Карбоксипептидаза аминокислотная последовательность

Об использовании экзопептидаз, таких как аминопептидаза и карбоксипептидаза, для определения аминокислотной последовательности вблизи N- и С-концов белков говорилось в разд. 23.3.4. Эндопептидазы являются протеолитическими ферментами, которые избирательно расщепляют пептидные связи в точках, удален ных от концов белковой молекулы. Эндопептидазы сильно различаются по своей специфичности. Обычно сами аминокислотные остатки с любой стороны расщепляющейся пептидной связи являются наиболее важными детерминантами специфичности протеолитических ферментов. Так, трипсин разрывает пептидные связи, в образовании которых участвует карбонильная группа остатков Arg или Lys схемы (25), (26) . [c.274]

Гидролиз пептидов с помощью карбоксипептидаз является основным способом определения С-концевого остатка и С-концевой аминокислотной последовательности. При исследовании структуры пептидов и белков используются карбоксипептидазы А, В, С и Y. Карбоксипептидазы А (СРА) и В (СРВ) выделяют из поджелудочной железы крупного рогатого скота, карбоксипептидазу С (СРС) — из кожуры и листьев цитрусовых, карбоксипептидазу Y ( PY) — из пекарских дрожжей. [c.67]

Ясно, что если мы имеем дело с трипептидами, то для однозначного установления аминокислотной последовательности достаточно первых двух этапов. При расшифровке строения более длинных пептидов весьма полезным оказывается реактив Эдмана. Последовательная, в несколько этапов, идентификация аминокислот с N-конца наряду с выяснением аминокислотного состава пептида и природы С-концевой аминокислоты в ряде случаев оказывается достаточной для установления аминокислотной последовательности в пептидах, содержащих от 8 до 10 аминокислот. Аналогичные исследования, правда по большей части не столь успешные, можно проводить также с помощью лейцинаминопептидазы и карбоксипептидазы. [c.91]

Аминокислотную последовательность С-конца в некоторых случаях удается определить с помощью гидролиза белка в присутствии фермента карбоксипептидазы. [c.289]

Для карбоксипептидазы А (КПА) из поджелудочной железы быка известны и трехмерная структура [1—3], и полная аминокислотная последовательность [4]. Роль существенно важного металла установлена менее определенно, но она доступна изучению с помощью разнообразных спектроскопических [5, 6] и кинетических [7, 8] методов. Следовательно, этот фермент можно включить во все увеличивающийся список белков, для которых возможно провести корреляции структуры и функции. Любой предлагаемый механизм катализа под действием КПА должен теперь учитывать как накопленные химические данные, так и взаимодействия, наблюдавшиеся при структурном исследовании кристаллов комплекса карбоксипептидазы с модельным субстратом глицил-ь-тирозином [3, 9]. [c.504]

Каждый из выделенных пептидов затем изучают в отдельности. Для исследования аминокислотной последовательности наиболее удобны небольшие пептиды, содержащие от четырех до шести аминокислотных остатков. Для них легко установить N- и С-концевые аминокислоты, а также, применив деградацию по Эдману или гидролиз карбоксипептидазой А, определить всю последовательность. Крупные фрагменты после определения концевых остатков и аминокислотного состава обычно расщепляют дополнительным гидролизом на более мелкие части. [c.84]

Способность карбоксипептидаз отщеплять С-концевые аминокислоты широко используется при установлении аминокислотной последовательности. [c.222]

Карбоксипептидаза А широко используется для определения С-концевой аминокислотной последовательности полипептидов. [c.303]

Карбоксипептидаза А гидролизует белки с С-конца полипептидной цепи. Она специфична в отношении гидрофобных боковых цепей фенилаланина, тирозина и триптофана. Карбоксипептидаза В специфична в отношении положительно заряженных боковых цепей лизина и аргинина. Между этими ферментами существует такая же связь, как между химотрипсином и трипсином. Их аминокислотные последовательности идентичны на 49%. Что касается различий в третичной структуре, то они имеются лишь в участках молекул, расположенных на поверхности. Основное отличие состоит в том, что остаток Пе-255, находящийся в кармане карбоксипептидазы А, в карбоксипептидазе В заменен на Азр-255, необходимый для связывания положительно заряженных боковых цепей основных субстратов. [c.33]

Как правило, реконструированные частицы, получаемые путем объединения белковой оболочки с вирусной РНК, обработанной азотистой кислотой, не обладают инфекционной способностью. Следовательно, в большинстве случаев дезаминирование оснований под действием азотистой кислоты приводит к летальным мутациям. В некоторых случаях мутации не легальны и белок мутантного вируса отличается от нативного белка по аминокислотному составу. Например, известен нитритный мутант, у которого на местах, занятых в нативном вирусе пролином, аспарагиновой кислотой и треонином, находятся соответственно лейцин, аланин и серии. В белке ВТМ С-концевая последовательность аминокислотных остатков имеет вид -Гли-Про-Ала-Тре. Протеолитический фермент карбоксипептидаза отщепляет от С-конца при каждом акте отщепления одну аминокислоту. [c.364]

Для полного воссоздания первичной структуры полипептида необходимо идентифицировать аминокислоты, которые входят в состав каждого из фрагментов, получепных в результате неполного гидролиза, и решить, в какой последовательности эти аминокислоты соединяются друг с другом в исходном полипептиде. Один из подходов к решению этой проблемы состоит в том, что проводят полный гидролиз фрагментов, идентифицируют составляющие их аминокислоты, а затем осуществляют химический синтез фрагментов. Другой путь — избирательный гидролиз, при котором от фрагмента отщепляют по одной аминокислоте на каждом этапе, чаще всего при помощи ферментов из подл елудочной железы, так называемых карбоксипептидаз. Эти ферменты способны гидролизовать только С-концевые аминокислоты и, следовательно, постепенно разрушать нептидный фрагмент с С-конца. Нередко достаточно бывает проанализировать различные концентрации аминокислот полученных под действием карбоксипептидазы, которая гидролизовала фрагмент в течение постепенно возрастающих промежутков времени, чтобы получить необходимые данные относительно аминокислотной последовательности. [c.403]

А (Б. Меррифилд, 1969). Дальнейшее развитие получили аналит. методы стал широко использоваться автоматич. аминокислотный анализатор, созданный С. Муром и У. Стайном в 1958, существенно модифицированы хроматографич. методы, до высокой степени совершенства доведен рентгеноструктурный анализ, сконструирован автоматич. прибор для определения последовательности аминокислотных остатков в Б.-секвенатор (П. Эдман, Г. Бэгг, 1967) Благодаря созданию прочной методнч. базы стало возможным проводить широкие исследования аминокислотной последовательности Б. В эти годы была определена структура неск. сотен сравнительно небольших Б. (до 300 аминокислотных остатков в одной цепиХ полученных из самых разл. источников как животного, так и растит., бактериального, вирусного и др. происхождения. Среди них — протеолитич. ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилн-зин, карбоксипептидазы), миоглобины, гемоглобины, цитохромы, лизоцимы, иммуноглобулины, гистоны, нейротоксины, Б. оболочек вирусов, белково-пептидные гормоны и др. В результате были созданы предпосылки для решения актуальных проблем энзимологии, иммунологии, эндокринологии и др. областей физ.-хим. биологии. [c.248]

Для определения С-концевых остатков чаще всего используют ферментативный гидролиз карбоксипептидазами, к-рые специфически расщепляют пептидные связи, образованные С-коицевыми остатками. Поскольку после отщепления концевых остатков фермент атакует послед, пептидные связи, измерение скорости отщепления отдельных аминокислот позволяет анализировать также и С-концевую аминокислотную последовательность. [c.250]

Карбоксипептидаза А образована одиночной полипептидной цепью, содержащей 307 аминокислотных остатков молекулярная масса ее равна 34 470. Аминокислотная последовательность белка была установлена в 1969 г. Р. Брэдшоу и сотр. [c.200]

При этом анализу подвергают отщепляющуюся аминокислоту или непосредственно ее фенилтиогидантоин. Указанный принцип положен в основу работы секвенсоров, автоматически определяюш их аминокислотную последовательность в пептидных фрагментах, получаемых ферментативным расщеплением исследуемых белков. По Сэнджеру концевую аминогруппу П. маркируют 1-фтор-2,4-динитробензолом, подвергают П. гидролизу и определяют динитрофенильные производные аминокислот. С-Концевую аминокислоту можно отщепить с помощью карбоксипептидазы. Используют также полный гидразиполиз пептида. При этом все аминокислоты, кроме С-концевой, выделяются в виде гидразидов. Применяют также масс-спектрометрич. определение аминокислотной последовательности в П. Сведения об оптич. чистоте П. могут быть получены исследованием их атакуемости природными ферментами. [c.15]

Aj Требования, которым удовлетворяют активные центры ферментов. Активный центр фермента обычно представляет собой карман на поверхности фермента, выстланный боковыми цепями аминокислот, необходимыми для связьшания субстрата и катализа его химического превращения. Молекула карбоксипептидазы, последовательно отщепляющей С-концевые аминокислотные остатки от субстратов (пептидов), состоит из одной полипептидной цепи (307 аминокислотных остатков). Три главные каталитические группы в активном центре-это аргинин 145, тирозин 248 и глутаминовая кислота 270 (номер указывает положение аминокислоты в аминокислотной последовательности фермента). [c.269]

Цитохром с из сердечной мышцы лошади был первым цитохромом, для которого установили полную аминокислотную последовательность. Гидролиз цитохрома с химотрипсином дал тринадцать больших пептидов, которые были разделены хроматографией на ионообменных смолах и очищены далее при помощи электрофореза и хроматографии на бумаге. Аминокислотная последовательность пептидов была установлена при помощи химических и ферментативных методов. Химические методы включали динитрофенилирование по Сэнджеру и деградацию по Эд-ману для идентификации N-концевых аминокислот, ферментативные — гидролиз лейцинаминопептидазой для определения N-концевых и карбоксипептидазой А для определения С-концевых аминокислот оба фермента использовались также для определения коротких аминокислотных последовательностей. [c.160]

Каллидин и брадикинин относятся к пептидам плазмы крови. Они повышают проницаемость капилляров, обладают мощным сосудорасширяющим действием, являются сильнейшими возбудителями болевых ощущений. Оба пептида образуются из общего предшественника кининогена в результате протеолитического расщепления. Брадикинин — линейный нонапептид, имеющий следующую аминокислотную последовательность Arg—Pro—Pro-—Gly—Phe—Ser—Pro—Phe—Arg. Каллидин отличается от него наличием еще одного аминокислотного остатка (Lys) на N-конце макромолекулы. Эти пептиды легко инактивируются в результате отщепления С-концевого аргинина при участии фермента карбоксипептидазы. [c.84]

Наконец, рассматривая распространенное предположение, что а-спираль у гетерогенной аминокислотной последовательности представляет собой самую компактную структуру, нужно отметить, что в данном случае наибольшей плотностью должны были бы обладать высокоспирализованные белки. Однако это не так. Например, плотность миоглобина и гемоглобина (1,35 и 1,34 г/см соответственно), состоящих на 75% из а-спиралей, оказывается даже несколько меньше плотности карбоксипептидазы, химотрипсина, рибонуклеазы и стафилококковой нуклеазы (1,39, 1,37, 1,41 и 1,39 г/см соответственно), имеющих незначительное содержание а-спиралей, которые к тому же очень искажены [125—129]. Отсутствие корреляции между спиральным содержанием и плотностью белка следует и из сопоставления значений плотности, полученных Козманом и соавт. [130] из расчета на основе известных координат атомов трехмерных структур. [c.264]

Из кристаллографических данных следует, что механизмы активации трипсиногена и химотрипсиногена сходны [26]. Исследование методом кругового дихроизма ацилферментных интермедиатов, образующихся в ходе катализа трипсином и трипсиногеном, показало, что субстрат связывается с ферментом и с зимогеном по-разному. Интересно, что присоединение N-концевого дипептида трипсина Ile-Val (табл. 3.3) к трипсиногену индуцирует переход последнего в трипсиноподобную конформацию и, наоборот, блокирование N-концевого Не в молекуле трипсина индуцирует конформацию, подобную таковой у трипсиногена [26, 27]. Степень гомологии аминокислотных последовательностей двух изоферментов — карбок-сипептидаз А и В —составляет 51% [28]. Третичная структура карбоксипептидазы А (но не карбоксипеп-тидазы В) установлена с разрешением 0,2 нм конформации зимогенов и, следовательно, структурные изменения, сопровождающие активацию, неизвестны. [c.44]

Из всех методов определения С-концевых аминокислот этот метод самый специфичный. Пользуясь карбоксипептидазой также, как при действии аминопептидазой, можно определять не только С-коицевую аминокислоту, но и последовательно отщеплять аминокислотные остатки с С-конца пептида. Реакция обрывается, когда в пептидной цепи встречается пролин, так как карбоксипептидаза не гидролизует связь СО—N. [c.513]

Следующей задачей при определении строения пептидов является установление характера связи и последовательности аминокислотных остатков в молекуле пептида или белка. Эта задача, трудно выполнимая в настоящее время для белков с большим молекулярным весом, облегчается тем, что в природе встречается значительное число относительно низкомолекулярных соединений, представляющих собою пептиды. Виланд предлагает различать три группы природных пептидов олигопептиды, состоящие из 2—10 аминокис/ют, полипептиды, состоящие из 10—100 аминокислот, и макропептиды, к которым относятся собственно белки. Изучение природных пептидов представляет собой важный этап в подходе к изучению строения белка. Исследование обычно начинают с определения числа цепей, входящих в состав объекта изучения. Для этого пользуются одним из ранее приведенных методов, например диннтрофенилированием, действием азотистой кислогы или аминопептидазы для определения Н-концевой аминокислоты и восстановлением, гидразинолизом или действием карбоксипептидазы для определения С-концевого остатка (см. стр. 510 и далее). [c.514]

Благодаря работе Санжера были достигнуты большие успехи в установлении структуры ряда других гормонов, в частности адренокортикотропных гормонов (АКТГ) из передней доли гипофиза [100, 102]. Было установлено, что АКТГ имеют 39 аминокислотных остатков в нолипентидной цепи. Для установления последовательности аминокислот двумя группами исследователей были использованы различные протеолитические ферменты в сочетании с частичным кислотным гидролизом или без него. В первом случае после переваривания трипсином и химотрипсином были получены пептидные фрагменты, разделение которых достигалось с помощью электрофореза, противоточного распределения, ионообменной и бумажной хроматографии. Затем проводили определение последовательности аминокислот с помощью фенилизотиоциа-ната и метода динитрофенилирования для К-концевых аминокислот соответствующих пептидов, а также гидролиз карбоксипептидазой аминокислот с С-конца гормона. Таким образом была определена последовательность аминокислот для бычьего кортикотро-пина VI [103] [c.412]

Для установления точной последовательности аминокислот четыре больших пептидных фрагмента, полученных из окисленной рибонуклеазы при гидролизе ее трипсином, подвергались гидролизу с химотрипсином [78]. Миллиграммовые количества были выделены и освобождены от солей для уменьшения потерь при последующем анализе. Эти пептиды были исследованы всеми доступными методами белковой химии (автоматический аминокислотный анализ [162], ступенчатое расщепление фенилизотиоцианатом [50, 156, 157], динитрофенилирование и определение К-концевых аминогрупп [57, 77], гидролиз концевых групп карбоксипептидазой [57] и лейцинаминопептидазой [161]). [c.415]

Большое значение приобрел ферментативный метод рпреде-ления С-концевой последовательности аминокислот. Для этой цели используют фермент карбоксипептидазу, выделяемую из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Карбоксипеп-тидаза гидролизует только те пептидные связи, которые обра зованы С-концевой аминокислотой, имеющей свободную а-кар-боксильную группу. Поэтому под действием этого фермента от пептида последовательно отщепляются аминокислоты, начиная с С-концевой. Это позволяет определить взаимное расположение чередующихся аминокислотных остатков. [c.813]

Обсудим последовательные стадии определения первичной структуры небольшого пептида для белка эта процедура аналогична, но более громоздка. Сначала необходимо выяснить, какие аминокислоты находятся на концах цепи. Обратите внимание, что на рис. 40.1 одна концевая аминокислота содержит свободную а-аминогруппу, а другая концевая аминокислота — свободную а-карбоксильную группу. Эти аминокислотные остатки называют соответственно М-концевым и С-концевым. В соответствии с методикой, разработанной Сенджером в его работе с инсулином, сначала используется 1-фтор-2,4-динитробензол, который образует стабильное динитрофенильное производное с Ы-концевым остатком. После кислотного гидролиза модифицированная аминокислота отделяется и идентифицируется. Определение С-концевого остатка можно провести с помощью осторожной обработки ферментом карбоксипептидазой, которая специфически катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи, отщепляя от полипептидной цепи единственную аминокислоту. Существуют также и другие методы определения Н- и С-конце-вых аминокислотных остатков, но два описанных являются наиболее распространенными. [c.374]

Метод прост для выполнения, но требует тщательной очистки фермента малейшая примесь в нем каких-либо протеиназ (например, трипсина или хи.мотрипсина) резко искажает результаты. Поэтому в инкубационную среду обычно добавляют специфический ингибитор этих ферментов—диизопропилфторфосфат, не оказывающий какого-либо действия на карбоксипептидазу. Белок инкубируют в течение различных сроков с карбоксипептида-зой, фермент инактивируют, белки осаждают, а в безбелковом фильтрате количественно определяют отщепившиеся аминокислоты. Для каждой аминокислоты строят график увеличения ее содержания в безбелковом фильтрате во времени. Очевидно, что наибольшая интенсивность накопления должна быть для концевой аминокислоты, несколько меньшая для следующей и т. д. Таким образом, удается установить последовательность расположения в полипептидной цепи нескольких аминокислотных остатков (7—10) с С-конца. Метод был предложен Ленсом в 1949 г. [c.76]

Теперь задача сведена к исследованию поочередно всех пептидов ферментативного гидролизата. Для этого сначала делаем аминокислотный анализ фрагментов, а затем пускаем в ход метод концевых групп Сэнгера или Эдмана. Короткие пептиды (до пентапентидов) расшифровываются сравнительно легко. Метод концевых групп может быть применен многократно и последовательно, т. е. после гидролитического отш епления меченного реагентом конца, можно действовать снова и метить следуюгцее звено с N-кoнцa пептидной цепочки. Можно также использовать карбоксипептидазу для отш епления С-конца. Комбинация этих методов позволяет однозначно расшифровать короткие пептиды за сравнительно небольшой срок. [c.27]

В результате структурных исследований удалось показать что а-МСГ представляет собой амид К-ацетилтридекапептида последовательность аминокислотных остатков которого совпа дает с последовательностью первых 13 аминокислот адренокор тикотропина (табл. 6). При этом не найдено каких-либо видо вых различий так, идентичные образцы а-МСГ были выделены из гипофиза свиньи [944, 950, 1357], быка [790, 1396], лошади [609], овцы [790] и обезьяны [1360]. В соответствии с этим обозначения ас-МСГ, аб-МСГ, ад-МСГ, ао-МСГ, об-МСГ и ч-МСГ отвечают меланотропинам гипофиза свиньи, быка, лошади, овцы, обезьяны и человека. Во всех случаях последовательность аминокислот а-МСГ определяли с помощью частичного кислотного гидролиза, а также расщепления карбоксипептидазой, химотрипсином и трипсином. На рис. 47 показаны пептиды, образующиеся при ферментативном расщеплении а-меланотропина гипофиза обезьяны. Строение Рс-МСГ, являющегося, как пока- [c.228]

МОЩЬЮ динитрофенилирования, а гидразинолиз и обработка карбоксипептидазой привели к установлению строения С-концевой аминокислоты — треонина. Повторная инкубация дезтреонил-глюкагона с карбоксипептидазой позволила определить следующую аминокислоту. Кроме того, авторы использовали в ходе установления строения глюкагона ферментативный гидролиз химотрипсином (6 фрагментов), субтилизином (11 фрагментов) и трипсином (2,5 час, 4 фрагмента 50 час, 6 фрагментов). Пептиды после гидролиза разделяли на дауэксе-50 и анализировали на аминокислотном анализаторе. Дальнейшее динитрофенилиро-вание, обработка карбоксипептидазой и отнесение карбоксамид-ных групп позволили завершить определение последовательности аминокислот в глюкагоне. Хилл и Смит [1004] полностью гидролизовали глюкагон (7 мг) при инкубации с лейцинаминопептидазой (4,35 лг, 7 час, 40°, pH 8,5), доказав тем самым, что в нем содержатся только ь-аминокислоты. [c.330]

Частичный гидролиз эволидина проводили при температуре 35 и 80°. Продукты гидролиза разделяли с помощью электрофореза, а последовательность аминокислотных остатков определяли ди-нитрофенильным методом, а также путем деградации с применением изотиоцианатного метода Эдмана или с помощью карбоксипептидазы (ср. [756]). [c.550]

Определение С-концевых аминокислотных остатков. Карбокси-пептидазный метод. Карбоксипептидазы — ферменты, специфически расщепляющие С-концевые пептидные связи, впервые были применены для гидролиза белков в 1949 г. . Белок подвергают действию фермента и через определенные интервалы времени проводят хроматографирование реакционной смеси. При этом происходит последовательное отщепление аминокислот с С-конца цепи. Свободные аминокислоты выделяют из гидролизата, переводят в ДНФ-производные и подвергают хроматографии на бумаге [c.75]

Кристаллическая карбоксипептидаза А, выделенная из поджелудочной железы, представляет собой одиночную полипептидную цепь, построенную из 310 аминокислотных остатков и имеющую мол. в. 34 300. N-Koh-цевая последовательность карбоксипептидазы Asp—Ser—Thr. С-Концевой аминокислотой является аспарагин рН-Оптимум для карбоксипен-тидазы А из поджелудочной железы 7,3. Молекула карбоксипептидазы А содержит один атом цинка, необходимый для проявления каталитической активности фермента. Удаление цинка с помощью комплексо-образующих средств приводит к потере протеолитической активности . Специфическими ингибиторами карбоксипептидазы А являются ароматические и гетероциклические кислоты [c.303]

Смотреть страницы где упоминается термин Карбоксипептидаза аминокислотная последовательность: [c.489] [c.15] [c.121] [c.539] [c.19] [c.107] [c.305] [c.300] [c.301] [c.178] [c.183] [c.546] [c.193] [c.15] [c.135] [c.185] [c.193] [c.244]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология