Метод гомогенатов

Первый раздел Практикума должен помочь студентам освоить методические приемы и основы аналитической биохимии. Он содержит описание основных принципов и методов концентрационного анализа, принятых в биохимии (спектрофотометрического, колориметрического, манометрического), в частности, для количественного определения гликогена, глюкозы, неорганического фосфата, фосфорных эфиров углеводов, молочной и пировиноградной кислот. В раздел включены работы, посвященные анаэробному превращению углеводов. Каждая задача, выполняемая студентом, предусматривает анализ чистоты исходного препарата углевода или его фосфорного эфира, получение ферментного препарата (гомогената или экстракта ткани), постановку биохимического эксперимента, количественную оценку результатов. Количественное определение веществ проводится несколькими методами, результаты сопоставляются. Так, выполняя задание по теме Превращение фруктозо-1,6-дифосфата в молочную кислоту , студент анализирует фруктозо-1,6-дифосфат по фруктозе и по фосфату, молочную кислоту определяет спектрофотометрическим и колориметрическим методами. Подобным образом выполняются работы, связанные с превращением других фосфорных эфиров углеводов, гликогена, глюкозы. [c.5]

В настоящее время наиболее надежным методом получения препаратов НК является фенольно-детергентный метод. Сущность этого метода и его многочисленных модификаций заключается в том, что извлечение НК достигается фенольной обработкой гомогената в присутствии детергентов и ингибиторов, нуклеаз [1]. [8], [11], [15], [19], [20], [22], [23], [32]. [c.53]

Получение гомогената скелетных мышц крысы. Среда выделения-. калий-фосфатный буфер — 0,05 М раствор, pH 7,6 pH буфера проверяют на потенциометре или с универсальным индикатором буферным методом. Всю посуду перед работой необходимо охладить на льду. [c.49]

Рибосомы получают из гомогената печени крысы (см. сноску к с. 167) методом дифференциального ультрацентрифугирования. Обломки клеток, ядра и митохондрии удаляют центрифугированием при 18 000 g рибосомы осаждают ультрацентрифугированием при 105000 g. [c.170]

Определение содержания фосфамида в тканях растений методом гомогенатов и контактным методом. [c.190]

Метод гомогенатов наиболее прост и благодаря высокой чувствительности плодовой мухи к фосфамиду дает возможность определять сравнительно малые количества фосфамида (до 0,2 мг/кг). [c.190]

Метод гомогенатов. Анализируемую растительную пробу предварительно измельчают и гомогенизируют. Количественное определение остатков проводят путем сравнения смертности мух в исследуемых образцах и стандартных пробах, в которых количество фосфамида известно. По показателям смертности мух в стандартных пробах строят график зависимости гибели мух от доз фосфамида. [c.190]

Экспериментальные приемы, применяемые в биохимии для изучения метаболизма, разнообразны. Исследования химических превращений проводятся на уровне целых органов, в тонких срезах и клеточных культурах, в гомогенатах тканей, органелл и очищенных ферментов. В любом эксперименте важную роль играют методы количественной регистрации химических превращений. Гравиметрические методы недостаточно чувствительны и часто непригодны для анализа органических соединений. Поэтому в биохимии широко применяются спектрофотометрические и колориметрические методы, имеющие высокую чувствительность и позволяющие определять очень небольшие количества веществ. Некоторые превращения сопровождаются поглощением или выделением газа. Для количественной регистрации таких превращений применяются манометрические методы. [c.5]

Для успешного вьщеления ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур лизосом, митохондрий, ядер и др., которые имеют в своем составе многие индивидуальные ферменты. Для этого используют специальные мельницы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения ферментов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют небольшие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обрабатывают их энзимами — лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при вьщелении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (нейтральные значения pH, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений). [c.79]

Прямой метод. В пробирки, содержащие 25—100 мг ткани, 1 мл гомогената или безбелкового раствора, добавляют по 3 мл 30%-ного раствора едкого калия. Пробы закрывают пробками и помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры, содержимое пробирок количественно переносят в мерные колбочки на 25—50 мл в зависимости от содержания гликогена в пробах (1 мл получаемого раствора должен содержать от 3 до 30 мкг гликогена) и объем доводят водой до метки. В широкие пробирки берут по 2,5 мл полученного раствора, ставят их в лед, добавляют при встряхивании 5 мл раствора антрона, тщательно перемешивают, погружают на 10 мин в водяную баню при 90° С, затем охлаждают и фотометрируют при 620 нм. [c.24]

Непрямой метод. В центрифужную пробирку берут 25— 100 мг исследуемой ткани, 1 мл гомогената или безбелкового фильтрата, добавляют 3 мл 30%-ного раствора КОН и нагревают в кипящей водяной бане в течение 20 мин. Затем пробы охлаждают, добавляют равный объем (4 мл) спирта, хорошо перемешивают стеклянной палочкой и помещают в кипящую водяную баню. Когда спирт закипит, пробы охлаждают и осадок гликогена отделяют центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок гликогена растворяют в 1 мл дистиллированной воды [c.24]

Современные методы измельчения тканей обычно сочетают с одновременной экстракцией белков из гомогенатов тканей. Большинство белков тканей хорошо растворимо в 8—10% растворах солей. При экстракции белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значениями pH среды, органические растворители, а также неионные детергенты — вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами. [c.24]

При помощи метода фракционирования гомогенатов органов и тканей в центрифугах было показано, что ядерная фракция печени и почек содержит незначительное число ферментов, хотя известно, что в ядрах осуществляется синтез некоторых белков. Основное место синтеза белка, как теперь установлено,— фракция рибосом цитоплазмы. Показано, кроме [c.158]

Из разрушенных клеток (гомогенатов) методом дифференциального центрифугирования были выделены отдельные органеллы и фракции, что позволило изучать их биохимическими методами. Благодаря комбинации оптических и биохимических методов удалось быстро выяснить структуру и функции органелл и иных составных частей клетки. В результате этих исследований было установлено, что эукариоты и прокариоты по многим особенностям отличаются друг от друга. [c.23]

Биохимический метод определения нуклеиновых кислот в гомогенатах гонад менее показателен, ибо, как установлено, например, Г. М. Егоровой при воздействии свинца нуклеиновые кислоты могут перераспределяться между различными генерациями половых клеток — в одних слоях увеличиваться, в других уменьшаться. Таким образом, общие изменения могут оказаться нивелированными. По нашим данным, более чувствительным тестом является активность нуклеаз (метод [c.252]

По этим же причинам чувствительность метода снижается при большой концентрации белков, обладающих буферными свойствами. В связи с этим метод потенциометрического титрования при постоянном значении pH в большей мере удобен для работы с очищенными препаратами холинэстераз, лишенными балластных белков. Впрочем, при высокой чувствительности рН-метра удается достаточно точно определять активность холинэстераз даже в гомогенатах тканей. Так, используя рН-метр ЛП-1 с чувствительностью —0,005 ед. pH, нам удавалось измерять скорости реакции порядка 0,01 мкмоля ацетилхолина в 1 мин. при работе с гомогенатами нервной ткани различных животных. [c.150]

Обсуждение. По этой простой методике анализа белковых гидролизатов можно определять 23 соединения, включая обычные аминокислоты. Однако если эти аминокислоты содержатся в физиологических жидкостях, таких, как плазма крови, моча, гомогенаты тканей, то для полного анализа требуется более сложная методика. При одноколоночном методе анализа отпадает необходимость регенерации колонки и уравновешивания смолы буфером. [c.70]

Познание процессов промежуточного обмена аминокислот явилось результатом множества разнообразных экспериментальных исследований и наблюдений. Работы в области физиологии и биохимии питания позволили получить важные данные, которые в конечном счете привели к выяснению ряда реакций обмена, а в двух случаях— к открытию и идентификации новых аминокислот (метионин и треонин). Применение мутантных штаммов микроорганизмов оказалось весьма эффективным способом исследования процессов обмена, и в частности тех процессов, с которыми связан биосинтез аминокислот. В культурах мутантов, у которых блокированы различные звенья биосинтеза, накапливаются промежуточные продукты, которые нередко удается обнаружить по их способности обеспечивать рост других мутантных штаммов. Наблюдения на людях, страдающих наследственными пороками обмена веществ, наряду с исследованиями обмена у микроорганизмов сыграли большую роль в выяснении нормальных путей обмена аминокислот. Ряд интересных сведений дали исследования с перфузией изолированных органов, со срезами тканей, гомогенатами и экстрактами тканей и очишенными ферментами. Широкое применение в изучении промежуточного обмена находят меченые соединения. Этот метод, часто используемый в сочетании с другими подходами, оказался путеводной нитью к отысканию и расшифровке многих реакций обмена. [c.306]

Де Дюв указывает, что любой эксперимент этого типа включает в себя три стадии 1) деструктивная стадия, в процессе которой суспензия ткани или клеток превращается в гомогенат 2) перераспределение компонентов гомогената по фракциям на основании их физических свойств (т. е. константы седиментации, плотности и т. д.) 3) анализ этих фракций. Для интерпретации полученных результатов необходимо в свою очередь провести три стадии реконструкции 1) определение морфологических и биохимических свойств выделенных фракций 2) переоценка данных, полученных на предыдущей стадии, применительно к компонентам исходного гомогената и методам фракционирования, использованным вначале, и, наконец, 3) отождествление компонентов гомогената с определенными внутриклеточными образованиями. [c.250]

Способность кизельгура прочно сорбировать белки была использована В. С. Шапотом п сотрудниками, предложившими изящный метод фракционирования нуклеиновых кислот, входящих в состав клеточных нуклеонротеидов. Клетки гепатомы Зайделя, пометив предварительно в них РНК С- или Ш-уридином, а ДНК — Ш-ти-мпдпном, вскрывали детергентом, а гомогенат вносили на колонку, [c.245]

Ферменты локализованы во всех компартментах клеток. Ядерные ферменты катализируют синтез информационных макромолекул, а также процессы их созревания, функционирования и распада. В митохондриях действуют ферменты энергетического обмена, в аппарате Гольджи — ферменты, катализирующие созревание белков, в лизосомах — гидролитические ферменты. Значительное число ферментов ассоциировано с внешней и внутренними мембранами. Так, ферменты, защищающие клетку от действия чужеродных химических веществ, локализованы в эндоплазматическом рети1сулуме. Распределение ферментов в клетках определяют методом дифференциального центрифугирования гомогената тканей. Локализация некоторых ферментов идентифицирована гистохимическими методами in situ. Для этого при помощи микротома получают срезы ткани и обрабатывают их раствором субстрата. Идентификация продуктов ферментативной реакции облегчена, если последние окрашены. [c.65]

Синтез АТР in vitro в гомогенатах тканей впервые наблюдал в 1937 г. Калькар, написавший на эту тему интересный исторический обзор [71]. Важное достижение относится к 1941 г., когда Очоа провел первое надежное измерение отношения Р/О. Отношение Р/0 равно числу молекул АТР, образованных в расчете на один атом кислорода, использованного в процессе дыхания. Оно также равно числу молекул АТР, образующихся при переносе пары электронов по цепи переносчи- ков. Очоа установил, что в случае окисления пирувата в ацетил-СоА и СО2 (процесс, передающий в цепь переносчиков два электрона) отношение Р/О примерно равно трем. Впоследствии это значение многократно подтверждалось. Однако следует ясно сознавать, что измерение отношения Р/0 сопряжено со многими экспериментальными трудностями, по--служившими причиной многих ошибок, которые были сделаны даже в - едавнее время. Один из методов определения отношения Р/0 основан а количественном определении АТР, описанном в подписи к рис. 8-11. [c.400]

В США были проведены исследования, в процессе которых несколько лабораторий должны были выполнить анализы трех степеней сложности. Полученные в разных лабораториях результаты затем сравнивались. На первом этапе изучения были разосланы растворы, содержащие полициклические ароматические соединения в концентрациях лорядка М кг/г, для их определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В этом экоперименте относительное стандартное отклонение по данным любой одной лаборатории и по данным межла-бораторного определения составило 2 и 11% соответственно. В аналогичном эксперименте по определению фенолов в воде для относительного стандартного отклонения межлабораторных результатов была получена величина более 20%. На третьем этапе межлабораторному сравнительному изучению были подвергнуты образцы, взятые из живой природы . Национальное бюро стандартов разослало гомогенаты ткани устрицы с просьбой определить в них содержание линдана и диэльдрина. Относительное стандартное отклонение результатов составило 200% (т. е. распределение результатов резко отличалось от нормального). В настоящее время не представляется возможным добиться абсолютной достоверности в анализе таких образцов, так как определяемое вещество часто экстрагируется не полностью и та как невозможно разложить матрицу в той мере, в какой это необходимо для полного выделения анализируемого вещества и в какой это легко достигается при анализе следовых количеств неорганических веществ [3]. В проводившемся позднее экоперименте изучению в восьми различных лабораториях были подвергнуты гомогенаты ткани двустворчатых моллюсков, содержащие следовые количества углеводородов. Результаты межлабораторных исследований соответствовали относительному стандартному отклонению 40% вследствие неоднородности образца, его неустойчивости при хранении свыше 9 месяцев и аналитических погрешностей [1691. В табл. 2.20 приведены краткие результаты других совместных работ. [c.69]

В препаративной энзимологии чаще пользуются методом дифференциального центрифугирования гомогенатов тканей (рис. 4.26). Для этого сначала разрушают клеточную структуру с помощью подходящего дезинтегратора и полученную квазиоднородную (гомогенизированную) массу подвергают дифференциальному центрифугированию при температуре О—4°С. Обычно распределение ферментов изучают в последовательных индивидуальных фракциях, изолированных при дробном центрифугировании гомогенатов, в частности во фракции ядер, которую получают при низкой скорости центрифугирования, во фракции митохондрий, которая осаждается при средней скорости центрифугирования, во фракции микросом (или рибосом), для изолирования которой требуется высокая скорость центрифугирования, и, наконец, в оставшейся прозрачной надосадочной жидкости (супернатант), представляющей собой растворимую фракцию цитоплазмы. Следует отметить, что фракция митохондрий не является гомогенной, поскольку из нее удается изолировать частицы, известные как лизосомы, размер которьгх занимает промежуточное место между размерами митохондрий и микросом. В свою очередь микросомальная фракция также является гетерогенной, поскольку состоит в основном из элементов эндоплазматической сети неоднородного строения. [c.158]

Бактериологическое и биологическое исследование. После микроскопии материал засевают на специальные жидкие и плотные среды (анаэробный кровяной агар, среда Вильсона —Блера, среда Китта—Тароцци, желточная среда). Для приготовления неселективной среды для клостридий используют в качестве основы агар для бруцелл с 5 % бараньей крови, колумбийский или сердечно-мозговой агары, в которые добавляют дрожжевой экстракт, витамин К и гемин. В качестве селективных сред (для контаминированных образцов) можно использовать анаэробный кровяной агар с добавлением неомицина или фенилэтилового спирта. Перед посевом плотные материал гомогенизируют (растирают в стерильной ступке со средой накопления) и делят на две части, одну из которых прогревают в водяной бане при 80 °С в течение 10 мин (для уничтожения вегетативных клеток сопутствующих микроорганизмов). Обе части материала исследуют одновременно. В качестве альтернативного метода (особенно при подозрении на присутствие термочувствительных штаммов С. perfringens) используют обработку материала этиловым спиртом, к 1,0 мл исследуемого гомогената или экссудата добавляют такое же количество 95%-го этанола и перемешивают их при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего этим материалом засевают указанные выше питательные среды. [c.191]

Для быстрого определения воды в мясе Аддис и Чадгар [1] тщательно гомогенизировали 20 г образца в течение 1 мин в 40 мл изопропанола, затем гомогенат фильтровали, 1 мл фильтрата разбавляли 1 мл воды и измеряли показатель преломления с точностью 0,0001. Процентное содержание воды в образце находили по градуировочному графику, построенному по смесям вода—изопропанол с известным содержанием воды. Метод применим для анализа мяса, содержащего более 50% воды. [c.546]

Метод Варбурга, применяемый для исследования окислительных процессов в тканях и окислительного фосфорилирования, не пригоден для массового обследования животных, так как он трудоемок, требует затраты большого количества времени. В настоящее время все более широкое распространение получают методы полярографического исследования определение кислорода в гомогенатах и срезах тканей, изучение переноса электронов и энергии в дыхательные цепи, а также исследование напряжения кислорода в тканях методом вживления электродов (И. М. Эпштейн, 1960 М. Н. Кондрашова, 1965 Н. В. Саноцкая, 1961). [c.230]

Принцип метода состоит в том, что к гомогенату ткани добавляют Na 104 до конечной концентрации 1 М. Это вызывает диссоциацию ДНП на ДНК и белок. После удаления белков смесью хлороформа с изоамиловым спиртом РНК разрушается РНК-азой, а ДНК осаждается изопропанолом [27]. [c.58]

Фенольный метод выделения ДНК- При обработке гомогената клеток кислым фенолом в водносолевой слой извлекается большая часть РНК. Основная же масса ДНК оказывается во втором слое или в осадке. В соответствующих условиях эта ДНК может быть выделена [1], [15]. [c.61]

Суммарная или тотальная РНК в растительной клетке представлена тремя хорошо изученными типами молекул т-РНКг р-РНК и м-РНК. Для выделения РНК из растений в недеградированном состоянии обычно применяют различные модификации фенольно-детергентного метода. При выделении суммарной РНК 1ИЗ растений необходимо обрашать внимание на ингибицию активности РНК-азы, особенно следов ее, а также на очистку гомогената от полисахаридов и полифосфатов. [c.62]

Применение. В гистохимии ферментов в сочетании с солью тетразолия в качестве субстрата для выявления цитохромоксидазы [1, 2]. Метод основан на том, что гомогенаты тканей в присутствии 1,4-феннлендиамина восстанавливаю цитохром с, который в свою очередь восстанавливает хлорид тетразолия до интенсивно окрашенного формазана, В аналитической химии в качестве реактива на иридий и нитрит. [c.407]

Методы определения. В еоздухе. Определение основано на нитровании Б. до динитросоединения, которое дает окраску с ацетоном в присутствии щелочи мешают ароматические углеводороды чувствительность — 5 мкг в анализируемом объеме раствора ( Техн. уел... ). В биосредах (гомогенаты микросом клеток печени). Определение Б. и его гидроксилированных метаболитов можно быстро проводить с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (Burke, Prough). [c.210]

Описанными выше методами из клеток можно экстрагировать достаточно большое количество РНК и фракционировать ее затем хроматографическими или другими методами. Однако в ряде случаев удобнее фракционировать клеточный материал, прелюде чем будет экстрагирована РНК. Методом, описанным в гл. VIII, можно выделить из клеток рибосомы и использовать их для получения г-РНК [9]. Растворимая РНК (s-PHK) содержится в растворимой цитоплазматической фракции клеток (отсюда ее название), которую получают при центрифугировании гомогената ткани с целью удаления ядер, митохондрий, микросом и рибосом. Эта фракция может содержать также небольшое количество те-РНК или разрушенной г-РНК. Для получения s-PHK указанную фракцию используют либо непосредственно, либо после добавления кислоты до pH 5,4—5,0. В последнем случае образуется так называемый рН5-осадок , из которого s-PHK экстрагируется фенолом (стр. 267). [c.40]

Вайнхауз и сотрудники [121 —124] доказали, что в организме крыс происходит взаимопревращение глицина и глиоксиловой кислоты. Глицин, глиоксиловая и гликолевая кислоты быстро окисляются срезами печени крысы с образованием СОг, щавелевой кислоты и гиппуровой кислоты (последняя появляется в присутствии бензойной кислоты). При помощи метода изотопной ловушки было доказано превращение глицина в глиоксиловую кислоту в гомогенате печени крысы. Найдено, что щавелевая кислота образуется не прямо из глицина, а из глиоксиловой кислоты, в условиях, когда последняя присутствует в относительно больших концентрациях. Дальнейшими исследованиями выяснено, что в обычных условиях щавелевая кислота, вероятно, не образуется и что а-углеродные атомы глицина, гликолевой кислоты и глиоксиловой кислоты переходят в муравьиную кислоту. [c.319]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология