присутствует более чем один гистидиновый остаток, возникают трудности, связанные с идентификацией от дельных р/Са. Решить эту задачу для рибонуклеазы помогли химическая модификация, избирательное дейтерирование и выяснение кристаллической структуры данного фермента в настоящее время идентифицированы р/Са всех четырех гистидиновых остатков рибонуклеазы 114, 15]. [c.184]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология