Каталитически активные антитела

Горизонты энзимологии. В литературе появляются работы, в которых делаются попытки прогнозирования дальнейшего развития энзимологии на ближайшее десятилетие. Перечислим основные направления исследований энзимологии будущего. Во-первых, это исследования более тонких деталей молекулярного механизма и принципов действия ферментов в соответствии с законами югассической органической химии и квантовой механики, а также разработка на этой основе теории ферментативного катализа. Во-вторых, это изучение ферментов на более высоких уровнях (надмолекулярном и клеточном) структурной организации живых систем, причем не столько отдельных ферментов, сколько ферментных комплексов в сложных системах. В-третьих, исследование механизмов регуляции активности и синтеза ферментов и вклада химической модификации в действие ферментов. В-четвертых, будут развиваться исследования в области создания искусственных низкомолекулярных ферментов —синзимов (синтетические аналоги ферментов), наделенных аналогично нативным ферментам высокой специфичностью действия и каталитической активностью, но лишенных побочных антигенных свойств. В-пятых, исследования в области инженерной энзимологии (белковая инженерия), создание гибридных катализаторов, сочетающих свойства ферментов, антител и рецепторов, а также создание биотехнологических реакторов с участием индивидуальных ферментов или полиферментных комплексов, обеспечивающих получение и производство наиболее ценных материалов и средств для народного хозяйства и медицины. Наконец, исследования в области медицинской энзимологии, основной целью которых является выяснение молекулярных основ наследственных и соматических болезней человека, в основе развития которых лежат дефекты синтеза ферментов или нарушения регуляции активности ферментов. [c.117]

Необратимое свертывание белка яиц при нагревании — явление хорошо известное. Подобное изменение в состоянии указанного белка может быть вызвано и действием ряда других физических и химических агентов сильным встряхиванием, облучением ультрафиолетовыми лучами, действием ультразвуковых волн, кислот, щелочей, органических растворителей, солей тяжелых металлов, мочевины, гуанидина, салицилатов и многих других веществ. При всех этих воздействиях белок теряет свою первоначальную растворимость и в большинстве случаев становится нерастворимым при изоэлектрической точке. В отличие от других белков коллаген при нагревании в воде растворяется. Измененные под влиянием всех указанных воздействий нативные белки получили название денатурированных белков. часто сопровождается потерей биологической активности белков. Так, например, ферменты теряют свою каталитическую активность, гормоны — физиологическую функцию, антитела — способность соединяться с антигеном. Эти изменения не всегда протекают параллельно изменениям физико-химических свойств белков. Денатурация, очевидно, представляет собой комплексное явление. Вряд ли можно думать, что действие столь различных соединений, как мочевина и серная кислота, а также влияние нагревания обусловливают одно и то же изменение белков. Нельзя поэтому просто говорить о денатурации белков, например яичного альбумина необходимо всегда указывать, какой именно агент вызвал денатурацию. [c.147]

И, наконец, соли тяжелых металлов, такие, как Ag, Си, РЬ, Hg, инактивируют ферменты благодаря своей способности денатурировать белки, т. е. их действие мало специфично к свойствам активного центра фермента. Формально к ингибиторам можно отнести и вещества, способные реагировать с субстратом, коферментами или активаторами, например ионами металлов. Ингибиторами можно считать и антитела, которые присоединяются к ферменту и лишают его каталитической активности, но мало специфичны к его адсорбционному и каталитическому центру. [c.72]

Биологические макромолекулы, в частности пептиды, сохраняют комплементарность межмолекулярных взаимодействий в достаточно широком диапазоне конформаций. Эта их способность лежит в основе каталитической активности ферментов, и модель комплементарного взаимодействия ключ—замок была впервые использована на заре энзимологии. Позднее эта же модель использовалась при обсуждении специфичности связывания антигена с антителом и селективности взаимодействия рецептора с лигандом. [c.29]

Особую значимость для широкого внедрения твердофазного ИФА в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полисти-рольных плат, содержащих 96 лунок. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине 60-х годов и использован первоначально в методах РИА. Введение в практику ИФА полистирольных плат позволило значительно увеличить число-проводимых анализов и упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок платы. [c.7]

При проведении РИА оба эти пути теоретически равноценны, так как реально регистрируемый сигнал (распад/мин), полученный от одной и той же концентрации связанной или свободной метки, одинаков. При проведении же ИФА теоретически не исключена вероятность, что активность фермента в комплексе иммобилизованное антитело — антиген-фермент будет отлична от его активности в несвязанном конъюгате. В этом случае регистрация одного и того же сигнала на твердой фазе и в растворе не может служить однозначным свидетельством о равном перераспределении начального количества конъюгата. Другими словами, экспериментально определив Р и вычислив значение В как разность, получим истинное соотношение В/Р, но, экспериментально измерив В (исходя из неизменности каталитической активности фермента в комплексе) и вычислив Р, можно получить значение В/Р, ие отражающее реального перераспределения меченого антигена. Предположение об изменении активности фермента может быть подтверждено или отброшено только на основе проведения дополнительных экспериментов. Наиболее простым из них является одновременно определение В экспериментально и как разность ([Аг ]о—Р). Совпадение полученного и вычисленного значения В [c.259]

В этой главе описан метод иммуноферментного анализа без разделения компонентов, основанный на способности специфических антител против лиганда ограничивать конформационную подвижность связанного с ним апофермента. В результате такого воздействия апофермент теряет возможность сворачиваться в каталитически активную конформацию. [c.97]

ЮТСЯ к активированной агарозе. Агароза, к которой привязан белок — ингибитор трипсина, выделяемый из соевых бобов, является превосходным специфическим адсорбентом трипсина и химотрипсина (рис. 5.21). Оба фермента связываются с этим ингибитором в соке поджелудочной железы в условиях их каталитической активности, поэтому очень вероятно, что взаимодействие с ингибитором происходит специфически. В аффинной хроматографии адсорбцию белков обычно осуществляют в условиях, благоприятствующих максимальному специфическому связыванию. После того как большинство белков сока поджелудочной железы выйдет, не задерживаясь, из колонки, химотрипсин специфически элюируют буферным раствором, содержащим ингибитор этого фермента — триптамин. Затем раствором, содержащим бензамидин (ингибитор трипсина, но не химотрипсина), элюируют трипсин. Триптамин и бензамидин являются специфическими десорбентами этих ферментов, поскольку они также связываются с их активными центрами и, следовательно, способны вытеснять оттуда соевый ингибитор трипсина. Привязывание белков к агарозе нашло широкое применение для выделения других белков например, специфические антитела на какой-либо белок-антиген адсорбируют на агарозе с привязанным антигеном, а затем десорбируют их, промывая колонку раствором с высокой ионной силой или низким pH. [c.160]

Возможность сорбции на ионообменных материалах различных биологически активных веществ с сохранением их биологического действия — новая область применения ионитов (см. раздел X. 4). Химизм взаимодействия органического вещества с ионитом может быть различным (ионный обмен, комплексообразование с противоионом или с функциональными группами полимерного каркаса, молекулярная сорбция), но в конечном итоге должен обеспечивать необходимую прочность связи. Иммобилизованные ферменты можно применять для проведения сложных каталитических реакций, пропуская раствор, биологическую жидкость, кровь через колонку с сорбентом без введения вещества-катализатора в реакционную среду. Показана перспективность применения иммобилизованных антител для воздействия на антигены (соответственно — иммобилизованных антигенов для специфического связывания антител) при непосредственном взаимодействии с кровью (иммуносорбция) ] 625, с. 136]. [c.390]

Получены экспериментальные доказательства, что, помимо белков, ферментатпвноп, каталитической активностью наделен и ряд других макромолекул, в частности РНК (названы рибозимами) и MOHO- и поликлональные антитела (абзимы)-см. главу Ферменты . [c.21]

Интересные возможности были обнаружены при использовании ферментов для повышения чувствительности иммунохими-ческих методов анализа. Сущность любого иммунохимического анализа сводится к тому, чтобы после завершения реакции антиген-антитело определить концентрацию избыточного компонента (антигена или антитела), не вступившего в реакцию. Поскольку эти концентрации очень невысоки (10 — 10 моль/л), для их обнаружения обычно применяют легко детектируемую метку радиоактивным атомом, вводимым в один из компонентов (радиоактивный иод, тритий). Оказалось, что без потери чувствительности метода радиоактивная метка может быть заменена присоединением фермента, который после реакции обнаруживается по его каталитической активности. Накоплен достаточный материал по применению этого нового метода, получившего название иммуноферментный анализ (ИФА). С помощью ИФА могут быть детектированы любые вещества, обладающие свойствами антигенов и, естественно, многочисленные возбудители заболеваний человека, животных, растений. Многие из этих методов могут быть приспособлены к автоматическому режиму слежения, что важно для решения задач экологии, контроля технологических производств и т. д. [c.17]

Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7), щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) и р- )-галактозидаза (КФ 3.2.1.23). Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента, с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. При работе с большинством из них следует учитывать их канцерогенные и мутагенные свойства и соблюдать осторожность. Каталитическая активность глюкозооксидазы регистрируется с теми же хромогенами, что и пероксидазы, однако чувствительность ее определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента является полное отсутствие его в плазме крови, что дает возможность использования фермента в гомогенных методах ИФА. [c.64]

Возможность применения ферментов в качестве метки в иммуно анализе обусловлена, прежде всего, их высокой каталитическо активностью, позволяющей с применением соответствующих суб стратных систем регистрировать ферменты в растворе на уррвн( 10-15 д ниже. Благодаря широкому развитию методов энзимоло ГИИ принципиально решена проблема введения ферментной метки I молекулы антигенов и антител, что позволяет в настоящий момент легко осуществить связывание молекул ферментов с другими соеди нениями с целью получения соответствующих конъюгатов. [c.78]

ИФА, основанный на использовании антител против активного центра фермента. При использовании сывороточного альбумина человека как модельного антигена разработан гомогенный ИФА, основанный на конкурентном связывании с конъюгатом фермент — антиген двух типов антител специфических антител против определяемого антигена и антител против фермента, вызывающих при связывании полную потерю его каталитической активности. Вследствие стерических затруднений связывание с конъюгатом антител против антигена приводит к потере способности взаимодействия антител второй специфичности с ферментом. В присутствии определяемого антигена доля специфических антител, вязанных с конъю- [c.117]

ЛИТЬ по образованию продуктов катализируемой им реакции. Большинство используемых ферментных меток способно за 1 мин при обычных температуре и давлении превращать в продукты 10 молекул субстрата в расчете на одну молекулу фермента. Каталитическая эффективность фермента сильно зависит от его трехмерной структуры (конформации), Пространственная структура фермента, как и любого белка, поддерживается многочисленными нековалентными взаимодействиями, такими, как гидрофобные и водородные связи, ионные контакты, а также ковалентными дисульфидными связями. Трехмерная структура фермента обеспечивает близкое соседство определенных аминокислотных остатков в положениях, наиболее выгодных для осуществления катализа. Нековалентные химические связи непрочны и легко разрушаются или ослабляются под влиянием тепловой энергии или дополнительных нековалентных взаимодействий, возникающих, например, при связывании ионов, хао-тропных агентов, детергентов, липидов и т. д. Известно, что присоединение к ферменту другой молекулы (скажем, аллосте-рического эффектора) в области, удаленной от активного центра (т. е. каталитического центра), может вызвать конформацион-ную перестройку, изменяющую пространственное расположение аминокислотных остатков в этом центре. Изменения в некова- лентных взаимодействиях, приводящие к новой, необычной конформации фермента, способны существенно повлиять на каталитическую активность. Подобная конформационная гибкость становится одной из помех при использовании фермента в качестве метки. Однако эта же гибкость полезна для разработки иммуноферментного анализа без разделения компонентов, основанного на вызываемых антителами изменениях в конформации конъюгата [лиганд — фермент]. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в их молекулах многочисленных функциональных групп (аминогрупп, сульфгидрильных, карбоксильных, карбамоильных, остатков тирозина), через которые можно ковалентно присоединять молекулы лигандов. [c.12]

Вероятно, антитела против ДНФ не допускают присоединения FAD к ДНФ—АпоГО с получением активного голофермента вследствие ограничения подвижности, мешающего полипеп-тидной цепи ДНФ—АпоГО свернуться в каталитически активную конформацию. ДНФ-аминокапроновая кислота устраняет ингибирующее действие антител на рекомбинацию ДНФ— АпоГО и FAD с образованием активного фермента. [c.19]

В этой главе мы рассмотрели новый метод иммуноферментного анализа без разделения компонентов. Этот метод, названный ИФАКО, основан на способности специфических антител против лиганда ограничивать конформационную гибкость связанного с лигандом белка. В условиях ограниченной подвижности белок не может свернуться в каталитически активную конформацию. [c.101]

Как следует из вышеприведенной схемы получения абзимов, иммунизация экспериментальных животных является основным этапом, определяющим их специфичность. В настоящее время разработаны методы иммунизации, которые позволяют получать каталитические антитела, реализующие механизмы кислотного, основного или ковалентного катализа. Так, использование для иммунизации гаптенов, содержащих положительно заряженные группы, например четвертичные амины, как правило, сопровождается включением в активный центр абзима отрицательно заряженных аминокислотных остатков (Glu, Asp), а для гаптенов с отрицательно заряженными группами наблюдается обратная картина [285]. Иммунизация гаптенами, которые ковалентно взаимодействуют с аминокислотными остатками центра связывания антител, приводит к образованию каталитических антител, содержащих в активном центре нуклеофильные аминокислотные остатки (Lys, Ser), которые участвуют в реакциях ковалентного катализа [286]. Такая схема иммунизации позволяет получать абзимы, осуществляющие специфический гидролиз ароматических эфиров [287]. [c.430]

Все три метода анализа, описанные в этой главе, основаны на сильных взаимодействиях между антителами и полимерным субстратом. Нативные антитела почти не заряжены и при свя зывании с антигеном, меченным с помощью фермента, иигиби-руют каталитическую активность за счет блокирования контактов с высокомолекулярным субстратом. Как и следовало ожидать, увеличение размеров макромолекулярного субстрата а также присоединение к антителам вторых антител (антним-муноглобулинов) усиливают ингибирование ( r6wl е а ., 1980). [c.113]

Многие свойства ферментных меток исключительно ценны для иммуноанализа в лабораторных условиях, однако нелабораторные методы предъявляют более жесткие требования. Ферментам присущи ограниченная термостабильность, зависимость катализа от времени и температуры, чувствительность к помехам со стороны образца. В лабораторных методах для преодоления этих недостатков применяют ячейки с регулируемой температурой, точно измеряют время и предварительно обрабатывают образцы. Чтобы упростить использование индикаторных полосок, мы создали систему внутреннего стандарта, в которой компенсируются изменения каталитической активности. Эта система, состоящая из совместно иммобилизованных глюкозооксидазы и антител против пероксидазы, отличается от индикаторной полоски для определения морфия только специфичностьк антител. Поэтому можно ожидать, что цветные реакции на обеих поверхностях в одинаковой степени зависят от температуры активности фермента и от помех со стороны образца. [c.137]

Во многих случаях показано, что увеличение размеров макромолекул белков путем сшивания повышает их биологическую активность. Так, сшивание агглютинина бобов сои в высокомолекулярный полибелок глутаровым диальдегидом вызывает 100—200-кратное увеличение гемагглютинирующей активности на эритроцитах человека [142]. Митогенная активность одного из гемагглютининов оказалась в несколько раз выше для тетрамерных макромолекул, чем для димерных [143]. По-лимеризованный глутаровым диальдегидом антиген Е пыльцы крестовника более антигенен, чем мономерный белок [144]. Сродство протаминов, имеющих поликатионный характер, к клеточной поверхности повышается при их полимеризации с помощью водорастворимого карбодиимида [145]. Параллельно этому растет и противоопухолевая активность, что вообще характерно для поликатионов. Для других ферментов, например для урокиназы, при гомо- или гетероолигомеризации сохраняется до 100 % каталитической активности в широком интервале молекулярных масс [146]. С ростом М увеличивается стабильность конъюгатов урокиназы, которые длительно циркулируют в кровяном русле и более активны при лечении кровоизлияний у животных, чем исходный фермент. Образование конъюгатов, которые имеют большое число детерминантных групп и способны к множественному взаимодействию с поверхностью клетки, может приводить к увеличению их захвата клетками разных типов. Это показано на примерах сшитой рибонуклеазы [147] и сшитых антител [148]. [c.201]

Инструктивная теория предсказывала, что если молекула антитела будет развернута (денатурирована), а затем вновь свернется (ренатурируется), то ее специфичность будет утрачена. Этому предсказанию противоречили экспериментальные данные по ренату-рации рибонуклеазы, полученные в лаборатории Христиана Анфинсена ( hristian Anfmsen). Вспомним, что денатурированная рибонуклеаза спонтанно восстанавливает исходную трехмерную структуру, специфичность и каталитическую активность после удаления денатурирующего агента (разд. 2.12). Для ренатурации присутствие субстрата не требуется. Этот принципиально важный факт относительно рибону- [c.240]

Для некоторых гаптенов (тироксин и трийодтиронин) оказалось, что их ковалентное связывание с ферментом приводит к полному падению его каталитической актйвности, обусловленному относительной подвижностью находящегося в непосредственной близости от активного центра фермента гаптена и возможным ингибирующим его действием на связывание субстрата. В свободном состоянии конъюгат неактивен, но его связывание с антителами приводит к реактивации фермента и степень реактивации однозначно связана с концентрацией определяемого гаптена в растворе. [c.117]

Исследования показали, что конъюгаты на основе ацетаткина-зы и аденилаткиназы практически полностью утрачивают ферментативную активность, в то время как пируваткиназа, ковалентно связанная с антителами, сохраняет каталитические свойства., [c.131]

Создание нового активного центра в молекуле тиоредоксина. Недавно при использовании в качестве исходной молекулы инертного белка тиоредоксина после проведения предварительного компьютерного дизайна удалось внедрить в его полипептид-ную цепь новый активный центр, способный осуществлять гидролиз активированных эфиров [10]. В этом случае для решения проблемы были использованы знания, накопленные при исследовании механизмов функционирования каталитических антител (абзимов). Была создана серия виртуальных модифицированных молекул тиоредоксина с минимальной общей свободной энергией. Требуемое высокоэнергетическое состояние конкретных молекулярных участников реакции моделировали с помощью боковых цепей аминокислотных остатков, ориентированных в пространстве с целью создания условий, необходимых для осуществления катализа (реакция а). На рисунке справа (б) изображена схе- [c.282]

В 1986 г. двумя группами исследователей, руководимых P.A. Лернером и П.Г. Шультцем, было показано, что молекулы антител могут обладать ферментативной активностью [273, 274]. С этого времени берет начало новое направление белковой инженерии по искусственному конструированию ферментов на основе полипептидных цепей иммуноглобулинов, которые получили название каталитических антител или абзимов. Более того, вскоре после этого открытия в организме человека были обнаружены абзимы, появление которых ассоциировано с некоторыми распространенными заболеваниями. Результаты данных исследований еще раз подчеркивают плодотворность рационального подхода к решению проблем белковой инженерии, который по мере углубления знаний о механизмах функционирования белковых молекул, несомненно, станет доминирующим. [c.427]

Принципы получения каталитических антител и их ферментативная активность. Современные представления о механизмах ферментативного катализа основываются на теории переходного состояния, главные положения которой были сформулированы Л. Полингом [99], а в термодинамических терминах - М. По-лани в 1920-х гг. В соответствии с этой концепцией образование фермент-субстратного комплекса сопровождается конформаци-онными и структурными перестройками субстрата, значительно понижающими энергетический барьер, который необходимо преодолеть для превращения субстрата в продукт реакции. Такое временное нестабильное состояние субстрата в фермент-субст-ратном комплексе получило название переходного состояния. Исходя из этих представлений, можно заключить, что активные центры ферментов в ходе эволюции были сформированы таким образом, чтобы обеспечивать не только связывание субстратов, но и их фиксацию в промежуточном активированном - переходном - состоянии. В настоящее время установлена структура многих субстратов в переходном состоянии и осуществлен химический синтез их стабильных аналогов (transition state analogue -TSA), которые активно используются для получения эффективных ингибиторов ферментов. [c.427]

Все приведенные примеры каталитических антител, как природных, так и получаемых с помощью белковой инженерии, не являются исчерпывающими и лишь иллюстрируют эту активно развивающуюся область исследований. Полную информацию по данному кругу вопросов можно, в частности, получить из обзоров, недавно опубликованных в ноябрьском номере J. Immunol. Methods за 2002 г., который целиком посвящен абзимам. Сколько же потенциальных ферментативных активностей заключено во всей популяции антител одного индивидуума, репертуар которых практически безграничен благодаря запрограммированному процессу соматического мутагенеза Насколько общим явлением могут быть побочные ферментативные активности белков, возникающие в результате соматических мутаций в живом организме Попытка дать ответ на эти вопросы будет предпринята ниже в разделе о ксенобиозе. [c.433]

Предполагаемся, что многие ферменты в отсутствие субстратов находятся в неактивном состоянии и что функциональные группы их активных центров не ориентированы в пространстве надлежащим образом для взаимодействия с комплементарными группами субстрата. Однако при связывании специфического субстрата происходит такое конформационное изменение фермента и, следовательно, его активного центра, в результате которого соответствующие К-группы центра занимают необходимое для взаимодействия с субстратом положение это обеспечивает осуществ- ление каталитического процесса. Такие индуцированные субстратом конформационные изменения называют индуцированным со--ответствием его иллюстрирует схема, приведенная на рис. 8.8. Убедительные данные, свидетельствующие о конформационных изменениях щ)и связывании субстрата, основаны главным образом иа сравнении структур фермента, полученных методом рентгеноструктурного анализа, в присутствии и в отсутствие ингибиторов. В качестве примера можно указать на соответствующие данные для карбоксипептидазы (разд. 9.3.4) и лизоцима (разд. 9.3.3). Кроме того, ряд свойств ферментов, находящихся в растворенном состоянии, указывает на различие их конформации в присутствии и в отсутствие субстратов. Например, некоторые ферменты в присутствии субстратов утрачивают способность взаимодействовать со специфическими антителами многие ферменты в присутствии специфических субстратов оказываются более стабильными в отношении тепловой денатурации, у них изменяются показатели оптического вращения, они перестают диссоциировать на субъедини-ды у некоторых ферментов изменяются седиментационные характеристики. Принято считать, что в результате индуцированного со- ответствия может увеличиваться скорость некоторых ферментативных реакций однако обусловленное этим механизмом увеличение скорости, вероятно, относительно невелико по сравнению с соответствующими эффектами, обусловленными другими механизмами. [c.288]