Очистка вируса центрифугированием в градиенте

Очистка вируса центрифугированием в градиенте плотности [c.186]

Препараты пикорнавирусов, полученные из культур тканей, контаминированы клеточными компонентами, в том числе мембранами, и если вирус предполагается использовать для антигенного или биохимического анализа, его необходимо очистить. При этом, как правило, используют тот или иной метод центрифугирования в градиенте плотности. Если работа ведется со значительными количествами вируса, очистке обычно предшествует концентрирование, например осаждение вируса сульфатом [c.57]

Второй метод очистки вируса центрифугированием в градиенте представляет собой упрощенный вариант метода Смита и др. [5]. В этом случае опускают стадию центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы, на которой не достигается существенной очистки вируса, а вирус фракционируют непосредственно в преформированном градиенте плотности s l. [c.206]

Наиболее приемлемым методом очистки вирусов этой группы является центрифугирование в градиенте плотности сахарозы и цитрата калия. Применявшиеся ранее такие методы, как дифференциальное центрифугирование, [c.12]

Этот метод нашел особенно широкое применение при разделении вирусов с различным содержанием нуклеиновых кислот, а также при изучении свойств нуклеиновых кислот (см. гл. IV, разд. В). Центрифугирование В градиенте плотности оказалось весьма ценным методом очистки и разделения некоторых вирусов. [c.37]

Обычно пикорнавирусы очищают центрифугированием в градиенте плотности (хотя применялась и гель-фильтрация, в том числе в промышленных масштабах), В связи с малыми размерами пикорнавирусы имеют коэффициент седиментации 150— 160 5, меньший, чем у большинства других вирусов. Однако благодаря отсутствию липидов и исключительно компактной структуре они имеют высокую плавучую плотность (около 1,34 г/см в градиенте плотности хлористого цезия однако см. ниже разд. 5.3.3). В градиентах концентрации сахарозы такая плотность не достигается. Поэтому при очистке применяется разделение в сахарозных градиентах по скорости седиментации или разделение по плавучей плотности в градиентах хлорида или сульфата цезия. [c.59]

Данный метод очистки пикорнавирусов в градиентах концентрации сахарозы не требует много времени и существенных материальных затрат и мало сказывается на свойствах вирусов (см. ниже). Однако при этом препараты вирусов могут содержать некоторые контаминанты. Если требуется исключительно высокая степень очистки, может возникнуть необходимость в дополнительном центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия. Как правило, это необязательно можно осадить вирус для удаления сахарозы (разд. 5.2.3). [c.61]

Бракк (Вгакке) использовал центрифугирование в градиенте плотности сахарозы для очистки вирусов растений [c.211]

На третьем (и последнем) этапе очистки рабдовирусов отделяют стандартные инфекционные вирионы от ДИЧ, которые могут присутствовать в составе вирусного потомства. Разделение достигается центрифугированием вирусного препарата в линейном градиенте концентрации сахарозы благодаря раа-личию коэффициентов седиментации инфекционных вирионов и ДИЧ. Седиментация вируса в градиенте концентрации сахарозы обычно сопровождается снижением инфекционности в 2— [c.126]

Для очистки аденовирусов обычно используют комбинированный метод, состоящий из экстракции вируса из клетки дезоксихолатом натрия, обработки нуклеазами и фреоном 113 и равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия [855], Иногда применяют метод изоэлектрической преципитации, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и сефадексе Г 200 и метод двухфазных полимерных систем. При дифференциальном центрифугировании происходят большие потери вируса, по-видимому, вследствие его агрегации. [c.11]

Материал, полученный одним из описанных выше методов, обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна (например, для постановки RIA или ELISA), его можно использовать уже на этой стадии. Тем не менее для большинства исследований необходима дальнейшая очистка вируса с помощью зонально-скоростного или изопикнического центрифугирования в градиенте. При скоростном центрифугировании положение вируса в градиенте определяется его коэффициентом седиментации, а при изопикническом — плавучей плотностью. Для достижения максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей изменение концентрации образующего градиент вещества должно быть плавным в то же время на промежуточных стадиях очистки нередко используют ступенчатые градиенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопикнического центрифугирования совмещаются примером может служить использование градиентов глицерина — тартрата калия [14]. В таких градиентах концентрация тартрата калия возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности, соответствующей плавучей плотности вируса концентрация глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятствует продвижению медленно седиментирующего материала в направлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или вертикальных роторах с помощью приспособлений для медленного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса часто приходится проводить целую серию последовательных стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы добиться нужной степени очистки. [c.100]

Видимую простым глазом зону вируса извлекают из градиента, прокалывая пробирку сбоку, и проводят дальнейшую очистку вируса повторным центрифугированием в более крутом градиенте концентрации сахарозы (например, 20—60%, вес на объем). [c.129]

Разработаны многочисленные методы очистки вирусов гриппа из аллантоисной жидкости или из культуральной среды. Выбор конкретного метода определяется требуемой степенью чистоты. Чистоту полученного вируса можно установить с помощью электрофореза вирионных белков в полиакриламидном геле (рис. 6.5), но, как и в случае всех оболочечных вирусов, почкующихся через плазматическую мембрану, даже при самой тщательной очистке невозможно избежать контаминации вируса клеточными белками. Кроме того, вирус может быть плео-морфным, что осложняет его очистку центрифугированием в градиентах плотности. Тем не менее при работе с вирусами, дающими высокий титр в культуре клеток или куриных эмбрионах, удается получить препараты, степень контаминации которых клеточными белками незначительна. На первой стадии очистки из содержащей вирус аллантоисной жидкости или культуральной среды удаляют клеточный дебрис с помощью низкоскоростного центрифугирования (10 мин при 2000—10 000 д). Все стадии следует проводить при 0°С, чтобы свести к минимуму потери инфекционности и протеолиз вирионных белков. [c.181]

Чтобы пометить вирусную РНК [ Н]-уридином, клетки инкубируют в течение ночи со средой без сыворотки, заражают по стандартной методике, затем добавляют 0,1 мКи/мл [ Н]-ури-дина в той же среде. Содержащую вирус среду собирают через 24 ч после заражения. Если в используемых клетках вирус размножается до высокого титра, то при очистке градиентным центрифугированием вирус, полученный, например, с одной чашки диаметром 10 см, в градиенте объемом 12 мл должен образовать видимую простым глазом зону. Если же выход вируса низок, в параллельном градиенте центрифугируют большее количество немеченого вируса и отбирают из градиента, содержащего радиоактивный материал, соответствующие фракции. Иногда раскапывают весь градиент и определяют радиоактивность в каждой фракции. [c.195]

Такие роторы находят большое промышленное применение. Так, с помощью роторов типа К можно выделить препараты вируса гриппа, в 10 раз превосходящие по степени очистки те препараты вируса, которые удавалось выделить применением обычного центрифугирования. В роторе Андерсона производится и разделение по плотности. При этом для образования градиентов плотности используют либо растворы сахарозы, либо в титановых роторах растворы хлористого цезия. [c.189]

После того как зараженная клеточная культура подвергается дифференциальному центрифугированию или какой-либо другой процедуре фракционирования, необходимо идентифицировать фракции, содержащие нужный материал. При необходимости можно использовать методы, описанные в разд. 4.1 и 4.2, но они требуют довольно много времени альтернативные подходы состоят в том, что во фракциях градиента по поглощению в ультрафиолете идентифицируют пики РНК или белка. или же в материал, подвергаемый очистке, включают в качестве маркера радиоактивно меченный вирус. Затем в аликвотах из каждой фракции любым стандартным методом (например, с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика) можно определить радиоактивность. Если есть возможность получить радиоактивно меченный материал, данный метод очень удобен, поскольку он занимает мало времени, точен и прост в исполнении. [c.57]

Дальнейщую очистку вируса проводят повторным центрифугированием в градиенте. Применяют либо зональное центрифугирование в 15—60%-НОМ градиенте концентрации сахарозы, либо, предпочтительно, изопикническое центрифугирование в 20—45%-НОМ (вес на объем) градиенте плотности тартрата калия. [c.186]

Предложено два альтернативных метода очистки вируса. Стандартный метод Смита и др. [5] включает стадии зонального центрифугирования вируса в градиенте концентрации сахарозы я последующего изопикнического центрифугирования в градиенте плотности s l. [c.206]

При очистке этим методом сконцентрированный вирус сначала подвергают зональному центрифугированию в 15— 60%-ном (вес на объем) градиенте концентрации сахарозы в NTE. [c.186]

Очистку вирусов этой группы обычно проводят осаждением сульфатом аммония или метанолом, обработкой нуклеазами, органическими растворителями и центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Из зараженной клетки вирус можно извлекать рецепторраз-рушающим энзимом и дезоксихолатом натрия, [c.10]

Потенциально фоточувствительные вирусы, такие, как миксовирусы, нужно защищать от света. Что касается рН-стабильности, то вирусы обычно наиболее стабильны от слабощелочных значений pH до их изоэлектрических точек. Для большинства вирусов наиболее оптимальны значения pH 6,7—7,6, Следует также избегать образования пены и гидродинамических воздействий, особенно в случае высокоочищенных препаратов вирусов. При длительных процедурах очистки, таких, как электрофорез и равновесное центрифугирование в градиенте плотности солей тяжелых металлов, необходимо к вирусной суспензии добавлять стабилизирующие коллоиды. Обычно добавляют очищенный альбумин сыворотки крови до концентрации 0,02% [272, 520] иди обезжиренную и лишенную комплемента сыворотку крови в концентрации 0,2% [268]. Также нужно избегать неблагоприятной концентрации ионов в окружающей вирус среде. Чтобы не произошла преципитация вируса, буферный раствор должен иметь значение pH, достаточно отличающееся от его изоэлектрической точки. На первых стадиях очистки нужно использовать буферы очень слабой ионной силы. Например, 0,01 М фосфатный буфер и 0,01 М цистеин при pH 7,0 более выгоден, чем буферы с высокой ионной силой. При работе с лабильными вирусами (вирус саркомы Рауса) хорошие результаты дает применение 0,02 М цитратного натриевого буфера (pH 6,7). В процессе очистки должна быть совершенно исключена бактериальная и грибковая контаминация при помощи тщательной стерильной обработки Это особенно важно, когда процесс концентрирования и очистки контролируется биологическим титрованием. Между отдельными стадиями очистки рост бактерий можно задержать снижением температуры, добавлением антибиотиков (100— 200 Ед/мл) или органических растворителей, например хлороформа в низких концентрациях. [c.30]

Поскольку вирусы довольно лабильны, для их очистки используют следующие методы дифференциальное центрифугирование, обработку нуклеазами, хроматографию па фосфате кальция и центрифугирование в градиенте плот-ности сахарозы, цитрата и тартрата калия и хлористого цезия. [c.12]

С этой точки зрения даже наиболее высокоочищенные препараты вирусов можно рассматривать как статистически гомогенные лишь в первом приближении. Тем не менее, прежде чем использовать препарат вируса для физико-химических, биохимических или биологических экспериментов, важно установить, по возможности более тщательно, степень этой гомогенности или гетерогенности. Большинство методов очистки вирусов можно использовать также и для определения гомогенности вируса. Если при равделении в градиенте концентраций сахарозы вирус образует одну-едииственную резко ограниченную полосу, можно считать, что по седиментационным свойствам исследуемый препарат более или менее гомогенен. Однако если очистку вируса проводят только путем повторных циклов градиентного центрифугирования в растворе сахарозы, каждый раз удаляя материал, седиментирующий быстрее или медленнее, чем вирус, то в этом случае равномерность скорости седиментации уже не может служить показателем гомогенности. Иными словами, только сочетая при очистке и (или) проверке на гомогенность самые разнообразные методы, основанные на разных принципах, можно быть уверенным, что мы действительно имеем дело с каким-то определенным типом гомогенных частиц. К таким разнообразным критериям относятся константа седиментации, [c.47]

Процесс формирования этого градиента и его анализ подобны вышеописанному методу центрифугирования в зо-нальцом градиенте. Равновесный зональный градиент был использован для очистки вируса краснухи [279, 520], крысиного вируса Килхэма [846], саркомы Рауса [690], лейкемии Раушера [254], лейкемии мышей Френда [444, 615], герпеса [606] и вируса Баркитта [306]. [c.62]

Для получения вирусй в йрейар ти ных количествах применяют центрифугирование в горизонтальных роторах препаративной центрифуги. После достижения равновесия содержимое анализируется аналогично тому, как это делается в опытах с равновесным зональным градиентом. В этом случае можно определить величину плавучей плотности с точностью до 0,01 г/мл при одновременной очистке вируса. При препаративном равновесном центрифугировании время может колебаться от 6 до 12 часов. [c.64]

Метод дифференциального центрифугирования для конденз ри рования и частичной очистки вирусных препаратов используется уже 30 лет. Недостатки этого метода были устранены Брекком [216], который ввел в 1951 г. метод зонального центрифугирования в градиенте сахарозы. В 1957 г. Мезельсон, Сталь и Виноград [565] разработали метод равновесного дентрифугарования в градиенте плотности, В настоящее время эти два метода являются наиболее совершенными методами очистки и фракционирования вирусов. [c.44]

Для очистки вирусов не обязательно всегда использовать равновесное центрифугирование в СамоустанавливаЮ щемся градиенте. Иногда выгоднее и экономичнее применять центрифугирование в преформированном градиенте. Степень очистки в этом градиенте соответствует очистке в равновесном градиенте. Но преформированный градиент не используется, если исследуемый вирус обладает гетерогенностью частиц которые имеют близкие плавучие плотности. В этом случае, чтобы получить в чистом виде каждую гетерогенную фракцию, необходимо многократно рецентрифугировать в самоустанавливающемся равновесном градиенте. [c.66]

Ультрацентрифугирование, по-видимому, самый расирост-раненный метод концентрирования, очистки и фракционирования вирусов. Превосходные препаративные ультра-центрифуги позволяют обрабатывать большие количества материала при низкой температуре. Этот метод относительно безвреден для многих вирусов, и его принципы хорошо изучены. Широко применяются оба метода — дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности. [c.55]

Равновесное центрифугирование в градиенте плотности солей тяжелых металлов широко применяется при очистке и фракционировании многих вирусов Этот метод был использован для очистки вируса ящура [179, 809], европейской чумы свиней [418], полиовирусов [502,657], E HO 349], риновирусов [252], реовирусов [322, 722], оспы 449], полиомы [854], герпеса [199], гриппа [181] Однако следует отметить, что равновесное центрифугирование в градиенте плотности s l не всегда применимо для очистки вирусов Это обусловлено прежде всего тем, что он оказывает инактивирующее действие на некоторые вирусы животных, в частности на вирусы лейкемии и некоторые миксовирусы [49, 690]. [c.68]

В заключение следует сказать, что методы градиентного центрифугирования наиболее совершенны из всех известных в настоящее время методов очистки вирусов. Причем для некоторых вирусов достигается абсолютная очистка. Относительная сложность методов градиентного центрифугирования не препятствует его широкому распространению в препаративной биохимии вирусов. Единственным ограничением пока является то, что очи щать мoяiнo лишь сравнительно небольшие объемы вирус-содержащего материала. Поэтому для увеличения выхода очищенного вируса желательна его предварительная концентрация. Но в последнее время разрабатываются методы препаративного фракционирования в равновесном и в зональном градиенте. Для препаративных целей стали использовать угловые роторы, объем которых значительно больше объема горизонтальных [319, 324], что делают этот [c.69]

Применение градиентного центрифугирования Кроме очистки и фракционирования вирусов, метод градиентного центрифугирования можно применять для решения различных проблем. Во многих исследованиях этот метод является уникальным и почти незаменимым. Для разработки схемы эксперимента по концентрированию и очистке вируса необходимо прежде всего знание величины ила-вучей плотности. Эту величину в определенной системе градиента вследствие постоянства и воспроизводимости применяют также ддя физико-химической характеристики вирусной частицы, что помогает при классифицировании вируса. Плавучая плотность вируса служит одним из [c.73]

Некоторые исследователи сообщают о потере инфек-ционности РНК при центрифугировании в сахарозном градиенте при нейтральном pH [280, 622]. В подобных случаях удобнее пользоваться градиентом плотности глицерина (10 30%). Понс [662] предположил, что сахароза содер жит следы рибонуклеазы, Френкель-Конрат и Сингер [330 действительно и ока за л и, что причиной потери инфекционности РНК вируса табачной мозаики при очистке в сахарозном градиенте является присутствие рибонуклеазы. Ддя подавления активности рибонуклеазы можно применять додецилсульфат натрия в концентрации 0,5% при [c.178]

Зональное центрифугирование лучше всего проводить в бакет-роторах или вертикальных роторах, чтобы избежать нежелательного взаимодействия материала со стенками пробирки. Линейные градиенты сахарозы (5—20%, вес на вес) готовят одним из стандартных методов (см. гл. 1, разд. 2.5.1) и сверху осторожно наслаивают раствор вируса. Поскольку при использовании данного метода отсутствует эффект концентрирования в результате образования зоны с соответствующей плавучей плотностью, объем образца не должен превышать 1/10 объема градиента. Центрифугирование следует проводить при 4°С. Время и скорость центрифугирования во многом зависят от геометрии используемого ротора, поэтому можно дать лишь самые приблизительные указания относительно режима. Первоначально используемый режим центрифугирования обычно приходится модифицировать после первых опытов с учетом полученных результатов. В бакет-роторе, например SW27, центрифугирование в течение 2 ч при 27 ООО об/мин позволяет получить достаточную степень очистки большинства тогавирусов. [c.101]

Получение вирусов из фракций градиентов. На последней стадии очистки необходимо удалить вещество, образующее градиент. На промежуточных стадиях обычно достаточно развести содержащие вирус фракции равным объемом буферного раствора, чтобы материал можно было непосредственно наносить на следующий изопикнический градиент. Поскольку для зонального центрифугирования объем образца должен быть небольшим, разведение фракций предыдущего градиента в этом случае, как правило, невозможно поэтому предпочтительно проводить зональное центрифугирование перед изопикническим, если используемая схема очистки включает оба варианта центрифугирования. Полного удаления вещества, образующего градиент, достигают диализом, гель-фильтрацией через колонку с сефадексом G-50 или разведением с последующим ультрацентрифугированием. Диализ очищенного материала проводят в нескольких сменах подходящего буферного раствора (например, GTNE, хотя в некоторых случаях для последующего использования очищенного вируса может потребоваться другой буфер). Колонку с сефадексом уравновешивают, пропуская через нее пятикратный по отношению к образцу объем того буферного раствора, в котором должен быть растворен очищенный вирус. Появление вируса в свободном объеме колонки при элюции регистрируют по поглощению в ультрафиолете или [c.103]

Здесь молекулярная масса фракционируемой ДНК доходила до 500 млн. (ДНК вируса G из Вас. megatherium, выделенная обработкой вируса горячим саркозилом с последующей очисткой центрифугированием в градиенте плотности раствора s l). Подробно описаны предосторожности, необхо имые при манипуляциях с такой ДНК во избежание ее разрыва под действием гидродинамических сил. [c.122]