Замораживание и оттаивание белко

Нередко для полного разрушения клетки требуются значительные усилия. Здесь может быть полезным, кроме механического разрушения, такое воздействие, как чередующееся быстрое замораживание и оттаивание. Нередко хорошие результаты дает быстрое замораживание в жидком воздухе или азоте с последующим измельчением замороженного препарата в ступке или фарфоровой мельнице. Для особо прочных клеток (например, некоторых бактериальных), а также для глубокого разрушения отдельных элементов животной клетки (например, митохондрий) рекомендуется обработка ультразвуком. Варьируя мощность источника и частоту колебаний, можно, как правило, подобрать режим воздействия, при котором не происходит денатурации извлекаемого белка. [c.15]

Сухие нативные белки денатурируются при сильном растирании их порошков [164]. В этих случаях денатурация, очевидно, обусловлена механической деформацией пептидных цепей или их разрывом. Большинство белков не денатурируется, если их растворы подвергать повторному замораживанию и оттаиванию [126]. Однако растворимость липопротеидов и биологические свойства некоторых антител меняются при таком воздействии [28]. Вопрос о денатурации при замораживании имеет очень большое значение при разрешении ряда проблем, касающихся технологии замораживания пищевых продуктов [165]. [c.152]

Для успешного вьщеления ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур лизосом, митохондрий, ядер и др., которые имеют в своем составе многие индивидуальные ферменты. Для этого используют специальные мельницы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения ферментов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют небольшие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обрабатывают их энзимами — лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при вьщелении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (нейтральные значения pH, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений). [c.79]

Таким образом, единственная возможность сохранения продукта без сущки сводится к замораживанию. При размораживании продукт претерпевает в значительной степени синерезис и из белков иногда с трудом удаляется вода. Изучение явления замораживания белков в суспензии (Масто и Дэвин, результаты не опубликованы) показало, что белки имеют склонность собираться в пластинки, разделенные кристаллами чистой воды. Образование кристаллов льда выражено тем больше, чем медленнее идет замораживание это создает очень сильное сжатие, направленное на белки, что вызывает их дегидратацию и может создавать связи между ними, которые необходимо разрывать в процессе размораживания. Наоборот, при быстром замораживании образуются очень мелкие кристаллики льда, которые не изменяют перераспределения белков в воде после оттаивания. Техника замораживания путем смешивания с сухим льдом, т. е. твердой двуокисью углерода (процесс Криодроп фирмы Air Liquid ), обеспечивает очень быстрое охлаждение шариков продукта, пористая структура которого облегчает регидратацию, т. е. повторное насыщение водой. Когда до употребления замораживают эти белковые продукты с содержанием воды, сходным с содержанием влаги в мясе, то перед замораживанием суспензию необходимо сконцентрировать. Такое концентрирование до 30—35% сухого вещества можно получить только длительной сушкой, которая плохо поддается переводу на промышленную технологию. [c.450]

В пробах, содержащих суспензию подвергавшихся замораживанию и оттаиванию митохондрий печени крысье количество окисленного диметил-п-фенилендиамина составило 415,5 34 нмоля на 1 мг белка в 1 мин. [c.49]

Перевод белков ткани в раствор. Гомогенизация — перевод исследуемого материала в гомогенное состояние. При этом используются ступки, ножевые, пестиковые гомогенизаторы, ультразвук, замораживание — оттаивание и прочие способы для разрушения структур тканей. Экстракция белков проводится обычно параллельно с гомогенизацией. Ввиду того что большинство белков тканей хорошо растворимы, для экстракции применяют 8-10% растворы солей (Na l, K l и др.) буферные растворы органические растворители и детергенты, "нарушающие гидрофобные взаимодействия сахарозу, глицерин. Осветление гомогената (экстракта) осуществляется [c.49]

Некоторые вирусы сохраняются при -270 °С. Лекарственное сырье, многие лекарственные и иммуно-биологические препараты, а также пищевые продукты хранят при температуре от О °С до +10 °С (температура бытового холодильника). При этой температуре резко замедляется метаболическая активность и размножение большинства микроорганизмов (исключение составляют психрофиль-ные и психротрофные микроорганизмы). Разрушение и гибель части микробных клеток вызывают повторное замораживание и оттаивание материалов. Высокие температуры губительны для микробов, однако разные виды обладают неодинаковой чувствительностью. Так, менингококки гибнут уже при комнатной температуре, возбудитель сифилиса — при +40 °С, возбудитель дизентерии при +60 °С, бруцеллы — при +100 °С. Споры бактерий погибают лишь через 2—3 ч кипячения. При температурах выше +60 °С в обычных условиях происходит денатурация белка, ведущая к инактивации ферментов и разрушению микробных структур. [c.432]

К физическим факторам могут быть отнесены температурный—нагревание растворов выше 50—60° С многократное чередование замораживания и оттаивания денатурация под высоким давлением в 1000 кг/см и выше так, напрнмер, ферменты трипсин и химотрипсин при pH 5,0—5,2 под воздействием давления 7750 кг см через 5 мин инактивируются на 50% денатурация при воздействии ультразвуковых волн связана с разворачиванием молекул, а при более сильном воздействии ультразвука происходит даже paзpyшefIi e ковалентных связей при образовании мономолекулярных пленок на поверхности белковых растворов наблюдается так называемая поверхностная денатурация белка ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация вызывают химические говреждеиия белковой молекулы, разрушая водородные связи, окисляя дисульфидные группировки, обусловливают исчезновение нативных третичных и вторичных структур белка. Интересными также являются наблюдения, указывающие на процессы денатурации, происходящие при старении белков. [c.209]

Химический состав дрожжей зависит от их расы, технологии выращивания, физиологического состояния. Содержание влаги в бруске прессованных дрожжей, поступающих в торговлю, составляет около 75%. Кроме того, в состав дрожжей входят белки, аминокислоты, витамины и минеральные вещества. Оптимальная температура деятельности дрожжей в случае спиртового брожения составляет 29—30°С. Свежеприготовленные прессованные дрожжи могут сохранять свою способность к сбраживанию при пониженных положительных температурах в течение одной-двух недель. Прессованные дрржжи хорошо переносят минусовые температуры и в замороженном состоянии могут храниться длительное время. Оттаивание и повторное замораживание убивает их. Сбраживание сусла можно производить и с помощью сухих дрожжей. Эти дрожжи содержат около 8% влаги и при комнатных температурах могут сохранять способность к сбраживанию в течение нескольких месяцев. Спиртовые дрожжи практически прекращают размножаться при доли спирта в бродящей среде равной 5 об.% и перестают сбраживать сахара, если содержание спирта достигает 12—13 об.%. Эта концентрация спирта должна рассматриваться как предельная при подготовке сусла в бытовых условиях. Благоприятным для сбраживания является сусло, содержащее сахаров 10—18 мас.%, и поэтому в промышленном производстве исходная доля сахаров в сусле обычно составляет 12—18 мас.% и не превышает 20 мас.%. Получающаяся в результате брожения такого сусла зрелая бражка содержит 5—9 об.% спирта. При этом содержание несброженных сахаров не превышает 3—5 г на [c.109]

Из множества способов измельчения сырья в промышленном производстве ферментных препаратов применение нашл различные способы механического разрушения тканей и клеток (с помощью мясорубок, куттеров, гомогенизаторов, растиранием). Кроме того, используют действие органических растворителей, автолиз, например дрожжей, реже — замораживание и оттаивание. Действие ультразвука или вводимых извне ферментов— лизоцима, целлюлаз и т. п.—применяется мало. Удаление балластных белков кратковременным прогреванием или изменением pH среды используется во многих производствах. Можно отметить, что эти операции, легко проводимые в лабораторных условиях, становятся довольно опасными в производстве, когда они выполняются с большими количествами веществ и в связи с этим замедляются. Здесь необходим тщательный контроль стабильности (денатурации и инактивирования) основного выделяемого белка. Это соображение, впрочем, относится практичес ки ко всем операциям препаративной химии ферментов. [c.156]

Извлечение белков из геля связано с известными затруднениями. При замораживании и оттаивании геля образуется губчатая масса, из которой можно отсосать раствор, содержащий белок, но более высокий выход получают центрифугированием при умеренной скорости. При продолжительном хранении геля в замороженном состоянии происходит необратимая адсорбция некоторых белков. Гордон [20] описал остроумный метод, согласно которому белки из ломтиков геля удаляли путем вторичного электрофореза и улавливали их в небольшой объем раствора по одну сторону барьера из целлофановой пленки. Этот метод дает хорошие результаты в опытах с белками сыворотки, за исключением у-глобулпна. [c.257]

Самый лучший способ длительного хранения белковых растворов состоит поэтому в том, чтобы хранить их в замороженном состоянии, примерно при —10°. Так как при этой температуре бактерии не могут размножаться, то стерилизация раствора становится излишней. В лаборатории автора растворы антител и ферментов хранятся в замороженном состоянии в течение многих месяцев, а некоторые — в течение многих лет без какой-либо заметной потери биологической активности. Однако из этого общего правила имеются исключения например, некоторые из испытанных растворов антител теряли свою активность прн повторном оттаивании и замораживании, несмотря на то, что температура никогда не поднималась выше 0° [4]. Липопро-теины также денатурируются при замораживании и оттаивании [2]. Наоборот, при замораживании и последующем оттаивании зимазы наблюдается увеличение ее активности, обусловленное, по всей вероятности, дезагрегацией частичек фермента в растворе [5]. С другой стороны, было найдено, что растворы яичного альбумина при старении мутнели в результате агрегации молекул альбумина, тогда как способность белка к кристаллизации при старении не изменялась [6]. [c.9]

Белки могут образовать с липидами растворимые и нерастворимые комплексы. К первому типу принадлежат липопротеины крови и других жидкостей организма животных. Плазма крови, несмотря на то, что она представляет собой прозрачную жидкость, содержит 0,5—0,7% нерастворимых липидов. Значительная часть этих липидов не может быть извлечена из плазмы обычно применяющимся для этой цели эфиром или другими неполярными растворителями. Машбёф рассматривает это как доказательство того, что указанная часть липидов находится в соединении с белками, образуя комплексы, которые он назвал синапсами [3]. Эти липопротеиновые комплексы осаждаются при обычном высаливании сернокислым аммонием [4]. Некоторое количество липидов можно обнаружить также во фракциях белков, полученных электрофоретическим путем [5]. Комплексы липопротеинов расщепляются при комнатной температуре этиловым спиртом и ацетоном, причем большая часть липидов, отцепившихся от комплекса после обработки спиртом, может быть извлечена эфиром. Для того чтобы избежать денатурации белков, рекомендуется производить расщепление комплекса липопротеинов спиртом и эфиром при низких температурах [6] или путем повторного замораживания и оттаивания этих комплексов в присутствии эфира 7]. [c.228]

Наблюдавшиеся нами на примере крахма.иа криохимиче-ские превращения присущи не только этому полисахариду. Такие или аналогичные процессы, по-видимому, протекают при замораживании и оттаивании ферментов [1,5], белков [6], животных II растительных тканей [7—10]. [c.340]

Очистка и активность ферментов. Неочищенные ферментные экстракты из тканей или из клеток получают путем размалывания на мельницах из металла или между притертыми стеклянными поверхностями, а также при действии чередующихся замораживания и оттаивания, ультразвука или же посредством процесса автолиза. Из экстрактов ферменты выделяют осаждением так, как это делают при выделении белков, путем адсорбции на ионообменных смолах, электрофорезом и экстракцией различными растворителями. Первым ферментом, полученным в кристаллической форме, была уреа- [c.332]

По вопросу о формах соединений, в которых калий находится в растительной клетке, мнения противоречивы До недавнего времени в физиологии растений господствовали взгляды, согласно которым весь калий находится в клетке только в ионной форме. Недавно с помощью радиоактивного калия удалось показать, что в листьях бука около 30% всего калия находится в связанном состоянии (А. Олсен). По-видимому, речь должна идти об адсорбции калия белками цитоплазмы, так как связь эта не разрушалась даже после замораживания листьев и последующего их оттаивания. [c.422]

В. мертвых клетках после их оттаивания или в высохших после увлажнения вследствие некоординированного воздействия ферментов происходят гидролиз инулина и расщепление белков. Клетки становятся доступными воздействию микроорганизмов и начинают гнить. Процесс разложения мгртвой ткани сопровождается выделением тепла, что ведет к интенсификации процесса и образованию очагов гниения. Мерой предупреждения загнивания корней при хранении является отделение вялых и замороженных корней от здоровых и укрытие их, что предупреждает увядание осенью и излишнее охлаждение и замораживание корней зимой. [c.32]

Левит объяснил гибель растительных клеток в процессе замораживания следующим образом. Избирательно проницаемая плазматическая мембрана (2) растительной клетки (рис. 23) располагается под жесткой, хорошо проницаемой для разных веществ клеточной оболочкой (У) и частично связана с ней. Поэтому в гипертоническом растворе, когда клетка обезвоживается, область Л плазматической мембраны, не связанная с клеточной стенкой, подвергается растяжению. Растяжение мембраны, по мнению Левита, влечет за собой появление разрывов в липидном слое, вследствие чего оказывается возможным контакт белков, расположенных по обе стороны этого слоя, и образование прочных дисульфидных связей зиежду ними. Если таковые возникают, то после оттаивания аномальные связи между белками, которые находятся во внешнем и внутреннем монослоях мембраны, сохраняются, а целостность липидного слоя не восстанавливается. Этим объясняется утрата плазматической мембраной свойства избирательной проницаемости после замораживания. Кроме того, в соответствии с указанными представлениями в процессе замораживания образуются прочные дисульфидные связи между белками мембран и прилегающими к ним белками плазмы, что ведет к необратимому повышению жесткости поверхности мембраны. Из-за этого при реаккумуляции воды клетками мембрана растягивается хуже, чем в процессе обезвоживания, что может привести к ее разрыву на этапе отогрева. В пользу выдвинутой Левитом гипотезы свидетельствует понижение содержания 5Н-групп в растениях, подвергнутых ХОЛОДОВОЙ закалке , по сравнению с незакаленными . [c.54]

Хранящиеся при 4 °С стерильные антисыворотки длительное время сохраняют свои. свойства, но тем не менее рекомендуют глубокое замораживание, минимально до —20°С. Чтобы избежать повторных оттаиваний, порции должны иметь возможно меньший объем особо ценны е контрольные антисыворотки хранят аликвотами по 100 мкл в пробирках с крыш-, ками. При длительном хранении при —20 °С вода возгоняется ц вновь замерзает в виде льда в верхней, части образца. Концентрированные белки агрегируют, образуя нерастворимый преципитат на дне пробирки. Размороженные образцы перед началом работы должны быть тщательно перемешаны и подвергнуты скоростному центрифугированию до разделения на порции. Фермент1Ы. содержащиеся в сыворотке продолжают дазрушать белки и при —20°С. Идеально хранить сыворотки при —60 °С дли ниже, однако такую роскошь можно позволить лишь в отношении самых. ценных реагентов. [c.91]

Определение активности сукцинатдегидрогеназы проводили в суспензиях митохондрий печени крысы. Суспензии митохондрий подвергали замораживанию и оттаиванию с последующим отмыванием части балластных белков гипотоническим буферным раствором (0,01 М К—Ыа-фосфатный буферный раствор, pH 7,4). В таких суспензиях активность сукцинатдегидрогеназы составляла 82,1 3,5 нмоля окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка (В. 3. Горкин, Р. С. Кривченкова, 1971). [c.46]

Зависимостью а от [Е]о характеризовались препараты НАД-киназы из скелетных мышц кролика (рис. 2). Принимая во внимание то обстоятельство, что активность определяли в растворе, в условиях, при которых нельзя исключить взаимного перехода молекулярных форм, не представляется возможным судить об удельной активности каждой из них. Тем не менее форма кривой, представленной на рис. 2 Л, позволяет констатировать, что наиболее диссоциированные и наиболее ассоциированные в данных условиях формы фермента (левая и правая ветви кривой) способны осуществлять синтез НАДФ с заметно большей скоростью,, чем промежуточные формы. Форма кривой а от [ ] упрощалась, если ферментный препарат подвергался многократному замораживанию и оттаиванию в процессе его хранения. Изменение концентрации субстрата в среде инкубации также изменяло форму кривой а от [Е]о, что могло быть обусловлено его влиянием на равновесие между олигомерными формами белка [22], [c.142]

Хранение белков в замороженном виде. Если температура достаточно низка, все деградационные процессы прекращаются, и образец можно хранить в течение неопределенно долгого времени. Рекомендуется поддерживать температуру ниже —50 °С. Обычные температуры глубокого замораживания (но не выше —15°С), как правило, подходят для хранения белковых растворов в течение одной ночи. Однако не следует замораживать разбавленный раствор белков весьма вероятно, что в разбавленных растворах (<2 мг-мл ) белки будут денатурировать при замораживании и последующем их оттаивании (кроме того, такие растворы занимают больше места в морозильнике). Перед замораживанием необходимо измерить pH и убедиться, что раствор хорошо забуферен. Замораживать растворы следует в пластиковых контейнерах (стеклянные контейнеры трескаются, когда при образовании льда объем раствора увеличивается). Оттаивание замороженных растворов нужно производить быстро, погружая контейнеры в теплую воду. При проведении крупномасштабных работ для этой цели можно применять, соблюдая осторожность, микроволновую печь. Необходимо помнить, что пластики являются плохими проводниками тепла, и даже если снаружи температура воды составляет 50 °С, внутренняя поверхность контейнера будет иметь температуру не выше 30 °С если же раствор во время оттаивания перемешивать, мало вероятно, что произойдет тепловая денатурация. [c.269]

Результаты исследований [60] показали, что структурные изменения воды, полученной при высокотермической дистилляции, способствуют усилению анафилактических реакций у животных, сенсибилизированных перорально чужеродным белком. Замораживание и последующее оттаивание дистиллята уменьшало интенсивность развития аллергической реакции в ответ на введение разрешающей дозы антигена, тогда как коррекция дистиллята разведенной морской, либо артезианской водой не приводила к уменьшению тяжести анафилактического шока, Основьшаясь на концепции, что в основе биологического действия талой воды лежит наличие в ней стабилизированных додекаэдрических комплексов, которые, попадая в организм, оказывают структурирующее влияние на воду, являясь как бы центрами кристаллизации, авторы данной работы считают, что отмеченное отрицательное влияние связано с бесструктурностью дистиллята и отсутствием в нем стабилизованных центров кристаллизации. [c.211]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология