Метод определения концевых групп белка

Определение С-концевых остатков в пептидах и белках разработано менее удовлетворительно, нежели определение iV-концевых. Предлагались многочисленные химические методы, но ни один из них не выдержал проверку временем. К счастью, с помощью двух панкреатических ферментов — карбоксипептидазы А и карбокси-пептидазы-В — можно получить некоторую информацию о С-кон-цевой последовательности. Карбоксипептидаза А преимущественно отщепляет аминокислоты с ароматическими боковыми группами, а большинство остальных аминокислот отщепляет гораздо медленнее. С-концевой Pro устойчив. Этот фермент хорош при идентификации С-концевых последовательностей у пептидов, образующихся в результате расщепления с помощью а-химотрипсина (см. разд. 23.3.6), так как такие пептиды на С-конце имеют ароматические аминокислоты. При обработке пептида или белка карбокси-пептидазой А возникают те же трудности, что и при использовании аминопептидаз для анализа iV-концевых последовательностей (см. разд. 23.3.4.1). Карбоксипептидаза В гораздо более специфич- [c.272]

Обсудим последовательные стадии определения первичной структуры небольшого пептида для белка эта процедура аналогична, но более громоздка. Сначала необходимо выяснить, какие аминокислоты находятся на концах цепи. Обратите внимание, что на рис. 40.1 одна концевая аминокислота содержит свободную а-аминогруппу, а другая концевая аминокислота — свободную а-карбоксильную группу. Эти аминокислотные остатки называют соответственно М-концевым и С-концевым. В соответствии с методикой, разработанной Сенджером в его работе с инсулином, сначала используется 1-фтор-2,4-динитробензол, который образует стабильное динитрофенильное производное с Ы-концевым остатком. После кислотного гидролиза модифицированная аминокислота отделяется и идентифицируется. Определение С-концевого остатка можно провести с помощью осторожной обработки ферментом карбоксипептидазой, которая специфически катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи, отщепляя от полипептидной цепи единственную аминокислоту. Существуют также и другие методы определения Н- и С-конце-вых аминокислотных остатков, но два описанных являются наиболее распространенными. [c.374]

Полипептидные цепи состоят из аминокислот, соединенных между собой пептидными связями, т. е. связями между а-ами-ногруппами и а-карбоксильными группами. Существуют открытые, циклические й разветвленные полипептидные цепи. Как правило, открытые полипептидные цепи имеют на од ном. конце свободную а-аминогруппу, а на другом свободную а-карбоксильную группу, которые могут быть обнаружены различными методами определения концевых групп [114, 277, 320]. В разветвленной полипептидной цепи одна из групп в зависимости от характера разветвления может отсутствовать. Большая часть белков представляет собой соединения с открытой цепью [265, 277]. [c.167]

Обширное статистическое исследование структуры белков предприняли в 1974 г. П. Чоу и Г. Фасман [98, 99]. Как и в предшествующих аналогичных исследованиях, ставится задача предсказать вторичные структуры (а-спираль, -складчатый лист) и клубковое состояние и на этой основе описать третичную структуру. В стабилизации регулярных форм большая роль отводится пептидным водородным связям, которые и послужили критерием в определении границ вторичных структур в известных конформациях белков. Из частот появлений каждого аминокислотного остатка в а-спиралях (f ), их внутренних витках (faj), складчатых листах (f ) и клубках (f ,) рассчитаны соответствующие конформационные параметры Рц, P j, P и Р .. Метод определения этих параметров исключает учет в явном виде влияния взаимодействий между остатками. Значения Рц оказались близкими значениям s теории Зимма и Брэгга, полученным для поли-а-аминокислот. Из частотного анализа остатков на границах спиральных и -структурных областей найдены характеристики остатков, инициирующих и терминирующих вторичные структуры. Заряженные остатки с наибольшей частотой появляются на N- и С-концах спирали и, как правило, отсутствуют в -структурных областях. Частоты появления остатков на концах спиралей могут быть скоррелированы со значениями параметров инициации Зимма и Брэгга — а. П. Чоу и Г. Фасман предложили механизм свертывания белковой цепи в глобулу, согласно которому спиральная нуклеация начинает зарождаться в центре фрагмента с наибольшими у остатков значениями Р и затем распространяется в обоих направлениях вплоть до спиралеразрывающих остатков с малыми значениями Р [99]. Аналогичным образом происходит формирование -структурных нуклеаций. Авторы считают, что при P > Рц образование -структур становится более предпочтительным по сравнению с а-спиралями. Аминокислоты были классифицированы на две группы, состоящие из шести подгрупп, начиная с сильных а (или )-образуюпщх остатков и кончая a( )-paзpывaющими остатками. [c.258]

Первичная структура белков устанавливается методами химической деструкции. Очень важную роль в определении первичной структуры белков сыграл метод определения концевых групп. Он состоит в обработке белка 2,4-динитрофторбензолом. Незащищенные аминогруппы на концах цепи дают 2,4-динитрофенильные производные, по которым после кислотного гидролиза белка легко установить, какие именно аминокислоты были концевыми [c.359]

Отсутствие свободного а-аминоазота в белке, подобном зеину, можно также объяснить наличием пролина или оксипролина на одном конце. В таком случае выбор может быть обоснован методом определения конечных аминокислот, требующим свободной карбоксильной группы. С другой стороны, необходимо отметить конечную аминогруппу, если карбоксилы маскированы в виде амидов. [c.216]

Начальный этап в изучении первичной структуры пептида или белка состоит в определении N-концевой аминокислоты, т. е. той, которая находится на конце цепи и имеет свободную а-аминную группу. Ее можно при помощи специальных методов отщепить и точно идентифицировать. Затем то же самое можно повторить с концевой группой, оставшейся на конце цепи после отщепления первой. Повторяя операции несколько раз и осуществляя ступенчатый гидролиз цепи, возможно определить в нем аминокислотную последовательность с N-конца. Возможно подобное определение и аминокислоты со свободной а-СООН-группой (С-конце-вой), но при помощи иных методов. Этим способом можно определить лишь по несколько звеньев с обоих концов, так как повторные операции удается повторять не более чем 5— 12 раз. Однако таким путем не трудно расшифровывать строение пептидов — продуктов гидролиза белка. [c.24]

Как уже упоминалось, ПК в качестве лигандов могут обладать как групповой специфичностью (для белков хроматина, факторов управления трансляцией, нуклеаз и др.), так и индивидуальной (для индивидуальных мРНК, белков-регуляторов транскрипции и др.). Во втором случае на аффинном сорбенте должны быть закреплены вполне определенные участки генома. Это стало возмолшым после создания способов отбора и наработки в достаточных количествах строго идентичных фрагментов ДНК методами генной инженерии. В последнее время возникла еще одна область использования иммобилизованных НК — в качестве праймеров матричного синтеза. Эти приложения предъявляют разные требования к характеру фиксации НК на матрице. В первом случае расположение точек закрепления на молекуле НК может быть произвольным, во втором определенные и достаточно протяженные участки полинуклеотидной цепи должны быть свободны для комплементарного взаимодействия, а в третьем закрепление НК на матрице желательно осуществить лишь по одному определенному концу молекулы. Что же касается возможности реакций с активированными матрицами, то вдоль всей молекулы НК во множестве располагаются химически эквивалентные группы аминогруппы нуклеиновых оснований, гидроксилы сахаров и др. В особом положении находится только концевой остаток фосфорной кислоты или сахара. [c.387]

Разработаны химические методы определения величины полинептидных цепей белковой молекулы. Эти методы основаны на использовании особого реагента (динитрофторбензола), который соединяется со свободной а-амино-грунной аминокислотного остатка, стоящего на конце нолипептидной цепи, с образованием окрашенного комплекса этот комплекс можно выделить и идентифицировать после того, как белок подвергнется гидролизу на составляющие его аминокислоты (в том числе и на конечную аминокислоту с присоединенной к ней окрашенной группой). Так, лизоцим, белок, содержащийся в слезах и яичном белке и обладающий свойством уничтожать бактерии, имеет, как было установлено ири помощи ультрацентрифуги, молекулярный вес около 14 ООО и состоит примерно из 125 аминокислотных остатков. Применение описанного метода позволило показать, что имеется лишь одна свободная а-аминогруппа, и на этом основании был сделан вывод, что данная молекула состоит из одной нолипептидной цепи. Если эта полипептид-ная цепь была бы растянута, то ее длина составляла бы около 450 А. Однако, как установлено при помощи ультрацентрифуги, дифракцией рентгеновских лучей и другими методами исследования, молекула лизоцима по форме близка к шару с диаметром около 25 А. Отсюда следует, что нолипептидная цепь не может быть вытянутой, а должна быть скрученной, ибо только тогда молекула приобретет сферическую форму. [c.487]

Хотя из литературных данных известно, что изучались различные химические методы определения С-концевых аминокислот [206], ни один из этих методов не обнаружил достаточно удовлетворительных результатов, которые давали бы основание к его широкому использованию. Поэтому наибольшее распространение получил способ, основанный не на химической, а на ферментативной реакции с карбоксипептидазой — ферментом, реагирующим лишь с теми пептидами, которые содержат свободную карбоксильную группу. Поскольку рассмотрение ферментативных реакций выходит за рамки настоящего раздела книги, реакция с карбоксипептидазой в данном изложении не описывается. Следует отметить, однако, что проблема развития химии белка настолько важна, что вполне оправданы постоянно продолжающиеся исследования, направленные на поиск и разработку удобных и с широкими возможностями применения химических методов. Было показано, что для установления последовательности аминокислот с С-конца белковой молекулы по крайней мере ограниченное применение могут найти три разных химических метода, так как они дают результаты, подтверждающие данные, получающиеся при использовании карбоксипептидазы. Речь идет о гидразинолизе, этерификации с последующим восстановлением сложноэфирной группы на конце молекулы в спиртовую, а также о реакции с неорганическим тиоци-анатом. [c.376]

Аминокислотный остаток на одном из концов открытой (т. е. нециклической) полипептидной цепи имеет свободную а-аминогруппу и называется обычно К-концевым остатком [126]. Аналогично аминокислота на другом конце цепи, несущая свободную карбоксильную группу, называется С-кон-цевым остатком. ]йдентификация остатков на концах цепи представляет собой ценный прием структурной химии белков, так как он позволяет определить последовательность остатков вдоль полипептидной цепи. Эта методика полезна также и при исследовании структуры гликонротеинов для определения природы аминокислот вблизи углевод-белковой связи коротких гликопептидов, отщепляемых от макромолекулы. Поскольку органические амины более реакционноспособны и образуют более устойчивые производные, чем карбоновые кислоты, методы определения К-концевых групп выполняются легче и более успешно, чем методы определения С-концевых остатков [118]. [c.152]

Последовательность аминокислотных остатков в полипептид-,ной цепи называется ее первичной структурой. Определение пер.-вичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью специфических протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь между определенными остатками. Так, трипсин атакует лишь те пептидные связи, которые образованы СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь коротких полипептидных цепей, олигомеров. Такие короткие цепи называются пептидами. Их исследование производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, масс-спектроскопия). Воздействуя другим ферментом, можно разрезать белок по другим связям, получить смесь других пептидов. N- и С-конце-вые остатки белка (см. стр. 68) определяются в результате их химической модификации, предшествующей частичному гидролизу. Зная строение пептидов, полученных при специфическом расщеплении различными ферментами, можно установить первичную структуру белка. Допустим, что белковая цепь имеет структуру [c.73]

Определение аминогрупп. Концевые аминогруппы содержат белки и синтетические полимеры полипептиды, полиамиды, по-лигидразиды, полиуретаны, полимочевины, политриазолы и др. Аминогруппы в этих полимерах можно определять титрованием кислотами или ацетилированием. Метод титрования получил более хнирокое распространение, так как не все высокомолекулярные соединения, содержащие аминогруппы на концах цепи, могут быть ацетилированы из-за их плохой растворимости в пиридине или других применяемых для этой цели растворителях. С другой стороны, определению аминогруппы методом ацетилирования мешает наличие гидроксильных групп в полимерах. Для такого широкого круга полимеров с концевыми аминогруппами, естественно, трудно подобрать универсальную методику количественного анализа, поэтому остановимся лишь на примерах определения аминогрупп в полиамидах. [c.116]

Известна последовательность еще одного участка КПВ, содержащего сульфгидрильную группу [156]. Единственный остаток цистеина в КПВ алкилируется иодацетамидом в отсутствие восстанавливающих агентов при условии, если удален цинк. Таким образом, для КПВ химические данные более определенно указывают на то, что цистеин служит лигандом цинка. Однако последовательность [157] вокруг этого остатка цистеина гомологична последовательности КПА не в районе третьего лиганда цинка (His-196), а в начале спирального участка у С-конца. Остаток цистеина соответствует остатку А1а-290, а-углеродный атом которого удален от атома цинка на 11 А. Если считать, что химические данные доказывают участие цистеина в связывании металла, то возникает следующая дилемма или две высокогомологичные последовательности расположены в двух белках в разных положениях, или их третичные структуры не одинаковы. Объяснение противоречия может заключаться в том, что остаток цистеина, как и А1а-290, спрятан внутри молекулы и вступает в реакцию только после некоторого ее разворачивания, вызываемого удалением цинка. Скорее всего, цистеин не является лигандом цинка, однако обращение к истории установления природы лигандов металла в КПА (разд. 3.3.2) показывает, что разумнее отложить этот вопрос до установления полной первичной структуры КПВ и сравнения третичных структур прямыми методами. [c.553]

Реакция фенилизотиоцианата с аминогруппами белков очень похожа на соответствующую реакцию изоцианатов. Было найдено, что фенил-изотиоцианат можно применять для определения содержания аминных концевых групп в белках и последовательности аминокислот в полипептидах и белках в последнем случае проводят постадийное расщепление с аминного конца молекулы. Метод основан на специфической реакционной способности фенилизотиоцианата, который в среде пиридина реагирует с концевыми аминогруппами, образуя фенилтиокарбамилпептиды (ФТК-пептиды). Эти производные при нагревании с безводным хлористым водородом в среде нитрометана легко перегруппировываются, образуя фенил-тиогидантоин N-концевого аминокислотного остатка исходного белка. При нагревании со щелочью фенилтиогидантоин расщепляется, образуя свободную аминокислоту, которую можно идентифицировать, например. [c.370]

Наличие этаиоламина на карбоксильном конце выделенного пептида гарантирует принадлежность этого пептида карбоксильному концу белка. Возможные невысокие выходы присоединения этаиоламина к белку не являются серьезным ограничением метода, так как любой неамидированный пептид после ЭФ оказывается смещенным с диагонали и поэтому не мешает определению искомого фрагмента. Наконец, метод должен оказаться применимым к белкам, имеющим природную амидироваиную С-концевую аминокислоту, так как подобные белки содержат блокирующую группу того же типа, что и при искусственном амидировании. [c.487]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология