Карбоксипептидаза, последовательность аминокислот

Определение С-концевых остатков в пептидах и белках разработано менее удовлетворительно, нежели определение iV-концевых. Предлагались многочисленные химические методы, но ни один из них не выдержал проверку временем. К счастью, с помощью двух панкреатических ферментов — карбоксипептидазы А и карбокси-пептидазы-В — можно получить некоторую информацию о С-кон-цевой последовательности. Карбоксипептидаза А преимущественно отщепляет аминокислоты с ароматическими боковыми группами, а большинство остальных аминокислот отщепляет гораздо медленнее. С-концевой Pro устойчив. Этот фермент хорош при идентификации С-концевых последовательностей у пептидов, образующихся в результате расщепления с помощью а-химотрипсина (см. разд. 23.3.6), так как такие пептиды на С-конце имеют ароматические аминокислоты. При обработке пептида или белка карбокси-пептидазой А возникают те же трудности, что и при использовании аминопептидаз для анализа iV-концевых последовательностей (см. разд. 23.3.4.1). Карбоксипептидаза В гораздо более специфич- [c.272]

Подобным образом с помощью карбоксипептидаз А и В можно определить С-концевые аминокислоты и С-концевую последовательность. Если в С-концевом положении находится основная амино- [c.39]

Таким образом, следует ожидать, что этот фермент будет последовательно освобождать аминокислоты одну за другой вдоль полипептидной цепи. Идентифицируя и количественно определяя эти аминокислоты, можно установить их последовательность. Так, например, после обработки а-кортикотропина карбоксипептидазой были выделены три аминокислоты, а относительные скорости их отщепления (фенилаланин > глутаминовая кислота > лейцин) указали на их последовательность в полипептидной цепи фенилаланин, глутаминовая кислота, лейцин. [c.32]

С-Концевой анализ можно провести с помощью фермента карбоксипептидазы, который специфически отщепляет С-конце-вой остаток от белка. Эту аминокислоту затем можно идентифицировать. Далее процесс повторяют на оставшемся белке и определяют следующий остаток и т. д. до определения всей последовательности. [c.268]

Ясно, что если мы имеем дело с трипептидами, то для однозначного установления аминокислотной последовательности достаточно первых двух этапов. При расшифровке строения более длинных пептидов весьма полезным оказывается реактив Эдмана. Последовательная, в несколько этапов, идентификация аминокислот с N-конца наряду с выяснением аминокислотного состава пептида и природы С-концевой аминокислоты в ряде случаев оказывается достаточной для установления аминокислотной последовательности в пептидах, содержащих от 8 до 10 аминокислот. Аналогичные исследования, правда по большей части не столь успешные, можно проводить также с помощью лейцинаминопептидазы и карбоксипептидазы. [c.91]

Как правило, реконструированные частицы, получаемые путем объединения белковой оболочки с вирусной РНК, обработанной азотистой кислотой, не обладают инфекционной способностью. Следовательно, в большинстве случаев дезаминирование оснований под действием азотистой кислоты приводит к летальным мутациям. В некоторых случаях мутации не легальны и белок мутантного вируса отличается от нативного белка по аминокислотному составу. Например, известен нитритный мутант, у которого на местах, занятых в нативном вирусе пролином, аспарагиновой кислотой и треонином, находятся соответственно лейцин, аланин и серии. В белке ВТМ С-концевая последовательность аминокислотных остатков имеет вид -Гли-Про-Ала-Тре. Протеолитический фермент карбоксипептидаза отщепляет от С-конца при каждом акте отщепления одну аминокислоту. [c.364]

С-концы пептидных цепей определяются избирательным отщеплением концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 73), то избирательно разрушают дисульфидные. мостики окислением (например, над-муравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной [c.458]

Этот фермент может быть выделен из экстрактов поджелудочной железы в чистом виде [128], но до использования для определения последовательности аминокислот его рекомендуется инкубировать с диизопропилфторфосфатом, чтабы инактивировать возможные примеси химотрипсина, трипсина и субтилизина [122, 267, 300]. Основные свойства и специфич-кость действия карбоксипептидазы подробно рассмотрены в ряде работ [228 293]. В Других работах [114, 136, 226, 320] приводятся данные об использовании фермента для определения последовательности аминокислот в белках. Карбоксн-Пептйдаза специфична в отношении С-концевых аминокислот [c.232]

Благодаря работе Санжера были достигнуты большие успехи в установлении структуры ряда других гормонов, в частности адренокортикотропных гормонов (АКТГ) из передней доли гипофиза [100, 102]. Было установлено, что АКТГ имеют 39 аминокислотных остатков в нолипентидной цепи. Для установления последовательности аминокислот двумя группами исследователей были использованы различные протеолитические ферменты в сочетании с частичным кислотным гидролизом или без него. В первом случае после переваривания трипсином и химотрипсином были получены пептидные фрагменты, разделение которых достигалось с помощью электрофореза, противоточного распределения, ионообменной и бумажной хроматографии. Затем проводили определение последовательности аминокислот с помощью фенилизотиоциа-ната и метода динитрофенилирования для К-концевых аминокислот соответствующих пептидов, а также гидролиз карбоксипептидазой аминокислот с С-конца гормона. Таким образом была определена последовательность аминокислот для бычьего кортикотро-пина VI [103] [c.412]

Для установления точной последовательности аминокислот четыре больших пептидных фрагмента, полученных из окисленной рибонуклеазы при гидролизе ее трипсином, подвергались гидролизу с химотрипсином [78]. Миллиграммовые количества были выделены и освобождены от солей для уменьшения потерь при последующем анализе. Эти пептиды были исследованы всеми доступными методами белковой химии (автоматический аминокислотный анализ [162], ступенчатое расщепление фенилизотиоцианатом [50, 156, 157], динитрофенилирование и определение К-концевых аминогрупп [57, 77], гидролиз концевых групп карбоксипептидазой [57] и лейцинаминопептидазой [161]). [c.415]

Большое значение приобрел ферментативный метод рпреде-ления С-концевой последовательности аминокислот. Для этой цели используют фермент карбоксипептидазу, выделяемую из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Карбоксипеп-тидаза гидролизует только те пептидные связи, которые обра зованы С-концевой аминокислотой, имеющей свободную а-кар-боксильную группу. Поэтому под действием этого фермента от пептида последовательно отщепляются аминокислоты, начиная с С-концевой. Это позволяет определить взаимное расположение чередующихся аминокислотных остатков. [c.813]

Aj Требования, которым удовлетворяют активные центры ферментов. Активный центр фермента обычно представляет собой карман на поверхности фермента, выстланный боковыми цепями аминокислот, необходимыми для связьшания субстрата и катализа его химического превращения. Молекула карбоксипептидазы, последовательно отщепляющей С-концевые аминокислотные остатки от субстратов (пептидов), состоит из одной полипептидной цепи (307 аминокислотных остатков). Три главные каталитические группы в активном центре-это аргинин 145, тирозин 248 и глутаминовая кислота 270 (номер указывает положение аминокислоты в аминокислотной последовательности фермента). [c.269]

ВОГО замечательного достижения были разработаны химические способы последовательного отщепления N-концевых аминокислот пептидов [8]. Благодаря получению высокоочищенных препаратов карбоксипептидазы и амино-пептидазы позднее удалось разработать методы ферментативного гидролиза для определения концевых последовательностей аминокислот полипептидных цепей. Хартли и Грей [13] предложили метить N-концевые аминокислоты пептидных фрагментов 1-диметиламинонафтил- [c.100]

В результате структурных исследований удалось показать что а-МСГ представляет собой амид К-ацетилтридекапептида последовательность аминокислотных остатков которого совпа дает с последовательностью первых 13 аминокислот адренокор тикотропина (табл. 6). При этом не найдено каких-либо видо вых различий так, идентичные образцы а-МСГ были выделены из гипофиза свиньи [944, 950, 1357], быка [790, 1396], лошади [609], овцы [790] и обезьяны [1360]. В соответствии с этим обозначения ас-МСГ, аб-МСГ, ад-МСГ, ао-МСГ, об-МСГ и ч-МСГ отвечают меланотропинам гипофиза свиньи, быка, лошади, овцы, обезьяны и человека. Во всех случаях последовательность аминокислот а-МСГ определяли с помощью частичного кислотного гидролиза, а также расщепления карбоксипептидазой, химотрипсином и трипсином. На рис. 47 показаны пептиды, образующиеся при ферментативном расщеплении а-меланотропина гипофиза обезьяны. Строение Рс-МСГ, являющегося, как пока- [c.228]

МОЩЬЮ динитрофенилирования, а гидразинолиз и обработка карбоксипептидазой привели к установлению строения С-концевой аминокислоты — треонина. Повторная инкубация дезтреонил-глюкагона с карбоксипептидазой позволила определить следующую аминокислоту. Кроме того, авторы использовали в ходе установления строения глюкагона ферментативный гидролиз химотрипсином (6 фрагментов), субтилизином (11 фрагментов) и трипсином (2,5 час, 4 фрагмента 50 час, 6 фрагментов). Пептиды после гидролиза разделяли на дауэксе-50 и анализировали на аминокислотном анализаторе. Дальнейшее динитрофенилиро-вание, обработка карбоксипептидазой и отнесение карбоксамид-ных групп позволили завершить определение последовательности аминокислот в глюкагоне. Хилл и Смит [1004] полностью гидролизовали глюкагон (7 мг) при инкубации с лейцинаминопептидазой (4,35 лг, 7 час, 40°, pH 8,5), доказав тем самым, что в нем содержатся только ь-аминокислоты. [c.330]

Хотя из литературных данных известно, что изучались различные химические методы определения С-концевых аминокислот [206], ни один из этих методов не обнаружил достаточно удовлетворительных результатов, которые давали бы основание к его широкому использованию. Поэтому наибольшее распространение получил способ, основанный не на химической, а на ферментативной реакции с карбоксипептидазой — ферментом, реагирующим лишь с теми пептидами, которые содержат свободную карбоксильную группу. Поскольку рассмотрение ферментативных реакций выходит за рамки настоящего раздела книги, реакция с карбоксипептидазой в данном изложении не описывается. Следует отметить, однако, что проблема развития химии белка настолько важна, что вполне оправданы постоянно продолжающиеся исследования, направленные на поиск и разработку удобных и с широкими возможностями применения химических методов. Было показано, что для установления последовательности аминокислот с С-конца белковой молекулы по крайней мере ограниченное применение могут найти три разных химических метода, так как они дают результаты, подтверждающие данные, получающиеся при использовании карбоксипептидазы. Речь идет о гидразинолизе, этерификации с последующим восстановлением сложноэфирной группы на конце молекулы в спиртовую, а также о реакции с неорганическим тиоци-анатом. [c.376]

Определение С-концевой аминокислоты (или последовательности аминокислот) при помощи карбоксипептидаз состоит из расщепления пептида (белка) соответствующим ферментом (смесью ферментов) и отбора аликвот анализируемого раствора [c.507]

Интерпретация. В качестве типичного примера выбора условий эксперимента рассмотрим использование карбоксипептидазы А для определения структуры С-концевой части альдолазы мышцы кролика (рис. 18.13) [95]. При использовании карбоксипептидазы В в гидролизате отсутствовали свободные аминокислоты. Первоначально предполагалась следуюпхая последовательность аминокислот [c.510]

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Расщепление белков под действием карбоксипептидаз, а также изотиоцианатом аммония используют и с целью определения С-конце-вой последовательности белков и пептидов. Обычно перед использованием препараты карбоксипептидаз тщательно освобождают от примесей свободных аминокислот, а также производят специальную обработку с целью ингибирования эндопептидаз. [c.154]

Для полного воссоздания первичной структуры полипептида необходимо идентифицировать аминокислоты, которые входят в состав каждого из фрагментов, получепных в результате неполного гидролиза, и решить, в какой последовательности эти аминокислоты соединяются друг с другом в исходном полипептиде. Один из подходов к решению этой проблемы состоит в том, что проводят полный гидролиз фрагментов, идентифицируют составляющие их аминокислоты, а затем осуществляют химический синтез фрагментов. Другой путь — избирательный гидролиз, при котором от фрагмента отщепляют по одной аминокислоте на каждом этапе, чаще всего при помощи ферментов из подл елудочной железы, так называемых карбоксипептидаз. Эти ферменты способны гидролизовать только С-концевые аминокислоты и, следовательно, постепенно разрушать нептидный фрагмент с С-конца. Нередко достаточно бывает проанализировать различные концентрации аминокислот полученных под действием карбоксипептидазы, которая гидролизовала фрагмент в течение постепенно возрастающих промежутков времени, чтобы получить необходимые данные относительно аминокислотной последовательности. [c.403]

Для определения С-концевых остатков чаще всего используют ферментативный гидролиз карбоксипептидазами, к-рые специфически расщепляют пептидные связи, образованные С-коицевыми остатками. Поскольку после отщепления концевых остатков фермент атакует послед, пептидные связи, измерение скорости отщепления отдельных аминокислот позволяет анализировать также и С-концевую аминокислотную последовательность. [c.250]

Из всех методов определения С-концевых аминокислот этот метод самый специфичный. Пользуясь карбоксипептидазой также, как при действии аминопептидазой, можно определять не только С-коицевую аминокислоту, но и последовательно отщеплять аминокислотные остатки с С-конца пептида. Реакция обрывается, когда в пептидной цепи встречается пролин, так как карбоксипептидаза не гидролизует связь СО—N. [c.513]

Следующей задачей при определении строения пептидов является установление характера связи и последовательности аминокислотных остатков в молекуле пептида или белка. Эта задача, трудно выполнимая в настоящее время для белков с большим молекулярным весом, облегчается тем, что в природе встречается значительное число относительно низкомолекулярных соединений, представляющих собою пептиды. Виланд предлагает различать три группы природных пептидов олигопептиды, состоящие из 2—10 аминокис/ют, полипептиды, состоящие из 10—100 аминокислот, и макропептиды, к которым относятся собственно белки. Изучение природных пептидов представляет собой важный этап в подходе к изучению строения белка. Исследование обычно начинают с определения числа цепей, входящих в состав объекта изучения. Для этого пользуются одним из ранее приведенных методов, например диннтрофенилированием, действием азотистой кислогы или аминопептидазы для определения Н-концевой аминокислоты и восстановлением, гидразинолизом или действием карбоксипептидазы для определения С-концевого остатка (см. стр. 510 и далее). [c.514]

В соке поджелудочной железы помимо трипсиногена и химотрипси-ногена содержатся другие зимогены, которые превращаются в ферменты, отщепляющие аминокислоты от концов пептидных цепей (экзопептидазы) и в отличие от эндопептидаз — трипсина н химотрипсина — не способные расщеплять пептидные связи, находящиеся внутри полипептидной цепи. Карбоксипептидазы атакуют только С-концевые группы, отщепляя последовательно по одной аминокислоте, что делает ее ценным [c.115]

Активность лейцинаминопептидазы, выражаемая числом молей субстрата, расщепляемых в минуту весовой единицей фермента, значительно выше активности карбоксипептидазы, которая в свою очередь активнее папаина—одной из наиболее эффективных протеиназ [297]. Вследствие высокой активности лейцинаминопептидазы даже менее чувствительные связи в полипептидных цепях могут гидролизоваться с заметной скоростью. Кроме того, специфичность действия лейцинаминопептидазы не ограничивается остатками определенного типа, как в случае карбоксипептидазы. Так, фермент освобождает полуцистиновые остатки из пептидных связей. Пролин и аминокислоты с полярными боковыми группами также отщепляются, хотя скорости гидролиза могут быть небольшими. В некоторых случаях подобный широкий спектр активности выгоден, но он увеличивает трудности при попытках установить последовательность сцепления аминокислот на основании данных о скорости отщепления аминокислот при разрыве пептидных связей [149]. [c.236]

Переваривание белков представляет собой сложный процесс и совершается в несколько этапов. Начинается этот процесс в желудке под действием фермента пепсина. Дальнейший гидролиз пептидов происходит в тонком кишечнике протеазами поджелудочной железы трипсином, химотропсином, карбоксипептидазами. В переваривании пептидов участвуют также ферменты слизистой кишечника аминопептидаза и дипептидазы. Благодаря последовательному воздействию на белковую молекулу всех ферментов желудочно-кишечного тракта белок распадается на аминокислоты, которые всасываются в кровь. [c.160]

При этом анализу подвергают отщепляющуюся аминокислоту или непосредственно ее фенилтиогидантоин. Указанный принцип положен в основу работы секвенсоров, автоматически определяюш их аминокислотную последовательность в пептидных фрагментах, получаемых ферментативным расщеплением исследуемых белков. По Сэнджеру концевую аминогруппу П. маркируют 1-фтор-2,4-динитробензолом, подвергают П. гидролизу и определяют динитрофенильные производные аминокислот. С-Концевую аминокислоту можно отщепить с помощью карбоксипептидазы. Используют также полный гидразиполиз пептида. При этом все аминокислоты, кроме С-концевой, выделяются в виде гидразидов. Применяют также масс-спектрометрич. определение аминокислотной последовательности в П. Сведения об оптич. чистоте П. могут быть получены исследованием их атакуемости природными ферментами. [c.15]

Крахмал и другие полисахариды частично гидролизуются амилазой слюны в ротовой полости. Переваривание полисахаридов и дисахаридов завершается в тонком кишечнике под действием амилазы поджелудочной железы, а также лактазы, сахаразы и мальтазы, секретируемых эпителиальными клетками кишечника. Белки перевариваются в результате последовательного действия сначала пепсина в кислой среде желудка, а затем трипсина и химотрипсина в тонком кишечнике при pH от 7 до 8. Далее короткие пептиды гидролизуются до аминокислот под действием карбоксипептидазы и аминопептидазы. Триацилглицеролы перевариваются липазой поджелудочной железы, превращаясь в 2-мо-ноацилглицеролы и свободные жирные кислоты, которые эмульгируются при помощи желчных кислот и всасываются. Пепсин, трипсин, химотрипсин, карбок-сипептидаза и липаза секретируются в желудочно-кишечный тракт в виде неактивных зимогенов. [c.775]

При действии карбоксипептидазы также можно проследить последовательное отщепление аминокислоты с карбоксильного конца полинептидной цепи и таким образом определить порядок соединения аминокислот в белковой моле суле. Применимость метода ограничивается тем, что пептиды, несущие на карбоксильном конце пролин, оксипролин, аргинин, лизин и, гюзможио, глицин, не расщепляются карбоксипептидазой. Для расщепления низкомолекулярных полипептидов используются также и другие пептидазы. [c.41]

Из большого числа разнообразных протеолитических ферментов для определения стерической однородности пептидов чаще всего применяют лейцинаминопептидазу, карбоксипепти-дазы А и В, трипсин и химотрипсин. Лейцинаминопептидаза обладает способностью последовательно отщеплять остатки N-концевых аминокислот, причем для действия этого фермента наличие свободной карбоксильной группы не является обязательным. Карбоксипептидаза А, напротив, элиминирует амино- [c.402]

Обсудим последовательные стадии определения первичной структуры небольшого пептида для белка эта процедура аналогична, но более громоздка. Сначала необходимо выяснить, какие аминокислоты находятся на концах цепи. Обратите внимание, что на рис. 40.1 одна концевая аминокислота содержит свободную а-аминогруппу, а другая концевая аминокислота — свободную а-карбоксильную группу. Эти аминокислотные остатки называют соответственно М-концевым и С-концевым. В соответствии с методикой, разработанной Сенджером в его работе с инсулином, сначала используется 1-фтор-2,4-динитробензол, который образует стабильное динитрофенильное производное с Ы-концевым остатком. После кислотного гидролиза модифицированная аминокислота отделяется и идентифицируется. Определение С-концевого остатка можно провести с помощью осторожной обработки ферментом карбоксипептидазой, которая специфически катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи, отщепляя от полипептидной цепи единственную аминокислоту. Существуют также и другие методы определения Н- и С-конце-вых аминокислотных остатков, но два описанных являются наиболее распространенными. [c.374]

Метод прост для выполнения, но требует тщательной очистки фермента малейшая примесь в нем каких-либо протеиназ (например, трипсина или хи.мотрипсина) резко искажает результаты. Поэтому в инкубационную среду обычно добавляют специфический ингибитор этих ферментов—диизопропилфторфосфат, не оказывающий какого-либо действия на карбоксипептидазу. Белок инкубируют в течение различных сроков с карбоксипептида-зой, фермент инактивируют, белки осаждают, а в безбелковом фильтрате количественно определяют отщепившиеся аминокислоты. Для каждой аминокислоты строят график увеличения ее содержания в безбелковом фильтрате во времени. Очевидно, что наибольшая интенсивность накопления должна быть для концевой аминокислоты, несколько меньшая для следующей и т. д. Таким образом, удается установить последовательность расположения в полипептидной цепи нескольких аминокислотных остатков (7—10) с С-конца. Метод был предложен Ленсом в 1949 г. [c.76]

Иногда можно получить более полные данные о С-кон-цсвой последовательности, если построить график скоростей отщепления различных аминокислот под действием карбоксипептидазы. На фиг. 66 приведены данные такого рода для а-кортикотропина, полученные Харрисом и Ли [5] при отношении фермент/ субстрат=1,25, pH 8,0—8,5 и температуре 37°. Пробы отбирали через определенные промежутки времени, фермент инактивировали соляной кислотой, доводя pH до 3,0—3,5 аминокислоты идентифицировали в виде их ДНФ-ироизводных после обработки реакционной смеси ФДНБ при pH 9,0. Было установлено, что С-концевая последовательность следующая . ..-Лей-Глу-Фен действие фермента прекращалось у остатка пролина. [c.188]

Цитохром с из сердечной мышцы лошади был первым цитохромом, для которого установили полную аминокислотную последовательность. Гидролиз цитохрома с химотрипсином дал тринадцать больших пептидов, которые были разделены хроматографией на ионообменных смолах и очищены далее при помощи электрофореза и хроматографии на бумаге. Аминокислотная последовательность пептидов была установлена при помощи химических и ферментативных методов. Химические методы включали динитрофенилирование по Сэнджеру и деградацию по Эд-ману для идентификации N-концевых аминокислот, ферментативные — гидролиз лейцинаминопептидазой для определения N-концевых и карбоксипептидазой А для определения С-концевых аминокислот оба фермента использовались также для определения коротких аминокислотных последовательностей. [c.160]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология