Химотрипсин ингибитор

Влияние среды на гидрофобное взаимодействие активного центра химотрипсина с субстратами и ингибиторами. Исследование эффектов среды — это классический подход к изучению природы комплексообразования. В-приложении к химотрипсину результаты таких исследований подтвердили гидрофобный характер фермент-субстратных взаимодействий. [c.143]

Представление об активном центре химотрипсина как структуре, состоящей из пространственно и функционально разделенных участков (сорбционного и каталитического), в литературе сложилось раньше [102], чем появились рентгеновские данные о структуре кристаллического фермента. В этом сыграли важную роль исследования механизма действия ряда ингибиторов [16]. Использованные подходы могут оказаться весьма полезными при изучении структуры и функций активного центра Других ферментов. [c.147]

Электростатические взаимодействия вносят вклад в специфичность трипсина к остаткам Lys и Arg. Трипсин [244, 245, 536] связывает свои субстраты существенно тем же способом, что и химотрипсин. Однако трипсин специфичен к положительно заряженным остаткам субстрата боковая цепь Lys или Arg электростатически связывается с остатком аспарагиновой кислоты на дне связывающего кармана фермента. Кристаллографические исследования комплексов трипсина и белковых ингибиторов трипсина [269, 632] показали, что способ связывания очень сходен с образованием комплекса сериновая протеаза — субстрат. Очевидно, ингибитор точно-воспроизводит субстрат. Механизм, ведущий к расщеплению субстрата трипсином и к стабилизации комплекса трипсин — ингибитор-[269, 536], рассматривается в разд. 11.2. [c.248]

В литературе неоднократно подвергали сомнению способность алифатических соединений выступать в роли конкурентных ингибиторов реакций, катализируемых химотрипсином. Однако позднее было показано, что даже столь слабое липофильное соединение, каким является ацетопитрил, обнаруживает все-таки специфические свойства конкурентного ингибитора [89]. [c.142]

Л e в a Ш 0 в A. B. Исследование гидрофобного взаимодействия активного центра химотрипсина с конкурентными ингибиторами. Канд. дисс., МГУ, 1970. [c.168]

Обработкой данных табл. 18 в координатах Лайнуивера-Берка можно показать, что профлавин является конкурентным ингибитором а-химотрипсина. Однако зависимость в координатах (Кт(кяж), [I]) в данном случае является нелинейной (рис. 68), в отличие от простого конкурентного типа ингибирования. Одной из возможных причин подобной зависимости может быть связывание с активным центром фермента двух молекул конкурентного ингибитора [c.141]

Краситель эриохром черный Т является неполным неконкурентным ингибитором гидролиза этилового эфира М-ацетил-Ь-ти-роз ина, катализируемого а-химотрипсином (/<т(кан<)=7,58-Ю " М [c.153]

Так как для ингибирования а-химотрипсина эриохромом черным Т величина Кт(каж) не изменяется в присутствии ингибитора, то линеаризация экспериментальных данных в координатах [c.164]

При нековалентном связывании молекулы ингибитора активный центр а-химотрипсина претерпевает медленное обратимое [c.252]

В качестве конкретной системы можно исследовать комплекс а-химотрипсина с профлавином, который является ингибитором фермента. При уменьшении pH среды снижается связывание фермента в комплекс за счет конкурентной реакции с протонами [c.197]

Рис. 41. Влияние высоких концентраций субстрата (этилацетурат, ЭА) на сорбцию химотрипсином обратимого конкурентного ингибитора К-ацетил-В-триптофана а — отношение растворимостей ами-

В последние годы были предприняты успещные попытки прямого теоретического расчета кинетики конформационных переходов и усредненных флуктуаций в конкретных белках (М. Карплус). В качестве исходного состояния принимались положения атомов, определенные из данных рентгеноструктурного анализа. Далее рассчитывалась динамика смешения белка исходя из соответствующих значений атом-атомных потенциалов. Для панкреатического ингибитора химотрипсина расчет был выполнен с временным шагом с. Согласно расчету, смещение полипептидных цепей в 0,05 нм достигается уже за время порядка Ю с. Это значение заметно отличается от экспериментального значения 10 с, типичного для белков, -по-видимому, вследствие того, что теория не учитывает влияния среды на динамику макромолекулы. Были рассчитаны также средние отклонения положений ядер в цитохроме с. Для а-углеродных атомов основной цепи они составили 0,07 нм, для других тяжелых атомов 0,085 нм, для гемовой группы 0,051 нм. Эти расчеты подтверждают сделанный ранее теоретический вывод И.М. Лифшица о том, что при определенных условиях свободная полимерная цепь сворачивается в глобулу с плотным конденсированным ядром и рыхлой опушкой . Так, для цитохрома с при переходе от ядра с радиусом 0,6 нм к опушке радиусом 2,2 нм средние отклонения меняются от 0,066 до 0,164 нм. [c.557]

Изменяя структуру субстрата или ингибитора, можно определить, какие черты молекулы важны для связывания, и, следовательно, какие группы субстрата специфически связываются ферментом. Становится возможным, используя достаточное количество данных, представить себе геометрию центра связывания, предполагая его комплементарным структурам молекул субстрата или ингибитора, связывающихся наилучшим образом иными словами, вывести геометрию замка из формы ключа. Весьма детальные исследования такого рода в случае химотрипсина привели к формулированию требований ко всем четырем положениям, окружающим тетраэдрический а-углеродный атом аминокислотного остатка, атакуемого серином активного центра [97,98] заместители обозначены в соответствии с (58) . [c.511]

Основной трипсиновый ингибитор органов быка Двойной комплекс ингибитора Баумана — Бирка и химотрипсина Ингибиторы протеиназ широкой специфичности пз улитки (Helix pomatia) [c.337]

Рентгеновские исследования комплексов химотрипсина с субстратоподобными ингибиторами сыграли принципиальную роль в установлении структурных предпосылок каталитической функции его активного центра (см. 2 этой главы). Однако для выяснения динамических аспектов действия активного центра оказались особенно плодотворными подходы химической кинетики (см. 5,6 этой главы). Успехи кинетических исследований были во многом предопределены открытием М. Бергмана и Д. Фрутона и позднее Г. Нейрата и их сотрудников, которые установили, что химотрипсин способен гидролизовать не только сложные белковые молекулы, но также и простые низкомолекулярные синтетические субстраты (амиды, сложные эфиры и др.) [20]. [c.127]

Глобула химотрипсина содержит лишь один комплексующий центр, способный быстро и обратимо сорбировать углеводородные молекулы, — это активный центр фермента [73]. Гипотеза о существовании гидрофобной области в активном центре химотрипсина была выдвинута в начале 60-х годов на основании исследования ингибирующих свойств большого числа производных бензола, нафталина и других ароматических соединений [74—76]. Эта гипотеза находит подтверждение в том, что связывание с активным центром некоторых конкурентных ингибиторов, содержащих хромофорные группы, приводит к сдвигу их спектра в длиннойолновую область [77—79]. Анализируя величину спектрального сдвига, Кэллос и Эвейтис [80] пришли к выводу, что активный центр фермента по величине диэлектрической постоян- [c.138]

Это интересное явление еще не нашло достоверной физико-химической трактовки. Можно лишь полагать, что причины его заложены в том, что сложноорганизованный (микрогетерогенный) и относительно жесткий сорбционный участок активного центра в отличие от жидких экстракционно-адсорбционных моделей представляет собой (если рассматривать это явление в высшей степени формально) как бы щипцы , которые в результате гидрофобных взаимодействий ухватывают в молекуле ингибитора лишь ее гидрофобный остов, центральной группой которого является плоское ароматическое ядро. Эта гипотеза находит отражение в молекулярной модели активного центра, предложенной Блоу с сотр. [66] на основании результатов рентгеноструктурного анализа кристаллического химотрипсина (см. рис. 9). Как уже отмечалось, форма полости делает возможной лишь одну, строго определенную ориентацию плоскости ароматического кольца. [c.141]

Алифатические обратимые конкурентные ингибиторы. Как видно из рис. 37, сррбционный участок активного центра малоспецифичен по отношению к структуре алифатической цепи в молекуле ингибитора (алканолы). Независимо от того, является ли алифатическая цепь нормальной или разветвленной, эффективность обратимого связывания алканола КОН на активном центре определяется валовой гидрофобностью группы К. А именно, величина lg i, характеризующая прочность комплекса, возрастает линейно (с наклоном, близким к единице) со степенью распределения 1 Р этих соединений между водой и стандартной органической фазой (н-октанол). Наблюдаемая при этом величина инкремента свободной энергии переноса СНа-группы из воды в среду активного центра равна приблизительно —700 кал/моль (2,9 кДж/моль) (для низших членов гомологического ряда). Эта величина близка к значению инкремента свободной энергии, которое следует из известного в коллоидной химии правила Дюкло—Траубе [90—92] и характерна для свободной энергии перехода жидкой СНа-группы из воды в неводную (гидрофобную) среду [85]. Все это позволяет рассматривать гидрофобную область активного центра химотрипсина как каплю органического растворителя, расположенную в поверхностном слое белковой глобулы. Эта капля либо адсорбирует гидрофобный ингибитор из воды на поверхность раздела фаз, либо, будучи расположенной несколько углубленно, полностью экстрагирует его. С точки зрения микроскопической структуры гидрофобной области правильнее было бы рассматривать ее как фрагмент мицеллы, однако такая детализация представляется излишней, поскольку известно, что свободная энергия перехода н-алканов из воды в микроскопическую среду мицеллы додецилсульфата слабо отличается от свободной энергии выхода тех же соединений из воды в макроскопическую жидкую неполярную фазу [93].. [c.142]

З-образный характер зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в катализе химотрипсином. Изменение среды в результате добавки органических соединений также оказывает заметное влияние на эффективность сорбции на активном центре химотрипсина гидрофобных компонентов реакции. Причина этого заключается, как правило, в том, что органическая добавка, повышая растворимость субстрата (или субстратоподобного ингибитора) в воде, удерживает его в водном растворе и затрудняет тем самым [c.145]

Те же закономерности характеризуют также и кинетику гидролиза химотрипсином специфических аминокислотных субстратов как на стадии ацилирования, так деацилирования [21, 113]. Пространственное взаимоотношение сорбционной и каталитической областей в активном центре нашло отражение также и в эффективности комплексообразования с химотрипсином бифункциональных ингибиторов, алкил- и фенилалкилборных кислот [114, 115]. [c.150]

В согласии с механизмом (4.40) субстратоподобный ингибитор действительно вытесняет из активного центра несколько молекул воды, как это было обнаружено при рентгеноструктурном анализе кристаллического химотрипсина [123]. Однако этот механизм не согласуется с данными по влиянию среды на гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие (см. 4 этой главы). Кроме того, механизм (4.40) противоречит тому, что двойной выигрыш свободной энергии экстракции реализуется лишь в переходном состоянии химической реакции [см. уравнение (4.39)], в то время как в комплексе Михаэлиса вклад гидрофобного фермент-субстратного взаимодействия меньше [см. уравнение (4.29)]. Иными словами, в химотрипсиновом катализе не вся потенциальная свободная энергия сорбции, которую предполагает модель (4.40), равная 2АСэкстр, реализуется в виде прочного связывания субстрата с ферментом. Из диаграммы, представленной на рис. 44, видно, что в комплексе Михаэлиса (или ацилферменте) реализуется в виде свободной энергии связывания E-R лишь инкремент свободной энергии сорбции, отражающий перенос субстрата из воды в неводное окружение (в среду белковой глобулы), равный АО кстр [см. также уравнение (4.29)]. Для объяснения этих фактов следует допустить, что гидрофобное фермент-субстратное взаимодействие идет в две стадии 1) образование фермент-субстратного комплекса протекает по механизму (4.19), который не противоречит данным по солевому эффекту (на их основании он был и предложен), и термодинамические закономерности его согласуются с уравнением (4.29). Этот механизм также предполагает вытеснение нескольких молекул воды из [c.155]

Известно [17], что неконкурентное ингибирование ферментативной активности а-химотрипсина борной кислотой обусловлено взаимодействием ингибитора с имидазольной группой остатка гистидина-57 активного центра фермента. В табл. 20 приведены результаты совместного воздействия борной и н-гексилборной кислот на кинетику гидролиза анилидного субстрата, катализируемого а-химотрипсином [18]. Определить, принимает ли гистидин-57 активного центра фермента участие в связывании н-гексилборной кислоты. [c.97]

Рис. 52 Влияние двух взаимозави-симы.х ингибиторов — борной и н-гексилборной кислот — на скорость реакции гидролиза амидного субстрата, катализируемого а-химотрипсином (а) — без добавления НзВОз, (б) — концентрация НзВОз равна 0,21 М. Пунктирная прямая соответствует альтернативному механизму взанмонезави-симого ингибирования

Биоспецифическая хроматография применяется для очистки ферментов, так как она позволяв извлекать ферменты из сложных смесей в одну стадию с высокой степенью очистки и с большим выходом. В последнее время в качестве адсорбентов-носителей в биоспецифической хроматографии находят применение как макропористые неорганические адсорбенты (силикагели, силохромы, пористые стекла), так и макропористые органические сшитые сополимеры, например макропористые сополимеры глицидилме-такрилата с этилендиметакрилатом типа сферой (см. лекцию 6) со сферическими зернами разных размеров. Эти адсорбенты-носители обладают разной удельной поверхностью и крупными порами разных размеров. На рис. 18.10 представлен пример биоспецифической хроматографии химотрипсина на сфероне с иммобилизованным химической прививкой белком — ингибитором трипсина (являющегося также ингибитором химотрипсина). Из колонны, заполненной обычным макропористым сфероном без иммобилизованного ингибитора, химотрипсин выходит вместе с остальными белками, а из колонны, заполненной сфероном с привитым ингибитором, сопутствующие белки выходят приблизительно за то же время, а химотрипсин прочно удерживается. Это позволяет отделить [c.342]

Рис. 18.10. Хроматограммы химотрипсина на колоннах с макропористым сфероном (а) и с тем же сфероном с привитым ингибитором трипсина (б) (J. Turkova et al., 1973)

Препараты трипсина не должны содержать примесей химотрипсина. С этой целью продажные препараты трипсина обрабатывают ингибиторами химотрипсина, в частности дифенилкарбамнлхлоридом или Л -тозил-Ь-фенилаланилхлорметилкетоном [c.140]

Ферменты, разрушающие некоторые незаменимые аминокислоты (например, аспараганаза), используют для борьбы со злокаче-ственньпк ростом опухолей. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилизин, коллагеназа), иммобилизованные на волокнистых материалах (целлюлоза, полиамидные волокна, декстран и др.), применяют для эффективного лечения ран, язв, ожогов, абсцессов, а их белковые ингибиторы — в заместительной терапии для лечения эмфиземы и панкреатитов. [c.103]

Как уже говорилось выше, питательная ценность зависит также от степени и скорости высвобождения незаменимых аминокислот. Эти факторы особенно важно принимать во внимание в присутствии ингибиторов протеаз или слабопереваримых комплексов. Имеется много работ, где этот вопрос рассмотрен с разных точек зрения в связи с измерением биологической доступности некоторых аминокислот, таких, как лизин и метионин [28], или в целях прогнозирования общей переваримости конкретного белка, либо для вычисления индексов наивысщей питательности, о которых говорилось выше. Используемые ферменты обычно относятся к участвующим в пищеварительных процессах in vivo (пепсин, трипсин, химотрипсин), но они могут быть также и другого происхождения (папаин, проназа). [c.576]

Рис. 11.23. Конформационная карта метиламида Ы-ацетил-1-аланина и конформационные точки аминокислотных остатков (за исключением Gly) в трехмерных структурах миоглобина (а), а-химотрипсина (6), белка хрусталика глаза (в), лизоцима (г), нейротоксина II (точки) и рубредоксина (крестики) (д), панкреатического трипсинового ингибитора (точки) и ферроцитохрома с (крестики) (е)

Неожиданным явился разрыв связи —ЦиЗОзН.Сер— под действием химотрипсина. В контрольных опытах с химотрипсином, который предварительно инкубировался со специфическим ингибитором — диизопропилфторфосфатом, разрыва [c.203]

А между атомом углерода карбонильной группы-15 псевдосубстрата и остатком5ег-195фермента. Обычным субстратам химотрипсина и трипсина, в которых осуществляется несколько выгодных контактов, для достижения стадии ацилирования необходима энергия активации от 5 до 4- 15 ккал/моль. Однако при образовании комплекса трипсин — ингибитор оптимизируются многочисленные другие взаимодействия, и величина ЛС оказывается равной —18 ккал/моль, несмотря на напряженность С—О -аддукта (табл. 5.6). Таким образом, различие энергий стабилизации можно объяснить различием контактирующих областей в комплексах, которые трипсин образует с ингибитором и с обычными субстратами [7491. [c.281]

Реализация указанного подхода требует длительного времени, однако он весьма ценен, так как дает информацию о связывании субстрата в условиях нормального функционирования фермента. Этот подход все же не может дать детальных сведений о взаимодействии групп, участвующих в связывании, подобных тем, какие стали доступными в последние годы благодаря рентгеноструктурным данным. Рентгеноструктурные исследования обычно неприменимы к фермент-субстратным комплексам, поскольку времена жизни последних слишком малы, и должны поэтому проводиться на неработающих ферментах. Однако рентгеноструктурные данные, полученные для комплексов ферментов с ингибиторами или плохими субстратами, дали большой объем информации о деталях связывания малых и больших молекул ферментами, который в удачных случаях можно безусловно перенести на связывание субстрата. Структура комплексов химотрипсина с Л -формилтриптофаном и Л -формилфенилаланином (60) и (61) (Х = ОН, продукты гидролиза специфических субстратов) почти наверняка близка к соответствующим фермент-субстратным комплексам (60), (61) (X —NHR), так как фермент катализирует обмен 0 с карбоксильной группы Л -ацильных производных этих соединений в растворитель — воду [99]. [c.512]

Определяющим структурным требованием к хорошему субстрату или ингибитору химотрипсина является наличие аромати-чеекой группы R в (58) . Центр связывания этой группы можно легко распознать в трехмерных структурах комплексов фермента. [c.512]

Изучение случаев, в которых при связывании субстрата изменяется геометрия каталитического участка, часто является более легкой задачей. Простой, но примечательный пример представляет эффект ингибиторов химотрипсина на скорость гидролиза ацетилфермента. Ацетильная группа слишком мала, чтобы достигать гидрофобного кармана с серина-195, поэтому связывание в данном случае неспецифично. В то же время, если ацильная группа принадлежит субстратной аминокислоте и ее боковой ра- [c.516]

На протяжении последних десятилетий в связи с повышением разрешающей способности рентгеноструктурного метода была расшифрована третичная структура более 1000 белков, в том числе гемоглобина, пепсина, химотрипсина, рибонуклеазы, лизоцима, трипсина п его ингибитора, ряда фрагментов иммуноглобулинов человека, цптохрома С, карбоаигидразы человека, аспартатампиотраисферазы, инсулина п др. Примеры трехмерной структуры некоторых из них представлены на рис. 1.21. [c.65]

Получены экспериментальные доказательства наличия в активном центре химотрипсина двух остатков гистидина и остатка серина, схематически представленных в трехмерной структурной модели предшественника этого фермента (рис. 4.3). Выявление химической природы и вероятной топографии групп активного центра—проблема первостепенной важности. Она сводится к определению природы аминокислот, их последовательности и взаиморасположения в активном центре. Для идентификации так называемых существенных аминокислотных остатков используют специфические ингибиторы ферментов (часто это субстратподобные вещества или аналоги коферментов), методы мягкого (ограниченного) гидролиза в сочетании с химической модификацией, включающей избирательное окисление, связывание, замещение остатков аминокислот и др. [c.123]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология