Аминокислоты интенсивность окраски с нингидрином

Первичные а-аминокислоты реагируют с нингидрином , давая интенсивное фиолетовое окрашивание. Реакция осуществляется в две стадии. Первоначально аминокислота окисляется до низшего альдегида или кетона с выделением аммиака и диоксида углерода. Затем аммиак взаимодействует с продуктом восстановления нингидрина и с непрореагировавшей молекулой нингидрина, образуя фиолетовое соединение. Количественное образование вещества наряду с интенсивностью его окраски делает эту реакцию очень ценной. Она широко используется как для качественного определения аминокислот (например, как опрыскиватель при хроматографии), так и для количественной оценки с помощью спектрофотоыетрических методов. Метод обладает большой чувствительностью благодаря высокой [c.295]

Наиболее общим методом определения концентрации пептидов является колориметрия продуктов реакции с нингидрином [2]. Это один из наиболее чувствительных колориметрических методов. Для обнаружения аминокислот и пептидов разработаны как обычный, так и полностью автоматизированный варианты, причем нингидриновый реагент не вызывает коррозии и его можно подавать обычным микронасосом. Реакция идет по свободным аминогруппам, но в некоторых случаях хромофор образуется с низким выходом. Данные по окрашиванию дипептидов можно найти в работе [3]. У всех дипептидов, содержащих в качестве Ы-концевой аминокислоты аргинин, треонин, серин, глутаминовую кислоту, глицин, фенилаланин, метионин, лейцин и тирозин, интенсивность окраски составляет 1,6-10 у лейцина эта величина составляет 1,7-10 . У дипептидов с М-концевым лизином и аспарагиновой кислотой интенсивность окраски несколько выше (на 20 и 29% соответственно), а дипептиды с Ы-концевым гистидином и триптофаном проявляются несколько слабее (42 и 67% соответственно от средней интенсивности). Дипептиды с М-концевым пролином, валином и изолейцином окрашиваются очень слабо [2,7 6,4 и 8,5% от средней (1,6- 10 ) интенсивности]. [c.391]

Белки также дают эту реакцию. При добавлении к раствору белка нингидрина и нагревании его до кипения получается синее окрашивание. Растворы белка дают, однако, менее интенсивную окраску, чем растворы аминокислот в той же концентрации. [c.279]

На II стадии образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярными количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя синефиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570 нм) пропорциональна количеству аминокислоты [c.41]

После полного гидролиза белка производится количественное онределе-ние каждой из аминокислот, присутствующих в гидролизате. Для разделения аминокислот чаще всего применяется метод ионообменной хроматографии. В качестве ионообменника обычно используют сульфополистирольный катионит. Смесь аминокислот вносится в верхнюю часть колонки при pH 3 в этих условиях индивидуальные аминокислоты полонштельно заряжены. Аминокислоты в форме катионов сорбируются на сульфополистирольной смоле (содержащей группы — SOg Na ), замещая часть ионов натрия, и удернги-ваются на материале колонки электростатическими силами. Очевидно, что прочность сорбции аминокислоты возрастает с увеличением ее основности. После внесения смеси начинается элюция аминокислот при постепенном увеличении pH и 1тонной силы буферных растворов, пропускаемых через колонку. В этих условиях положительный заряд на аминокислотах постепенно нейтрализуется и ионные взаимодействия ослабляются. Первыми с колонки снимаются кислые аминокислоты (глутаминовая и аспарагиновая кислота), затем нейтральные и, наконец, основные. С помощью этого метода можно разделять все аминокислоты, обычно встречающиеся в белках, поскольку прочность сорбции аминокислоты смолой зависит как от ионных, так и от неионных взаимодействий. Сульфополистирольный катион адсорбирует аминокислоты достаточно избирательно, так что все нейтральные аминокислоты, которые нельзя разделить с помощью ионного обмена, тем не менее элюируются с колонки в разных фракциях. Индивидуальные аминокислоты, элюируемые с колонки, собираются автоматическим коллектором фракций. Затем их количественно определяют путем измерения интенсивности окраски, возникающей при действии нингидрина. В настоящее время промышленность выпускает несколько типов автоматических амино- [c.57]

Этот метод представляет особую ценность для тех пептидов, которые не дают хорошей окраски с нингидрином. Интенсивность окраски приблизительно пропорциональна числу пептидных связей, хотя иногда чувствительность может быть довольно далека от ожидаемой. Пептиды, в состав которых входят главным образом плохо обнаруживаемые этим методом аминокислоты, часто также не удается обнаружить. [c.395]

Реакция с нингидрином применяется для определения аминокислот по интенсивности окраски и по выделению углекислого газа. [c.19]

Нингидриновая реакция. Реакция эта была нами описана уже выше в главе, посвященной аминокислотам. Белки также дают эту реакцию. При добавлении к раствору белка нингидрина и нагревании его до кипения получается синее окрашивание. Растворы белка дают, однако, менее интенсивную окраску, чем растворы аминокислот в той же концентрации. [c.282]

КИСЛОТНЫХ анализаторов. Эти аппараты автоматически разделяют аминокислоты на ионообменной колонке, собирают их, добавляют нингидрин и нагревают смесь для развития окраски, после чего измеряют интенсивность окраски и регистрируют ее в виде графика. На фиг. 11 приведена типичная запись результатов автоматического хроматографического анализа смеси аминокислот. Положение пика, отвечающего канедой из аминокислот на хроматограмме, строго фиксировано, причем измерение площади пика позволяет определить содержание соответствующей аминокислоты. Точность такого анализа (занимающего несколько часов) составляет обычно 2%. [c.58]

Следующая часть этого раздела посвящена оценке результатов. В процессе анализа аминокислот оценивается интенсивность окраски (обычно при 570 нм) продуктов реакции аминокислот с нингидрином. В начале элюирования самописец регистрирует только нулевую линию, которая может сдвигаться при изменении состава подвижной фазы. Если проводится количественный анализ, такие сдвиги следует учитывать. Интегратор обрабатывает сигнал детектора очень быстро (40— 2000 имп/с), в результате чего регистрируется прохождение даже одиночного компонента. В интеграторе можно предусмотреть автоматическую коррекцию нулевой линии, и он начнет интегрирование, только когда нулевая линия существенно изменится за несколько секунд. Некоторые управляющие элементы, которые ранее являлись частью анализатора, теперь функционально включены в интегратор. Чтобы результаты расчета были правильными, важно принять во внимание форму пиков. [c.75]

Для обнаружения и количественного определения аминокислот по окончании разделения высушенные хроматограммы обрабатывают 0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне. Аминокислоты проявляются в виде фиолетовых пятен пятна вырезают, окрашенный комплекс извлекают спиртовым раствором сернокислой меди и интенсивность окраски измеряют при длине волны 575 ммк. По калибровочным кривым, построенным для каждой аминокислоты, находят концентрацию компонентов смеси. Определение цистина производят после превращения его в цистеиновую кислоту путем предварительного окисления белка надмуравьиной кислотой (см. гл. IV, 1). [c.44]

Аммиачная соль енольной формы этого соединения окрашена в интенсивный красно-фиолетовый или пурпурно-синий цвет. Оказалось, что в определенных пределах интенсивность окраски пропорциональна количеству аммиака, участвующему в реакции, и, следовательно, исходному количеству аминокислоты. Эта реакция широко используется для качественного и количественного определения аминокислот, особенно методом хроматографии на бумаге, и очень чувствительная позволяет устанавливать содержание тысячных долей миллиграмма аминокислот. Нингидрин может быть заменен изатином, имеющим близкое строение [c.191]

Пятна аминокислот приобретают в результате реакции с нингидрином фиолетовый цвет. Интенсивность окраски зависит от концентрации аминокислоты и сравнивается со шкалой. На основе сравнения определяют содержание аминокислоты в гидролизате. Чувствительность реакции 0,5 мкг аминокислоты в 1 мкл. [c.43]

Через несколько часов, когда можно ожидать разделения аминокислот, бумагу вынимают из ванночки и растворитель удаляют высуи иванием. После этого для лучшего разделения аминокислот лист бумаги поворачивают на 90° и снова помещают в ванночку и по бумаге пропускают другой растворитель. После вторичного пропускания растворителя бумагу обрабатывают каким-либо реактивом, дающим окрашивание при взаимодействии с аминокислотами, чаще всего нингидрином или изатином. На бумаге появляются окрашенные пятна, соответствующие отдельным аминокислотам. По месту положения пятен и интенсивности их окраски судят о наличии и содержании в гидролизате белка тех или иных аминокислот. Фотография хроматограммы показана на рисунке 21. Метод распределительной хроматографии на бумаге позволяет быстро и точно определить содержание аминокислот. В последние годы хроматографические методы успешно применяются для разделения и определения сахаров, органических кислот и ряда других соединений. [c.218]

По первому из них фильтровальную бумагу, на которой разделена смесь аминокислот, опрыскивают раствором реактива, дающего характерное окрашивание,—удобнее всего раствором нингидрина в н-бутиловом спирте. Образуется интенсивная окраска, меняющаяся в зависимости от строения аминокислоты от голубой до оранжевой. Так как нингидрин является реактивом на аминогруппу, то он дает окрашивание со всеми веществами, ее содержащими, как, например, с аминокислотами, пептидами, полипептидами и пептонами. Чувствительность реакции меняется в пределах от 0,1 до 25 [c.159]

Реакция с нингидрином. При взаимодействии с нингидри-ном аминокислоты разрушаются с выделением аммиака, углекислоты и образованием альдегидов. Два остатка нингидрина, связанных друг с другом азотом аммиака, освободившегося при распаде аминокислоты, образуют сложное соединение, обладающее сине-фиолетовой окраской. Интенсивность окраски пропорциональна количеству имеющейся в растворе аминокислоты. Реакция эта очень чувствительна и широко используется в настоящее время для количественного определения аминокислот хроматографическим методом (с этим методом учащемуся предстоит знакомиться в курсе биологической химии). [c.242]

Реакцию с нингидрином можно проводить также в присутствии хлорида олова В определенных условиях при смешении с эквимолекулярным количеством нингидрина почти все аминокислоты образуют окраски одинаковой интенсивности, которые мол<но измерять в спектрофотометре при 570 ммк. В присутствии ионов других металлов чувствительность реакции с нингидрином сильно уменьшается [c.705]

Если вещества бесцветны, они могут быть обнаружены на фильтровальной бумаге только при помощи специальных физических или химических методов. Все аминокислоты дают, например, окраску с нингидрином. Поэтому при определении аминокислот их проявляют , смачивая раствором нингидрина фильтровальную бумагу. На бумаге появляются окрашенные пятна, расположенные на разной высоте, в соответствии с тем, как распределились аминокислоты в токе жидкости. По месту положения пятна и интенсивности его окраски можно определить наличие той или иной аминокислоты и ее концентрацию в исследуемой смеси аминокислот (рис. 7). [c.35]

Подкисленный или подщелоченный перманганат калия окисляет очень многие соединения, образуя при этом пятна от желтой до белой окраски на фиолетовом фоне хроматограмм. После сушки фон становится коричневым, а через несколько суток даже исчезает. Для обнаружения веществ кислотного или основного характера также пригодны кислотно-основные индикаторы в водном или спиртовом растворе. Раствором динитро-фенилгидразина обнаруживают вещества, содержащие карбонильную группу. В частности, с ним интенсивно реагируют ароматические альдегиды и кетоны. Раствор нингидрина — очень чувствительный реагент на аминокислоты и вообще алифатические амины. [c.95]

Новый метод анализа аминокислот быстро развивался. Появилась возможность с его помощью приступить к решению ряда сложных, казавшихся неразрешимыми проблем, и прежде всего проблёмы определения первичной структуры белков. Вскоре стало очевидным, что анализ аминокислот в его первоначальном варианте слишком трудоемок и недостаточно эффективен. Ввиду этого был поставлен ряд исследований по механизации трудоемких операций и совершенствованию организации эксперимента. Основной вклад в решение этих задач вновь внесла группа исследователей под руководством Мура и Стайна [4]. Благодаря проведению реакции аминокислот с нингидрином в проточном капиллярном реакторе и измерению интенсивности окраски на регистрирующем проточном фотометре трудоемкая обработка фракции была преобразована в непрерывный процесс. Таким образом, на основе аналитического метода был создан новый прибор — аминокислотный анализатор. Выпуск и дальнейшее усовершенствование этого прибора были предприняты промышленными фирмами. Последующие усилия были направлены на повышение эффективности и чувствительности анализа. Первое время причиной низкой эффективности прибора служила длительность элюирования. Основой для дальнейшей оптимизации процесса послужила теоретическая работа Гамильтона [5], в которой было показано, что повышения эффективности можно достигнуть путем увеличения скорости подачи элюента и уменьшения размеров зерен ионита. В результате многочисленных модификаций ионитов (а эта работа все еще продолжается) удалось более чем в 10 раз сократить время элюирования без снижения разрешения. Сокращение продолжительности анализа [c.306]

Отмечается, что интенсивность и устойчивость окраски в среде бутилового спирта выше, чем в воде [116]. Другие аминокислоты образуют с нингидрином продукты, не экстрагирующиеся изобути-ловым спиртом в указанных условиях. [c.169]

Весьма существенна зависимость интенсивности окраски раствора от времени проведения реакции, т. е. от времени нагревания. Графически эта зависимость представляет собой кривую с максимумом, характерную для консекутивной реакции, указывающую на то, что в данном случае одновременно протекают, по крайней мере, две реакции образование окрашенного соединения (ди-кетогидриндилидендикетогидринамина) и разрушение его с образованием неокрашенных продуктов. Интересно, что увеличение концентрации нингидрина в реакционной смеси, способствуя более полному протеканию первой реакции, в то же время ускоряет вторую, т. е. избыток нингидрина разрушает образующееся окрашенное соединение. Вследствие этого чувствительность реакции аминокислот с нингидрином в водном растворе сравнительно невелика. Таким способом можно определять аминокислоты в количествах 25—80 мкг и более в пробе (в пересчете на аминный азоту. Окраска раствора неустойчива и развивается довольно неравномерно. Более равномерное развитие окраски наблюдается при связывании образующегося в результате реакции аминокислот с нингидрином соединения в комплекс с ионами некоторых тяжелых металлов, например с ионами двувалентного кадмия. [c.64]

Количественное определение аминокислот. После получения хроматограмм количественно определять отдельные аминокислоты можно двумя методами при помощи нингидриновой реакции с метилцеллосольвом (мономе-тиловый эфир этиленгликоля) и по интенсивности окраски медных производных аминокислот с нингидрином. [c.42]

На основе нингидриновой реакции были разработаны методы количественного определения аминокислот, в частности метод распределительной хроматографии на бумаге, впервые внедренный в 1944 г. (А. Мартин и Р. Синдж). Эта же реакция используется благодаря своей высокой чувствительности в автоматическом анализаторе аминокислот. Впервые такой прибор сконструировали Д. Шпакман, С. Мур и У. Стейн (рис. 1.7). После разделения смеси аминокислот в колонках, заполненных специальными ионообменными смолами (сульфополистирольный катионит), ток элюента из колонки поступает в смеситель, туда же поступает раствор нингидрина интенсивность образующейся окраски автоматически измеряется на фотоэлектроколориметре и регистрируется самописцем. Этот метод нашел широкое применение в клинической практике при исследовании крови, мочи, спинномозговой жидкости. С его помощью за 2—3 ч можно получить полную картину качественного состава аминокислот в биологи- [c.42]

Количественное определение аминокислот по интенсивности окраски медных производных аминокислот с нингидрином проводят следующим образом. Хроматограммы обрабатывают 0,5%-ным раствором нингидрина в 95%-ном ацетоне, содержащим 1% уксусной кислоты. Для хроматограмм, у которых растворителем служил фенол в фосфатном буфере, концентрацию уксусной кислоты повышают до 3%. Обработанные хроматограммы выдерживают над серной кислотой и глицерином в течение 16 часов при комнатной температуре. После этого окрашенные пятна аминокислот вырезают из хроматограмм и кладут в пробирки. В каждую пробирку наливают по 8 мл 75 /о-ного этилового спирта, насыщенного Си504 бИаО. Пробирки выдерживают в течение 1 часа в темноте и затем растворы колориметрируют на фотоэлектроколориметре ФЭК-М против контроля. При ко-лориметрировании растворов, элюированных из хроматограмм, у которых одним из растворителей служил бутиловый спирт, используют синий светофильтр, а при использовании в качестве растворителя фенола в фосфатном буфере (pH 12,0) более точные результаты получаются с зеленым светофильтром. Оптическую плотность растворов определяют по сравнению с контролем. [c.43]

Величины для -аминоспиртов и аминокислот для первых трех из этих систем (при хроматографировании па бумаге ватман № 1 при 20—22") приведены в табл. 32. Как правило, -аминоспирты движутся впереди соответствующих аминокислот, а интенсивность окраски при реакции -аминоспиртов с нингидрином часто составляет только 10—20 о той величины, которую дают аминокислоты. Многие -аминоспирты могут быть окислены до аминокислот с хорошим выходом путем нагревания с суспензией окиси серебра при 100° в течение многих часов [35]. Ионы серебра удаляют в виде хлорида серебра, а образовавшиеся аминокислоты адсорбируют на небольшой колонке с ионитом дауэкс 2 (в форме свободного основания). Путем элюирования 1 п. НС1 получают раствор ам1Шокислот для последующей идентификации. [c.205]

Автоматический аминокислотный анализатор Мура и Штейна. Раствор, содержащий гидролизат ферментного белка, нагружается на одну из колонок с ионообменной смолой. Два насоса (нарисованы внизу справа) прокачивают через колонки растворы солей. Третий насос добавляет к элюату, вытекающему из колонки, цветной реактив (нингидрин). Полученная смесь пропускается через кипящую водяную баню, где происходит реакция между аминокислотами и цветным реактивом. Затем жидкость проходит через ячейку фотометра, который измеряет интенсивность образовавшейся окраски. Эта интенсивность окраски непрерывно записывается автоматическим самописцем. [c.84]

Над пиками интенсивности окраски написаны названия аминокислот, последовательно элюируемых различных аминокислот нингидрином. (Пролин окрашивается слабее других аминокислот.) Гисти- [c.86]

После проявления хроматограммы и испарения растворителя ее обрабатывают раствором индикатора, который вызывает окрашивание хроматографируемых веществ и таким образом позволяет определить их положение на бумаге. Раствором индикатора (табл. 25) обычно опрыскивают поверхность бумажной полоски, где прошел растворитель. Выбор индикатора полностью зависит от природы хроматографируемого вещества. Например, при хроматографии аминокислот широко применяют нингидрин (трикето-гидринденгидрат). При опрыскивании хроматограммы 0,1—0,2%-ным раствором нингидрина в бутаноле-1 или этаноле окрашенные пятна появляются через 24 часа. Реакцию можно ускорить осторожным нагреванием хроматограммы после опрыскивания при 90—100° в течение 10 мин. В случае окрашенных соединений (красители, нитросоединения и т. п.) применения индикатора не требуется, хотя для увеличения интенсивности окраски пятен хроматограмму часто опрыскивают сильно разведенными растворами щелочей и комплексообразующих агентов. Флуоресцирующие при облучении ультрафиолетовым светом вен ества часто обнаруживают облучением хроматограммы маленькой ультрафиолетовой лампой. Для распыле- [c.363]

Иемм и Кокинг [98] разработали упрощенную методику, по которой смешивают 0,5 мл 0,2 М цитратного буфера с pH 5, 1,2 мл раствора нингидрина и цианистого калия в метилцеллозольве VI 1 мл фракции аминокислоты, после чего нагревают 15 мин при 100°. Сообщается, что нингидриновый реагент устойчив в течение недели, а интенсивность окраски сохраняется в течение 3 час перед разбавлением или в течение 1 час после разбавления смесью спирт — вода (60 40). Большинство аминокислот дает теоретический выход ДИДА исключение составляют лизин (108%), фенилаланин и тирозин (89%), триптофан (83%) и аммиак (33%). Пониженная чувствительность к аммиаку (но сравнению с реагентами, содержащими хлористое олово) неожиданна в свете повышенных выходов ДИДА для большинства аминокислот. Для оиределения самих аминокислот, однако, это является преимуществом, так как приводит к меньшим и лучше воспроизводимым значениям оптической плотности растворов сравнения. Реагент, содержащий цианид, позволяет также уменьшить время, менее строго выдерживать условия нагревания и экономить нингидрин, который не нужно хранить в атмосфере азота [98]. [c.146]

Применение одной из количественных модификаций нингидринового метода (см. стр. 144) к общему гидролизату представляет собой чувствительный метод определения белка, более строго обоснованный, чем вышеописанные методики. В применении к гликопротеинам нингидриновый метод нуждается в существенных поправках на аммиак (образующийся при расщеплении амидных групп, сиаловых кислот и гексозаминов) и гексозамины, которые тоже реагируют. Гидролизаты разных белков не дают с нингидрином идентичных интенсивностей окраски на единицу веса белка отчасти за счет различного веса остатков (и образования окраски) различных аминокислот, а также, что более существенно, за счет различного содержания в них имипокислот, практически не дающих окрашивания при длине волны 570 ммк, при которой производятся измерения (см. стр. 149). [c.151]

Разделение аминокислот можно проводить разными методами, но для анализа аминокислотного состава полипептида после его гидролиза обычно используют автоматическую ионообменную хроматографию. Полное разделение аминокислот, их идентификация и количественная оценка занимают менее трех часов. В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Ыа+-форме. Когда кислотный гидролизат при pH 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с Na+. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях pH и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную— двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком (рис. 3.12). [c.31]

Для обнаружения аминокислот и пептидов применяют иингидрин. Сухую хроматограмму (рис. 8.40) пофужают в раствор нингидрина в ацетоне, обычно 0,2%-ный (при этом достагается однородное покрытие бумаги реагентом), сушат непродолжительное время. При комнатной температуре пятна аминокислот проявляются примерно через 1 ч, а их окраска достигает максимальной интенсивности примерно за 8 ч. Пятна пептидов обнаруживаются медленнее. Проявление ускоряется, если ф0мат0фамму нафевают при 50—60 С в сушильном шкафу. [c.336]

Для обнаружения N-мeтилaминoки лoт (которые обычно дают очень слабую окраску с нингидрином) в присутствии свободных аминокислот используют специальный реагент. Смешивают равные объемы 0,33%-ного раствора нингидрина в трет-бутиноле и смеси ледяная уксусная кислота - вода - пиридин (1 5 5). Опрыскивают и нагревают 10-15 мин при 100-110°С. Первичные амины и Н-метиламинокислоты дают пурпурные пятна сравнимой интенсивности. При опрыскивании водным раствором нингидрина, приготовленным путем растворения нингидрина в н-бутаноле, насыщенном водой и содержащем 2% уксусной кислоты, N-мeтилaминoки лoты дают пятна слабой интенсивности. [c.390]

Чаще всего для обнаружения аминокислот и пептидов применяется нингидрин (гидрат трикетогидриндена), так как он образует окрашенные продукты. Самый простой метод обнаружения заключается в следующем. Сухую хроматограмму погружают в раствор нингидрина в ацетоне, чаще всего 0,2%-ный (при этом достигается однородное покрытие бумаги реагентом), сушат в течение непродолжительного времени и помещают в большой ящик, стенки которого опрыскивают спиртовым раствором лимонной кислоты, чтобы исключить попадание на них аммиака. При комнатной температуре пятна аминокислот обнаруживаются примерно через час, и их окраска достигает оптимальной интенсивности примерно за 8 ч. Пятна пептидов обнаруживаются медленнее, поэтому лучше всего выдержать хроматограмму в этом ящике до следующего дня. Появление цветных пятен ускоряется, если хроматограмму нагревают при 50—60 °С. [c.125]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология