Аффинные оптимальная

При синтезе аффинного сорбента (если считать, что все его ком-поненты выбраны обоснованно) перед экспериментатором встают практические вопросы количественных соотношений, и в первую очередь задача выбора оптимальной концентрации (плотности пространственного расположения) лиганда на матрице. Для этого в описанных выше процедурах посадки лиганда он может варьировать соотношения количеств лиганда и матрицы, а также условия реакции, в частности ее продолжительность. Хотя подбор оптимальной концентрации лиганда в конце концов ведется эмпирически, имеет смысл провести некоторое общее рассмотрение этого вопроса, с тем чтобы прояснить хотя бы порядки величин, с которых следует начинать такой подбор в каждом конкретном случае. [c.400]

Концентрация лиганда может быть использована для тонкого регулирования связывания макромолекулы с аффинной колонкой. Концентрация лиганда, выбранная на основании отдельного эксперимента, вероятнее всего, не будет оптимальной для достижения наилучшего разделения. Это особенно относится к адсорбентам, содержащим фенилборную кислоту. В этих случаях должны быть поставлены несколько экспериментов с различными концентрациями лиганда для окончательного решения вопроса об условиях разделения. [c.104]

ЛИТЬ оптимальную для данного подвижного компонента концентрацию лиганда. По другому способу носитель вводят в реакцию с большим количеством лиганда и затем разбавляют немодифицированной матрицей до достижения требуемой концентрации иммобилизованного лиганда. Последний метод менее желателен в случае, если высокая плотность лиганда концентрированной аффинной матрицы вызывает удерживание подвижного компонента благодаря поливалентному связыванию или стерическим трудностям. [c.226]

Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых разных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение таких методов часто позволяет получить наибольшую степень очистки белков, что в случае фе рментов означает максимально возможное повышение их удельной активности. Хотя колоночная хроматография служит идеальным способом оптимального разделения белков, не следует забывать и о методах адсорбции в объеме , так как это очень быстрые и потому весьма полезные методы, когда время имеет первостепенное значение (см. также гл. 7). Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники, фосфат кальция (в виде геля или в кристаллической форме) и разнообразные аффинные адсорбенты, созданные для ферментов определенных типов. Все эти вопросы вслед за общим введением в теорию адсорбционной хроматографии обсуждаются в данной главе применительно к выделению белков. [c.91]

Колонка для аффинной хроматографии заполняется связанной с лигандом матрицей и уравновешивается тем же буферным раствором, который используется для растворения исследуемого соединения. Буферный раствор должен иметь такие pH и ионную силу, чтобы обеспечивать оптимальные условия для сшивания лиганда с [c.103]

В этой работе интересно отметить подбор оптимального соотношения количества аффинного сорбента и белкового раствора. Недостаток сорбента, естественно, ведет к неполной экстракции рецептора, а избыток затрудняет конкурентную элюцию свободным гормоном и требует использования повышенной концентрации дорогостоящего препарата. Подбор вели титрованием к определенному количеству экстракта добавляли порциями сорбент, комплекс его с рецептором удаляли центрифугированием и следили за убылью рецептора в супернатанте по связыванию им радиоактивного гормона (детектирование на тех же фпльтрах). В результате такого подбора элюцию удавалось осуществлять меченым гормоном в указанной выше, очень малой концентрации. График элюции показан на рис. 147. [c.433]

Методы разделения, основанные на использовании специфичного сродства биополимера к определенному партнеру, получили название аффинных методов разделения (от англ. affinity — сродство). Наиболее широко используемый вариант аффинных методов — это использование аффинных сорбентов. Специфические лиганды ковалентно присоединяются к соответствующему носителю, и выделяемое вещество либо адсорбируется таким сорбентом, либо отделяется от остальных компонентов с помощью аффинной хроматографии с использованием того же аффинного сорбента. Разнообразие мыслимых аффинных сорбентов неисчислимо, и практически невозможно приготовить все сорбенты в коммерчески доступном виде. Оптимальным для большинства задач является наличие носителя с реакционноспособными группами, который по усмотрению исследователя может быть использован для присоединения соответствующего лиганда, подходящего для решения поставленной задачи по разделению. Количество подобных реакционноспособных носителей весьма велико. Наиболее популярной является бромци-ансефароза, представляющая собой сефарозу, обработанную ВгС , который реагирует с гидроксигруппой сефарозы, превращая ее в остаток цианата [c.246]

С повышением темпердтуры падает вязкость подвижной фазы, а следовательно, и гидродинамическое сопротивление столбика сорбента соответственно сокращается время достижения равновесия. Теоретически верхним пределом температуры в колонке служит та величина, при которой наступает тепловая денатурация белков. На практике приходится работать при более низкой температуре, в особенности при наличии в исследуемой смеси протеаз и других гидролаз. В ряде случаев, в частности при обработке тканевых экстрактов, рекомендуется работать при температуре близкой или ниже О °С и в буфере, содержащем несколько процентов изопропанола. В этом нет необходимости, если рн среды не совпадает с оптимальной областью действия гидролаз, или в среде присутствуют ингибиторы протеаз, или выделение ведут в присутствие денатурирующих агентов, таких, как солянокислый гуанидин или мочевина, наконец, когда исследуемый белок отделяют с помощью специфического сорбента (например, при аффинной хроматографии) [1]. [c.422]

МНг-сфероне проводилась в оптимальных условиях, взятых из данных, приведенных на рис. 3.1. Для элюирования использовались растворы антилпзина в различных концентрациях. Концентрация иммобилизованного аффинного лиганда [L], определенная исходя из эффективной емкости колонки, составила 2,6-10 моль/л. Свободный объем V-m, найденный с помощью декстрана 2000, равен 2,1 мл. Константа диссоциации комплекса химотрипсина с [c.50]

Теоретически выведенная взаимосвязь между количеством сорбируемого фермента, концентрацией аффинного лиганда и константами равновесия лиганд — фермент рассмотрена в гл. 3. Из рис. 3.3 следует, что для систем с низким сродством Кь = = 10 2 моль/л) концентрация привязанного аффинного лиганда представляет собой критический параметр для получения эффективного сорбента. На рис. 5.6 показана аффинная хроматография глюкокиназы на 2-амино-2-дезокси-о-глюкопиранозо-N-(6-амино-гексаноил) —сефарозе при четырех концентрациях связанного аффинанта [15]. Видно, что оптимальная концентрация аффинного лиганда равна 3,75 мкмоль/г (рис. 5.6,6) при более низких концентрациях фермент не отделяется от неактивного материала, в то время как при более высоких концентрациях необходимо увеличить концентрацию глюкозы в элюате и при этом глюкокиназа выходит в большем объеме элюата. При концентрации 10 мкмоль/г глюкокиназа не может быть элюирована даже при высоких концентрациях глюкозы она может быть снята только пропусканием 0,5 М хлорида калия. [c.75]

Требуемое количество геля замачивают для набухания в 10 М соляной кислоте 10 М соляную кислоту используют также для промывки геля в течение 15 мин. 1 г лиофильно высушенного геля набухает до объема 3,5 мл. Гель рекомендуется промывать в несколько приемов, используя на 1 г сухого геля 200 мл раствора. Сразу же после промывки добавляют раствор аффинного лиганда, который необходимо привязать к сефарозе. Оптимальные условия для связывания аффинного лнганда (pH, состав буфера и температура) зависят до определенной степени от характера лиганда. Как правило, реакция связывания наиболее эффективна при pH 8—10, но можно использовать и более низкие значения pH, если этого требует природа связываемого лигапда. Аффинный лиганд присоединяется в достаточных количествах даже и при этих pH, если увеличить количество бро.мциана при активации и количество лиганда при связывании. Аффинный ли1анд, в особенности белкового характера, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5) для предотвращения неспецифической адсорбции. Высокая ионная сила облегчает затем последующую промывку.. Можно использовать карбонатный и боратный буферы с добавка.ми хлорида натрия. [c.190]

Изучение оптимальных условий сорбции предполагает, что аффинный лиганд присоединен к нерастворимому носителю с достаточно высокой пористостью и на достаточном расстоянии от его поверхности (разд. 5.1), чтобы сохранить даже после присоединения высокое сродство к выделяемому веществу (разд. 5.2). Емкость специфического сорбента определяется концентрацией доступных аффинных лигандов и их константами диссоциации пз комплекса с выделяемым веществом (рис. 3.3). В разд. 5.3 ул<е обсуждалась оптимальная концентрация им.мобнлизованного аффинного лиганда, которая должна была бы обеспечить достаточную емкость и одновременно позволить освобождаться выделяемому веществу из специфического комплекса с иммобилизованным аффинантом в достаточно мягких условиях, не приводя, однако, к неспецифической сорбции. Свойства пространственной группы, вводимой между аффинным лигандом и поверхностью нераство-рихмой матрицы [6], могут оказывать влияние на свойства сорбента, как и концентрация аффинного лиганда. Специфический сорбент должен быть приготовлен таким способом, чтобы все группы, способные к присоединению, были блокированы (разд. 8.4) и чтобы число групп, способных принимать участие в неспецифической сорбции, было минимальным (разд. 10.3). Однако особенно важно, чтобы все молекулы аффинного лиганда, которые не присоединились к носителю ковалентной связью, были тщательно отмыты (разд. 8.6). [c.258]

Оптимальные условия связывания, pH, состав буферного раствора и температура, в значительной степени зависят от характера аффинного лиганда. Наиболее эффективно реакция проходит при pH 8—10, однако, если этого требует природа аффинного лиганда, можно использовать и более низкие значения pH. Аффинный лиганд, особенно белковой природы, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5), чтобы предотвратить неспецифическую сорбцию, например белка на белке, которая обусловлена полиэлектролитной природой белков. Для последующей отмывки сорбента используются растворы с более высокой ионной силой. Можно применять карбонатные или бо- ратные буферы с добавкой хлорида натрия. Количество присоединенного лиганда зависит от соотношения в реакционной смеси аффинного лиганда и объема геля, pH, природы самого лиганда (числа реакционноспособных групп и т. д.), а также от длительности проведения реакции и температуры. Например, при иммобилизации химотрипсина к 2 мл NBr-акти Вированной сефарозы при pH 8 присоединяется только 5 мг из 10 мг взятого белка, из 20 мг белка связывается примерно 8 мг, а из 30 мг — примерно 10 мг. При комнатной температуре (20— 25 °С) связывание обычно завершается за 2 ч, при пониженной температуре рекомендуется увеличить длительность реакции до 16 ч, т. е. оставлять реакционную смесь на ночь. В процессе связывания реакционную массу необходимо перемешивать, но применять магнитную мешалку не рекомендуется, так как при таком перемешивании можно разрушить гель. Лучше всего перемешивать реакционную смесь встряхиванием. Когда реакция закончится, гель переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают тем же буферным раствором, в котором проводилось связывание. Оставшиеся активные группы рекомендуется блокировать, с этой целью гель обрабатывают 2 ч 1М этанола-мином при pH 8. Конечный продукт следует промыть 4—5 раз буферным раствором с высоким или низким pH. Например, можно использовать ацетатный (0,1 М, pH 4) или боратный буферный (0,1 М, pH 8,5) раствор, содержащий 1 моль/л хлорида натрия. Как уже упоминалось во введении, все нековалентно связанные соединения следует отмыть. [c.20]

Разворот, скольжение по плоскости и размехцение под оптимальным углом к направлению действия растягивающего усилия ранее образовавшихся кристаллитов и их более простых структурных элементов. Этот процесс отвечает в основном условиям аффинного преобразования и за-верн1аегся до достижения кратности вытял<ки порядка 1,7—2,0. [c.219]

Т-клеточные рецепторы (ТКР) разной степени аффинности по отношению к молекулам МНС. У.меренная степень сродства ТКР к молекулам МНС (1) определяет начало дифференцировки соответствующего клона, который по завершению процесса созревания мигрирует на периферию (пример положительной селекции). Очень высокая и очень низкая степень аффинности ТКР или полное отсутствие такой аффинности определяют гибель клеток через процесс апоптоза (2, 3). Клетки с ТКР, имеющим оптимальную аффинность по отношению к молекулам МНС, но при этом способным к распознаванию аутоантигена, комплексированного с молекулами I или И классов, также подвергаются апоптозу (пример отрицательной селекции) [c.181]

Оптимальными /шгандами для аффинной хроматографии ферментов являются соответствующие субстраты, однако в общем случае их применению мешает быстрое превращение в продукты ферментативной реакции и как следствие снижение эффективности и деструкция сорбентов. Тем не менее субстраты могут быть использованы в качестве лигандов, если при определенных условиях скорость каталической реакции понижена, а связывание с ферментом остается достаточно сильным. Такие условия могут быть созданы путем понижения температуры (от —2 до —50 °С), когда прочность фермент-субстратного комплекса достаточна для удерживания фермента на колонке, в то время как его десорбция легко достигается при повышении температу-ры [5]. [c.189]

При работе по описанным выше методикам должно соблЮ даться соотношение аффинного адсорбента к наносимому белку например, для белковых экстрактов, полученных из 20 г прО ростков кукурузы, надо брать оптимально 14 г гепарин-сефарозы. При использовании меньших количеств белка фермент элюируется в слишком разбавленном виде, а при нанесении большего количества белкового экстракта увеличивается продолжительность стадий разделения и имеет место частичная инактивация фермента. При работе в рекомендованных условиях последую-ш,ее концентрирование фермента не обязательно. Получаемый при этом раствор фермента устойчив и может храниться не-сколько недель (при —70 °С) без потери активности в этом виде раствор фермента непосредственно можно вводить в следующий этап очистки. [c.170]

Лизис нагруженных белком А эритроцитов можно использовать при анализе у Xenopus клеток, образующих иммуноглобулины, по описанным в литературе методикам. Для такого анализа, так же как и для обратного локального гемолиза, необходимо определение оптимальных разведений (титрованием) кроличьих антител против иммуноглобулинов Xenopus. Например, нашу антисыворотку для использования в тесте с нагруженными белком А эритроцитами нужно разводить 1 80, а для обратного гемолиза 1 256. Вероятно, антисыворотка обеспечивает более прочное связывание антител низкой аффинности с клетками-мишенями. Ни одни из известных моноклональных антител против IgY не дают присущего кроличьим антисывороткам усиливающего эффекта. [c.503]

Условия инкубации. В наших работах не наблюдалось -максимального связывания мономерных и димерных антител с значениями собственных констант Д а>10 л/моль в ходе 1-часовой инкубации при комнатной температуре (Koertge, 1984). Димерные антитела достигают наибольшей степени связывания несколько быстре, чем мономерные, причем и те, и другие максимально связываются при 24-часовой инкубации. По данным других исследователей (Butler, неопубликованные данные) максимальное связывание свиных антител к флуоресцеину практически достигалось за 5,5 ч при 37 °С. Перемешивание реакционных смесей в лунках панелей с помощью специального встряхивателя не повышает скорости связывания, но, судя по всему, обеспечивает более однородные условия протекания реакций в плате. Приведенные наблюдения свидетельствуют о том, что время инкубации, необходимое для максимального связывания первичных антител, зависит от природы самих антител, т. е. от их аффинности, валентности и т. д. Оптимальное время инкубации следует определять эмпирически для каждой конкретной системы анализа. [c.224]

Представляет интерес сенсор [40], основанный на принципе конкуренции глюкозы и меченного флуоресцеином полидекстрана за связывание с белком конканавалином А, иммобилизованным на внутренней поверхности полой диализной трубки (гл. 32). Конструкция этого аффинного сенсора включает оптическое волокно, вставленное в диализную трубку, что позволяет непосредственно определять несвязанный меченый декстран. Преимуществом данного сенсора по сравнению с глюкозооксидазными сенсорами является то, что его сигнал определяется конкурентным равновесием между глюкозой и формирующим сигнал лигандом. Поэтому кинетика ферментативных реакций и загрязнение электрода не влияет на величину сигнала. Оптимальной избирательности и чувствительности такого сенсора можно достичь подбором соответствующих связывающего белка и конкурентного лиганда например, можно было бы использовать специфические антитела. При использовании сенсора in vivo его недостатками являются все еще ограниченная стабильность и относительно большое время отклика. [c.326]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология