Выделение, очистка и определение активности ферментов

III. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ [c.216]

Обнаружение, выделение, очистка и изучение свойств фермента зависят прежде всего от наличия достаточно точного и быстрого метода определения активности фермента, а также подходящего метода определения общего белка. Точное определение активности фермента на ранних стадиях очистки часто бывает сопряжено со значительными трудностями, поскольку посторонние ферменты, присутствующие в препарате, могут конкурентно действовать на субстрат. Например, в присутствии АТФ-азы затруднено определение АТФ-зависимых синтетаз, а присутствие р-амилазы мешает определению а-амилазы. Многих трудностей, связанных, например, с подавлением активности продуктами реакции, инактивацией фермента и изменением степени его насыщения субстратом, можно избежать, если измерять начальные скорости реакции. [c.98]

Контроль за выделением и очисткой ферментов на отдельных стадиях проводится с помощью определения активности фермента различными методами. [c.201]

В последнее время получило достаточно широкое распространение применение иммобилизованных клеток микроорганизмов, содержащих естественный набор ферментов. Преимущества их по сравнению с иммобилизованными ферментами заключаются главным образом в том, что при использовании иммобилизованных клеток отпадают стадии выделения, очистки и иммобилизации ферментов, которые, как правило, являются наиболее дорогостоящими при осуществлении полного технологического процесса. Далее, ферменты в микроорганизме находятся в наиболее естественном окружении, что положительно сказывается на их термостабильности, а также так называемой операционной стабильности (продолжительности работы в условиях опыта). Известно много примеров, когда после выделения из организма ферменты быстро теряли активность, а иногда их вообще не удавалось выделить в активной форме, в составе же клеток микроорганизмов они сохраняли каталитические свойства достаточно долго. В этих случаях применение целых клеток, а не отдельных ферментов становится единственно приемлемым вариантом. Наконец, иммобилизованные клетки, как и иммобилизованные ферменты, представляют собой гетерогенные биокатализаторы со всеми преимуществами их использования в технологических целях. Иммобилизация клеток обычно проводится их адсорбцией на водонерастворимых носителях (часто на ионообменных смолах), ковалентной сшивкой с помощью бифункциональных реагентов (например, глутарового альдегида) или захвата их в полимер, как правило, с последующим формованием в виде частиц определенного размера и конфигурации. Иммобилизация целых клеток микроорганизмов предотвращает их размножение и обычно увеличивает сохранность и срок работы в качестве катализатора по сравнению с необработанными клетками. [c.12]

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА, СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ [c.117]

Ход выделения и очистки ферментных белков контролируется чаще всего по двум основным показателям определению активности и определению количества белка в системе. Иными словами, за ходом очистки следят по возрастанию удельной активности материала, которое выражается числом единиц фермента в 1 мг белка. Кроме того, на каждом этапе определяют общую (сум- [c.138]

Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых разных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение таких методов часто позволяет получить наибольшую степень очистки белков, что в случае фе рментов означает максимально возможное повышение их удельной активности. Хотя колоночная хроматография служит идеальным способом оптимального разделения белков, не следует забывать и о методах адсорбции в объеме , так как это очень быстрые и потому весьма полезные методы, когда время имеет первостепенное значение (см. также гл. 7). Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники, фосфат кальция (в виде геля или в кристаллической форме) и разнообразные аффинные адсорбенты, созданные для ферментов определенных типов. Все эти вопросы вслед за общим введением в теорию адсорбционной хроматографии обсуждаются в данной главе применительно к выделению белков. [c.91]

При очистке ферментов и выделении их в кристаллическом состоянии сила их действия, естественно, увеличивается. Активность фермента, или единицу фермента, определяют как то количество его, которое при заданных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту. Микромоль — это одна миллионная часть веса грамм-молекулы вещества. Активность фермента или его удельная активность выражается числом единиц фермента на 1лг белка молекулярная активность выражается числом единиц фермента на 1 микромоль фермента при оптимальной концентрации субстрата. Для сравнения относительной активности разных ферментов используют так называемое число оборотов оно выражается числом молей субстрата, превращаемого одним молем фермента за одну минуту при определенной температуре. Числа оборотов варьируют в пределах приблизительно от 10 ООО до 5 ООО ООО самой высокой активностью обладает фермент ката-лаза. [c.332]

Активность при различных значениях pH. Для исследуемых пероксидаз проверена стабильность фермента при различных значениях pH. Для этого аликвоты фермента помещали в разные условия среды инкубации и через определенные промежутки времени измеряли пероксидазную активность (табл. 14). В опыте были использованы те значения pH, которые соответствовали буферным растворам, обычно применяемым в процессе выделения и очистки фермента. Данные табл. 14 показывают, что в кислой среде (pH 4, 6) активность фермента более высокая, но фермент менее стабилен. Так, спустя 8 сут от начала опыта при инкубации в этих условиях активность пероксидазы снизилась почти вдвое. [c.75]

Определение активности глюкозо-6-фосфатазы. Фракция микросом состоит в основном из фрагментов эндоплазматического ретикулума (ЭР), а также других типов внутриклеточных мембран. В результате того, что мембраны ЭР неоднородны по плотности, создаются препятствия полному разделению фракций. В связи с этим при выделении и очистке плазматических мембран наибольшие неприятности доставляют мембранные пузырьки, происходящие из ЭР. Они являются самой распространенной примесью, причем их маркерные ферменты не однозначны для разных тканей. [c.244]

Перед тем как приступить к выделению и очистке того или иного фермента, необходимо выбрать удовлетворительный тест для его идентификации и количественного определения. Прямые методы существуют лишь для очень ограниченного круга ферментов, поэтому используют способность ферментов катализировать специфическую реакцию. Чтобы иметь возможность контролировать степень очистки фермента, его активность относят на 1 мг общего белка (так называемая удельная активность ). [c.198]

Исключительно важное значение химия поверхности адсорбентов и носителей имеет в газовой и жидкостной хроматографии для анализа сложных смесей, препаративного выделения чистых веществ и управления технологическими процессами. Химия поверхности играет важную роль и в процессах, протекающих в биологических системах. К ним относится, в частности, взаимодействие биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов, с рецепторами — местами их фиксации в организме. Изучение модифицирования поверхности необходимо для решения вопросов совместимости искусственных материалов с биологическими. Химическое модифицирование адсорбентов применяется при разработке эффективных методов вывода из крови разного рода токсинов (гемосорбция). Прививка к поверхности крупнопористых адсорбентов и носителей соединений с определенными химическими свойствами необходима для иммобилизации ферментов, их хроматографического выделения и очистки, а также для иммобилизации клеток. Иммобилизованные ферменты и клетки эффективно используются в промышленном биокатализе, обеспечивая высокую избирательность сложных реакций в мягких условиях. Очистка и концентрирование вирусов гриппа, ящура, клещевого энцефалита и других для получения эффективных вакцин требует применения крупнопористых адсорбентов с химически модифицированной поверхностью. [c.6]

Раздел Энзимология рассчитан на студентов, уже иознакомиз-" шихся с некоторыми современными методами химии белка определением концентрации белка, хроматографией, электрофорезом и др. Основная цель его состоит в том, чтобы дать возможность студентам приобрести навыки экспериментальной работы, необходимые для начинающего энзимолога. В ходе практикума студенты осваивают методы выделения и очистки какого-либо фермента, а также изучают свойства полученного препарата. В связи с этим приводятся общие указания по работе с ферментами, способам их очистки, правилам определения каталитической активности и кинетических свойств. Во второй части раздела описываются методы выделения ферментов из пекарских дрожжей и животных тканей (скелетных мышц, печени). Поскольку современные методы очистки ферментов включают большое разнообразие приемов, в ряде случаев для получения одного и того же фермента дается описание 2—3 методик, которые могут быть использованы в соответствии с уровнем оснащенности лаборатории. Кроме того, для ферментов из разных источников приводятся различные методы выделения. [c.196]

Для селективного выделения и очистки биологически активных веществ, в частности ферментов, применяют биоснецифическую (афинную) хроматографию [17], основанную на специфических силах сродства, лежащих в основе биологической функции фермента, В качестве сорбента используют специальные нерастворимые лиганды, которые избирательно связывают только определенные ферменты. Связь между молекулой фермента и лигандом осуществляется за счет нековалентных связей. Многосторонний контакт между молекулами фермента и лиганда, приводящий к высокой избирательности сорбции, обеспечивается определенным пространственным расположением функциональных групп фермента, связанным с его уникальной геометрической структурой, при этом имеет место соединение типа ключ — замок . [c.15]

Особое значение имеет также задача правильного определения активности целлюлазы. От правильности этого определения зависит оценка действия фермента, способов его выделения и очистки, свойств отдельных препаратов и т. д. Главное затруднение в анализе состоит в том, что субстрат (целлюлоза) является веществом нерастворимым. При использовании его в качестве тест-субстрата, для точных сопоставлений, главная задача — получение определенного, стандартного материала. Например, при действии фермента на порошок целлюлозы, набухшей в кислоте, ее растворяется около 88%. Если же порошок не был подвергнут обработке кислотой, то даже при гораздо более длительном воздействии фермента растворяется только 11 /о материала. [c.266]

Отсутствие специфичности к основанию, а также постоянство отношения активности фермента к фенилаланиновым производным АМФ и УМФ на всех стадиях очистки при выделении фермента [44] свидетельствуют о том, что фосфоамидаза является одним ферментом, воздействующим на различные нуклеотидоаминокислоты, а не смесью ферментов, каждый из которых гидролизует производные какого-либо определенного мононуклеотида. [c.378]

Обычно уже на первых этапах поиска и выделения амидгидролазы, ее удается отнести к груше протеаз или к груше амидаз. С этим связан тип субстрата, используемого для тестирования активности фермента в ходе выделения и очистки. Если речь идет о протеазе, то дальнейшей ее характеристикой является определение позиционной специфичности, т.е. отнесение ее к груше экзо- или эндопептидаз. В большинстве случаев здесь не возникает принцишальных трудностей, поскольку активность экзоферментов обычно на несколько порядков ниже к субстратам эндопептидаз, чем к субстратам, содержащим незащищенные К-или С-концевые аминокислотные остатки. Однако необходимо отметить, что было выделено несколько протеаз, обладающих как экзо-, так и эндопептидазной активностью (см. ниже). [c.160]

Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соеди-ненцй. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их РаЬ-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий. [c.101]

Для того чтобы исследовать метаболизм углерода, транспорт метаболитов в хлоропластах и компартментацию ферментов в клетке (чему посвящена большая часть этой книги), необходимо прежде всего получить изолированные хлоропласты, которые при этом должны быть интактными, в достаточной степени очищенными от других субклеточных структур и биохимически активными. В некоторых случаях требуется очеиь высокая степень очистки хлоропластов (иапример, для установления локализации тех ферментов, которые присутствуют только в очень небольших количествах), поэтому может оказаться, что гораздо вал<иее освободиться от каких бы то ни было примесей н загрязнений, чем получить хлоропласты, способные осуществлять фотосинтез с очень высокой скоростью. При других обстоятельствах можно поступиться степенью очистки ради сохранения максимального уровня активности, ио наличие примеси цитоплазматических ферментов в препарате может очень усложнить интерпретацию полученных результатов (гл. 8). К тому же важно ие забывать два обстоятельства, которые часто упускают из виду, несмотря на то что это само собой разумеется. Во-первых, абсолютно невозможно получить хорошие хлоропласты из плохого исходного материала (см. разд. А.З). Во-вторых, хорошие хлоропласты будут работать хорошо только тогда, когда с ними будут правильно обращаться. Если оглянуться назад, то станет совершенно ясно, что после того, как в начале 60-х годов в практику были снова введены приемы Хилла, использовавшего в качестве осмотически активного вещества сахара, в плане улучшения методики выделения хлоропластов было сделано очеиь мало, если, конечно, ие считать предварительного получения протопластов (см. разд. А.5). Все последующие улучшения методики, способствующие получению более активных хлоропластов, касались главным образом методики определения активности, и в частности были связаны с введением в среду неорганического пирофосфата (разд. 8.14). [c.543]

В области препаративной биохимии рестриктаз практически, только в случае выделения гомогенных препаратов этих ферментов описание схем очистки сопровождается количественными данными, позволяющими оценить эффективность отдельных стадий и выход целевого продукта. Приложение усилий для получения таких сведений в определенной степени диктуется и необходимостью подбора эффективных стадий, обеспечивающих получение необходимых количеств гомогенных препаратов рестриктаз. Однако, при оценке схем их получения в целом следует отметить, что в связи с присутствием в бесклеточных экстрактах неспецифических нуклеаз количественное определение активности целевых ферментов во многих случаях оказалось возможным проводить только после частичной их очистки. Это исключает возможность оценки эффективности первых стадий и всей схемы в целом. Тем не менее наличие количественных данных последующих стадиях очистки является полезной информацией, позволяющей оценивать эффективность сорбентов. [c.163]

В практике очистки сточных вод для характеристики напряженности окисления применяют определение дегидрогеназной активности микроорганизмов. Процесс биологического окисления, схематично показанный реакциями (4.140) и (4.141), состоит из множества ступеней и начинается с расщепления органического вещества с выделением активного водорода. Этот вид окисления называется непрямым. Водород передается ферментами дегидрогеназами на цитохромную систему дыхательной цепи ферментов, где соединяется с кислородом, образуя воду (частично перекись водорода). Количественное определение ферментов дегидрогеназ в ряде случаев позволяет получать быструю характеристику условий процесса и его особенностей и используется в качестве одного из технологических параметров управления процессом. [c.333]

Пеи -Ангиотензины 1 и II. Ъ первых работах по выделению и очистке ангиотензина I этот гормон не удалось получить в чистом виде [438, 495, 986, 1165, 1305, 1735, 1736, 2131]. Позднее Скеггс и сотр. [2136] показали, что в определенных условиях образуются два вещества, обладающие прессорной активностью,— Пеи -ангиотензины I и И, а для превращения Пеи -ангиотензина I в Пеи -ангиотензин П необходим особый фермент, так называемый ангиотензин-конвертирующий фермент. Скеггсу и сотр. [2132] удалось выделить этот фермент в сравнительно чистом состоянии из плазмы лошади фракционированием с помощью сульфата аммония и осаждением в изоэлектриче-ской точке. Высказанное Хелмером [987] предположение о том, что ярко выраженной способностью сужать кровеносные сосуды обладает только Пеи -ангиотензин Н, а Пец -ангиотензин I совершенно лишен таких свойств, было подтверждено методом перфузии на почках крысы. Следовательно, прессорная активность Пеи -ангиотензина I, наблюдавшаяся при внутривенном введении последнего животным, обусловлена его быстрым превращением в Пеи -ангиотензин П. [c.36]