Ферменты кинетические параметры

Рис. 104. Определение кинетических параметров ферментативной реакции при быстрой инактивации фермент-субстратного комплекса (на примере гидролиза нитрокатехолсульфата, катализируемого арилсульфатазой А) [26 1

Рис. 87. Определение кинетических параметров гидролиза /г- ни-троанилида К-ацетил-1-тирозина, катализируемого а-химотрипсином в условиях избытка фермента [42]

В таблице 13 приведена зависимость начальной скорости гидролиза и-нитроанилида Ы-ацетил-Ь-тирозина, катализируемого а-химотрипсином, от концентрации фермента [16]. Определить значения кинетических параметров ферментативной реакции, если концентрация субстрата во всех случаях равна 1 10 М. [c.123]

Полная обработка данной схемы приводит к довольно сложным выражениям для кинетических параметров кат и /Ст(каж) ферментативной реакции. Однако на практике рН-зависимость ферментативных реакций, протекающих по трехстадийному механизму, имеет более простой вид. Как правило, ряд протонированных или депротонированных состояний фермента или не обладают способностью связывать субстрат, или не вступают в реакции ацилирования или деацилирования, что приводит к упрощениям соответствующих схем рН-зависимости. Например, в реакциях гидролиза специфических субстратов, катализируемых а-химотрипсином и трипсином, схема (10.11) упрощается [c.222]

Б. Транспортные белки можно охарактеризовать, подобно ферментам, кинетическими параметрами (концентрация субстрата, при которой скорость транспорта равняется половине максимальной величины) и (скорость транспорта, достигаемая при насыщении субстратом). Изменяются ли при стимуляции инсулином эти кинетические характеристики переносчика глюкозы Что можно сказать на этот счет, исходя из представленных здесь данных [c.60]

Со(1И)-триеновые системы удобны тем, что обмен и замещение воды в координационной сфере иона металла — всегда очень медленный процесс от минут до часов), т. е. кинетические параметры можно легко оценить. Медленный обмен лигандов в водном растворе позволяет использовать изотопную метку для прослеживания реакционного пути координированной молекулы воды или гидроксогруппы и, таким образом, дает возможность различить прямой нуклеофильный и общий основной механизмы гидролиза. Однако помимо указанных преимуществ у этих систем имеются и очевидные недостатки, если рассматривать соответствие их (или отсутствие такового) ферментативным процессам. Например, Со(1П)-триеновые комплексы, инициирующие реакции, находятся в сте-хиометрическом, а не каталитическом соотношении с продуктом гидролиза или гидратации, который остается прочно связанным с находящимся в комплексе металлом. По этой причине комплексы Со(П1) не столь пригодны, как могли бы быть, для моделирования ферментов. Тем не менее из-за благоприятного понижения (ДЯ" практически не меняется) при комплексообразовании с подходящими лигандами наблюдалось увеличение скорости в 10 раз. Несмотря ни на что, обсуждаемая здесь система все же неплохая модель, что обусловлено способностью металлов поляризовать прилегающие молекулы субстрата и активировать координированные нуклеофильные группы. [c.356]

Наиболее полную информацию о кинетике ферментативных реакций дает изучение их протекания в нестационарном режиме (см. гл. V). Исследование стационарной кинетики ферментативных процессов имеет ограниченное значение для понимания многостадийного механизма действия ферментов. Это связано прежде всего с тем,что в общем случае невозможно однозначно приписать экспериментально определяемые значения констант скоростей индивидуальным химическим стадиям (см. 1 гл. V и VI). Тем не менее кинетические параметры типа = = У/(Е](,и Кт.каж, которые, следуют из основного уравнения стационарной кинетики — из уравнения Михаэлиса (6.8), как показал Альберти с сотр. [1], позволяют оценить нижний предел константы скорости любой индивидуальной стадии ферментативной реакции [типа (6.9) или даже более сложного обратимого процесса (5.16)]. [c.268]

Для вывода уравнения скорости, связывающего значения кинетических параметров ферментативной реакции (7.17), протекающей в стационарном режиме (при [S]o [E]o), с концентрацией добавленного. ингибитора (ионов Си++) запишем уравнение материального баланса по ферменту [c.156]

Поставленные задачи решаются на основе современных методов исследования ферментов. Практическая направленность занятий связана с освоением различных методов регистрации скоростей ферментативных реакций, включающих использование сопряженных ферментных систем и метода радиоактивного анализа. С целью определения активности мембранных ферментов осваиваются техника получения различных субклеточных структур и приемы работы с различными типами детергентов. Проблемы структурного анализа ферментов решаются с привлечением методов избирательной химической модификации белков, флуоресцентных методов, а также методов ковалентной и адсорбционной иммобилизации на различных носителях, включая искусственные фосфолипидные мембраны (липосомы). Кроме того, осуществляется практическое знакомство с различными аспектами кинетического исследования ферментов осваиваются различные способы оценки кинетических параметров, ингибиторный анализ, проводится исслс- [c.329]

Рассмотрение первых двух процессов входит в круг вопросов, решаемых не физической химией, а гидродинамикой. Мы проанализируем здесь третью проблему, а именно влияние диффузии субстрата в гранулу иммобилизованного фермента на кинетические параметры ферментативной реакции. [c.268]

Рассмотрим следующую модель. Имеется плоская мембрана, толщина которой равна I и площадь поверхности А, содержащая иммобилизованный фермент с концентрацией в мембране [Е]о. Мембрана погружена в раствор субстрата, концентрация которого равна [S]o. Коэффициент распределения субстрата между раствором и мембраной равен Р. Требуется найти зависимость между скоростью появления продукта в растворе и кинетическими параметрами ( кат И /Ст(каж)) ферментативной реакции. Подробный анализ этой модели приводится в работах [4, 5]. Если скорость ферментативной реакции мала по сравнению со скоростью диффузии и концентрация фермента мала по сравнению с концентрацией субстрата, начальная скорость ферментативной реакции на единицу объема мембраны будет равна [c.268]

Пример 8. В работе [14] исследуется влияние множественной атаки на величины кинетических параметров ферментативного гидролиза гомополимеров в зависимости от степени полимеризации последних. Данные, приведенные в табл. 28 (отражающие зависимость кинетических параметров ферментативного гидролиза от степени полимеризации субстрата, и в целом подчиняющиеся известному правилу лучшее связывание — лучший катализ [15]), послужили для авторов работы [14] основанием для разработки весьма детализированной кинетической модели множественной атаки. Эта модель включает более десяти микроскопических параметров (число сайтов активного центра положение каталитического участка в активном центре число возможных способов ассоциации субстрата с ферментом число связей субстрата, расщеп- [c.87]

Ясно, что здесь нужен количественный анализ происхождения продуктов, приведенных в табл. 29 могли ли они образоваться в результате вторичной атаки а-амилазы на более длинные фрагменты субстрата (для этого необходимы величины кинетических параметров действия фермента на олигосахариды с различной степенью полимеризации,см.табл. [c.89]

Некоторые кинетические параметры имеют ясный физический смысл. Параметр Vf—это скорость, достигаемая при условии, когда концентрация субстрата А и концентрация субстрата В бесконечно высоки. Каждая константа Км соответствует константе Михаэлиса для простой системы, в которой концентрация второго субстрата достаточно высока, чтобы насытить фермент. [c.21]

Главное содержание кинетических подходов к описанию процессов ферментативной деструкции полимеров, разработанных к настоящему времеии, состоит в том, чтобы связать макроскопические кинетические параметры, определенные из эксперимента, с микроскопическими, характеризующими взаимодействие субстрата и его фрагментов с активным центром фермента и его сайтами. [c.105]

Схема (157) так подробно разбирается по нескольким причинам. Во-первых, рассмотрением именно этой схемы или ее модификаций (еще более усложненных) в настоящее время ограничивается кинетический анализ реакций лизоцима (см. [131 —133]). Во-вторых, что более важно, стремительно возросшие в последнее время возможности машинной обработки данных приводят в ряде случаев к тому, что авторы стремятся включить в исходную кинетическую схему все мыслимые варианты взаимодействия фермента с субстратом и его фрагментами, образующимися в ходе реакции, а также с продуктами трансгликозилирования вплоть до высоких степеней полимеризации (см. [133]), а также множество равновесных и кинетических параметров реакции. При этом зачастую упускается из виду, что анализ экспериментальных кинетических кривых может дать сравнительно немного кинетических параметров. В итоге результаты эксперимента, с одной стороны, и теоретического анализа соответствующих усложненных схем, с другой, оказываются несопоставимыми. [c.185]

Таким образом, количество сопрягающего фермента можно подобрать экспериментально. Его можно также рассчитать, зная кинетические параметры системы. Она должна находиться в стационарном состоянии, когда скорость реакции, катализируемая индикаторным ферментом, равна скорости реакции, осуществляемой тем ферментом, активность которого исследуется. Расчеты, проведенные для ситуации, при которой через 1 мин после запуска реакции достигается 98% истинной скорости, показывают, что количество сопрягающего фермента может быть определено из соотношения [c.209]

Кинетические параметры гидролиза бензилпенициллина до 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) под действием иммобилизованной пенициллинамидазы при 40° С равны йкат=15 сек- , Ят(каж)=3,1 10- м. Константа инактивации пенициллинамидазы в условиях проведения реакции равна 10 сек , причем связывание с ферментом субстрата или продуктов реакции не влияет на скорость инактивации фермента. Рассчитать, какое количество 6-АПК (мол. вес 217) можно получить с помощью иммобилизованной пенициллинамидазы в периодически действующем реакторе объемом 100 л (начальная концентрация активного фермента равна 3-10 М, начальная концентрация субстрата равна 1,0 М), если степень конверсии субстрата в каждом реакционном цикле должна составлять 99%. В расчетах учесть, что константа конкурентного ингибирования пенициллинамидазы вторым продуктом реакции, фенилуксусной кислотой, равна 2,8-10 М. [c.176]

Кинетические параметры (измеренные по ферментативной активности) при варьировании концентрации глюкозо-1,6-дифосфата и глю-козо-1-фосфата зависят от соотношения концентраций этих компонентов. Величина Кт для глюкозо-1-фосфата изменяется от 2,4-10 М до 4,8-10 М. для глюкозо-1,6-дифосфата — от 8,3-10 М. до 7,6-10 М. Кинетические параметры зависят также от того, находится ли фермент в активированном или неактивированном состоянии. Активацию фосфоглюкомутазы проводят путем предварительной инкубации в среде, содержащей ионы Mg + и имидазол (или гистидин). [c.227]

Соответственно из кинетических данных получают в этом случае на один кинетический параметр меньше, чем для реакций с упорядоченным присоединением субстратов. Кинетическая схема (6-37) для ферментативной реакции, протекающей по механизму типа пинг-понг, содержит 12 кинетических констант. Это соответствует минимальному числу стадий, которые необходимо рассмотреть, чтобы описать кинетические свойства фермента, функционирующего согласно механизму типа пинг-понг. Ясно, что из данных стационарной кинетики можно определить только часть этих констант для оценки всех их необходимо использовать другие подходы. [c.22]

Другой часто используемой для характеристики ферментов кинетический параметр - это их коистаита Михаэлиса К определяемая как концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной (рис. 3-54). Низкое значение свидетельствует о том, что фермент достигает максимальной скорости катализа при низкой концентрации субстрата и обычно соответствует очень прочному связыванию субстрата ферментом. [c.159]

Из рассмотрения выражения (6.144) видно, что в том случае, когда продукт реакции имеет большее сродство к ферменту по сравнению с исходным субстратом Кр Кпцк ж)), эс )фективные кинетические параметры — максимальная скорость и константа Михаэлиса ферментативной реакции — имеют отрицательные значения [c.252]

При изучении кинетики гидролиза п-нитроанилида Ь-ала-нина, катализируемого аминоцептидазой М в стационарном режиме протекания реакции было найдено, что зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата имеет вид 5-образной кривой при малых концентрациях п-нитро-анилида [19]. Предполагая, что фермент в условиях реакции претерпевает обратимую изомеризацию с образованием неактивного конформера (Е, схема 6.27), и исходя из данных табл. 16, определить значения кинетических параметров ферментативной реакции и константу равновесной обратимой изомеризации фермента [c.124]

Рис. 62. Определение кинетических параметров гидролиза п-нитроанилида М-ацетил-Ь-тирозина, катализируемого а-химотрипси-ном при избытке фермента

Нахождение значений рК ионогенных групп фермента (или субстрата), контролирующих скорость реакции, по профилям зависимости кинетических параметров ферментативной реакции от pH производится по тем же правилам, что и при обработке рН-зави-еимостей неферментативных реакций (см. гл. 3), Например, логарифмируя левую и правую части выражения (10.14), получим [c.225]

В таблице 3 приведена рН-зависимость кинетических параметров гидролиза л-нитрофенилацетата, катализируемого бактериальной протеазой ЕзоШ [3]. Определить значение рК ионогенной группы активного центра свободной формы фермента. [c.227]

Профиль рН-зависимости кинетических параметров гидролиза М-ацетил-Ь-фенилаланил-Ь-триптофана, катализируемого пепсином, имеет колоколообразную форму, причем левая ветвь рН-зависимости обусловлена протонированием карбоксильной группы активного центра фермента, а правая —депротонированием карбоксильной группы субстрата [12]. На основании данных табл. 21 [c.236]

Зависнмость кинетических параметров обратимого конформационного перехода молекулы а-химотрипсина в растворе. Условия опыта pH 9,8 ионная сила 0,2М (КаС1) конц. фермента 2 10- М [c.255]

Известно, что кинетику ферментативных реакций можно изучать с помощью регистрации либо начальных участков кинетической кривой, либо достаточно протяженных ее участков (практически до полного завершения реакции) [21]. В первом случае изучение преврапгений полимеров не отличается принципиально от изучения реакций любых других (простых) субстратов, поскольку в начальный период реакции ферментативной атаке могут подвергаться различные по реакционной способности участки полимера в зависимости от их относительного содержания и относительного сродства фермента к ним. Поэтому соответствующие эффективные кинетические параметры ферментативной реакции (константы Михаэлиса, каталитические константы) являются некоторыми средними величинами и не могут быть использованы для описания и теоретического предсказания временного хода ферментативного процесса на достаточно больших глубинах превращения полимеррюго субстрата. [c.29]

Ясно, что эти данные могут быть интерпретированы более простым образом, а именно что способ действия фосфорилазы (априорно принятый в цитируемой работе [16] как канонический для неупорядоченного действия фермента) несколько отличается от способа действия р-амилазы, что приводит к различному распределению продуктов деструкции полимерного субстрата по молекулярным массам (степени полимеризации). Как неоднократно указывалос . выше, это наиболее характерный признак действия деполимераз, и в рамках кинетики и субстратной специфичности действия ферментов он обусловлен различной зависимостью кинетических параметров ферментативной реакции от степени полимеризации (длины цепи) олигосахаридов. С точки зрения термодинамики действия деполимераз этот характерный признак объясняется различным числом сайтов в активном центре фермента, различным их сродством к мономерным остаткам субстрата и положением каталитического участка в активном центре. Как видно, и в этом случае введение гипотезы о множественной атаке было излишним и преждевременным, так как экспериментальные данные, полученные авторами работы [16], не были подвергнуты тщательному анализу. [c.91]

Сравнивается действие двух или нескольких ферментов на один поли- или олигомерный субстрат и выявляется состав образующихся продуктов (различное распределение моно- или олигомерных продуктов по степени их полимеризации и по относительной концентрации). При этом состав продуктов действия одного из ферментов более характерен для неупорядоченного (многоцепочечного) способа действия по сравнению с действием других ферментов. Этого, как правило, для авторов достаточно, чтобы заключить о частичном проявления одноцепочечного механизма действия в последнем случае и, базируясь на выбранной ими модели, рассчитать степень множественной атаки. Кроме того, практически ни в одной из приведенных нами работ не вводились количественные поправки на возможную повторную атаку ( вторичный гидролиз образующихся продуктов реакции), исходя из кинетических параметров ферментативного гидролиза олигомеров с различной степенью полимеризации. Иначе говоря, авторы, априори принимая только механизм множественной атаки, не делают контрольных расчетов по альтернативным механизмам ферментативного гидролиза полимеров. [c.102]

Здесь, как правило, упускается из виду то фундаментальное положение для действия деполимераз, что состав продуктов действия ферментов на поли- или олигосахариды может сильно варьироваться (даже и без проскальзывания субстрата вдоль активного центра) и отражает в первую очередь значения кинетических параметров Кт, Ут или их отношение) действия фермента на индивидуальные олигосахариды (как исходные, так и образующиеся в процессе деструкции субстрата). Другая (также приемлемая, хотя и более формализованная) точка зрения базируется на том, что распределение продуктов реакции однозначно задается количеством сайтов в активном центре фермента, показателями их сродства к мономерным остаткам субстрата и положением каталитического участка, а также значениями гидролитического коэффициента при различной степени заполнения активного центра и различной степени полимеризации исходного субстрата. На наш взгляд, набор этих параметров обеспечивает столь гибкие возможности для объяснения практически любых распределений продуктов (промежуточных и конечных) в реакционной системе, что не нуждается в введении дополнительных концепций, к тому же с неясным физическим смыслом. [c.102]

Если ферментативному гидролизу подвергается смесь гомополимеров со средней стеиепью ио.1имс )нзации х (как это обычно и бывает на практике при работе с полимерами, имеющими степень полимеризации более 10), то важно найти, как это влияет на экспериментальные величины кинетических параметров Кт и Ут по сравнению с гидролизом гомополимера с определенной степенью полимеризации х. При взаимодействии фермента со смесью гомополимеров концентрация каждого фермент-субстрат-ного комплекса дается следующим выражением [5] [c.113]

Отсюда следует важный вывод, что в стационарном режиме Лерментативного гидролиза целлюлозы в условиях превращения исходного субстрата на небольшую глубину скорость образования конечного продукта реакции (глюкозы) определяется только кинетическими параметрами действия первого фермента в полиферментной системе (подобная же закономерность была получена ранее для частного случая линейных полиферментных цепей [12]). Иначе говоря, в этих условиях стадия, лимитирующая скорость гидролиза, — превращение исходного субстрата. [c.128]

Изучение рН-зависимости кинетических параметров гидролиза бактериальных клеток под действием лизоцима проведено в работе [64], и осрювные результаты показаны в табл. 40 и ма рис. 21. Влияние pH на кинетику бактериолитического действия лизоцима описывается схемой, где константы диссоциации двух иоиогениых групп активного центра фермента определяются значениями рКа = о,0-, рКь = 9,2. [c.198]

Определение кинетических параметров Кт и V) для ферментов с 5-образной кинетикой затруднено, так как кривые не линеаризуются в двойных обратных координатах. В случае положительной коопера-тивности кривые загибаются кверху, а при отрицательной — книзу. Экстраполяция прямого участка кривой до пересечения с осью абсцисс позволяет определить концентрацию субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной. Эту величину принято обозначать 5о,б. Для описания зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в случае аллостерических ферментов применяют преобразованное уравнение Хилла [c.215]

Для многих ферментов модель Моно и др. оказывается слишком упрощенной, и для анализа равновесного связывания необходимо применять более общий подход (гл. 4). Следует, однако, иметь в виду, что наряду с /(-системами существуют У-системы, в которых аллостернче-ский эффектор вызывает изменение максимальной скорости [см. схему (6-47)], а иногда и обоих кинетических параметров одновременно (максимальной скорости и сродства к субстрату). [c.38]

Примером фермента, детально изученного с точки зрения влияния-pH на кинетические параметры, может служить фумараза — фермент, катализирующий обратимую гидратацию фумаровой кислоты до яблочной [схема (6-64)]. В своей ранней очень интересной работе Алберт и др. [58] показали, что колоколообразная рН-зависимость имеет место как для прямой, так и для обратной реакции. Используя уравнения (6-88) и (6-89), эти исследователи рассчитали кажущиеся значения р/Са для групп а и Ь фермента в буферных растворах с ионной силой 0,01 (табл. 6-1). Важно отдавать себе отчет в том, что кинетика этой обратимой реакции описывается более сложными уравнениями, чем уравнения (6-87)—(6-89), и поэтому кажущиеся значения р/Са могут не совпадать с истинными. Однако очень заманчиво было бы допустить, что два значения р/Са для свободного фермента, равные 6,2 и 6,8, соответствуют идентичным группам, по-видимому, имидазольным, со значениями микроскопических р/Са. составляющими 6,5. Свойства фумаразы будут обсуждаться далее в гл. 7, разд. 3,6. [c.60]

Наличие одинаковых доменов (амипокислотпых последовательностей) в молекулах рецепторов и соответствующих им лимитирующих ферментах позволяет использовать лимитирующие ферменты в качестве тест - объектов для поиска БАВ, мишепями которых служат соответствующие рецепторы. При этом использование кинетических параметров ферментативных реакций для оценки действия изучаемых веществ механизма позволяет получить более полную информацию, чем использование рецепторов в качестве тест-объектов. [c.4]

ТЫ Р уравнений, описывающих данные по константам Михаэлиса и ингибирования, близки к средним температурам опытов Тср. Такое же соотношение выполняется и для данных, полученных на одном и том же ферменте в разных температурных областях. Для кинетических параметров, соответствующих разным субстратам, активаторам или ингибиторам, как правило, р Тср- Примеры компенсационных эффектов (КЭФ) для процессов координации лигандов гемоглобином, окисления спиртов кагалазой и гидроксилирования субстратов цитохромом Р-450 приведены на рис. 20.1. Приближенная корреляция параметров и Д5°, и Д5 наблюдалась и для реакции электронного переноса с участием металлопереносчиков. [c.554]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология