Нуклеиновые кислоты методы выявления

Применение. В гистохимии для выявления нуклеиновых кислот методом экстракции [I] при обработке 10%-ной хлорной кислотой при 4°С извлекается только РНК, а 5%-ной кислотой при 60 °С — РНК и ДНК [Пирс, 750]. В аналитической химии в качестве сильного окислителя и для определения кремния и фосфора, [c.432]

Установление химического типа белков (и только белков ) является для чисто химических методов принципиально неразрешимой задачей, так как белки не являются классическими объектами органической химии. Они обладают практически неограниченной химической потенцией, и их исключительность состоит не в особой склонности к тем или иным, вполне определенным и характерным только для них химическим реакциям, а, напротив, в их универсальности. Химическое поведение белков характеризуется необозримо широким спектром действия, несопоставимым по своему функциональному многообразию с действиями любого другого класса молекул живой и неживой природы или соединений, синтезированных человеком. Именно благодаря универсальным биохимическим свойствам белков назначение генетического аппарата любого живого организма сведено только к их синтезу. В органической химии аналитические методы основаны на эмпирическом тестировании реакций, на выявлении тех химических особенностей, которые присущи лишь данному типу молекул или атомных групп. Со времени Бутлерова считалось незыблемым, что такому условию удовлетворяют все синтезируемые соединения. Не явились исключением здесь и жиры, углеводы и нуклеиновые кислоты. Поэтому определение типов их молекулярного строения на чисто химической основе не встретило непреодолимых осложнений. Подчеркнем, что сказанное относится ко всем природным и синтетическим полимерам, в том числе и к ближайшим искусственным аналогам белков -полиаминокислотам. Таким образом, предпринятые после Фишера попытки решить с помощью органической химии структурную задачу белков не достигли и не могли достичь цели. История химии белка данного периода скорее свидетельствует об обратном - имевшее место увеличение количества химических данных о белках сопровождалось ростом неопределенности в понимании их химического строения. Изучение на такой основе белков не приближало, а, напротив, уводило в сторону от решения этой типичной по своей постановке для синтетической органической химии задачи. [c.65]

Малые размеры бактериальной клетки и наличие двух типов нуклеиновых кислот очень затруднили цитохимическое выявление ядерного материала. Тем не менее классические цитологические методы, а затем и техника ультратонких срезов в сочетании с электронной микроскопией позволили в конце концов установить, что бактерии содержат ДНК и что эта ДНК не распределена диффузно в цитоплазме, а локализована в ограниченных участках, которые делятся перед делением клетки. [c.30]

Данные таблицы показывают, что для отчетливого выявления изменений в ДНК и РНК тотчас после облучения большое значение имеет не только фракционирование нуклеиновых кислот, но и метод их выделения. Мы применяли метод фракционированного осаждения нуклеиновых кислот спиртом в присутствии ацетата Mg . Деполимеризация ДНК и РНК тотчас после облучения костного мозга выявляется только в том случае, если ДНК и РНК выделяли без применения додецилсульфата натрия. До- [c.48]

Реакция гибридизации нуклеиновых кислот - чувствительный метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов [43] [c.237]

Если двум частично комплементарным цепям плазмидной ДНК дать возможность ренатурировать, то образуются гетеродуплексные молекулы, которые можно исследовать с помощью электронного микроскопа. Поскольку при электронно-микроскопическом анализе в случае соответствующего приготовления образцов одно-и двухцепочечные участки нуклеиновых кислот различаются, существует возможность картирования гомологичных и негомологичных участков. С тех пор как в практику вошли способы проверки с применением рестриктаз и методы выявления гомологий ДНК в растворе по радиоактивности, методология гетеродуплексного анализа с помощью электронного микроскопа перестала широко применяться для анализа плазмидной ДНК- Хотя техника такого анализа требует большого экспериментального искусства и специального оборудования, она все же заслуживает рекомендации как способ точной локализации различий между плазмидами и наилучшей оценки организации плазмидной ДНК- [c.156]

Выражение достаточно сходными из приведенного выше определения бактериального вида является источником большинства затруднений в классификации бактерий, так как то, что один человек считает достаточно сходным, не обязательно представляется таковым для другого. Однако совершенно очевидно чем больше известно о какой-то группе бактерий, тем более вероятно, что различные исследователи смогут прийти к одной приемлемой схеме классификации. Исторически сложившийся способ характеристики бактерий заключается в качественном описании как можно большего числа фенотипических признаков, основанных на морфологии, структуре, культивировании, питании, биохимии, метаболизме, патогенных и антигенных свойствах и экологии. Рутинные и специальные тесты для выявления многих из этих признаков описаны в гл. 20. Методы нумерической таксономии, приведенные в гл. 21, полезны для количественного определения сходства на основе фенотипических признаков они могут помочь в достижении объективности, которая иногда отсутствует в тех случаях, когда бактерии классифицируют по интуиции. Фенотипическое сходство не обязательно означает филогенетическую связь или родственность (обш-ность происхождения), однако в последние годы появились методы, основанные на гомологии нуклеиновых кислот, позволяющие группировать бактерии по степени их родства. Эти методы, описанные в гл. 22, позволяют сравнивать бактерии по нуклеотидным последовательностям их ДНК или РНК. [c.6]

Последние достижения в развитии новейших технологических приемов значительно расширили наши возможности в определении генетического строения и молекулярной структуры вирусов, а также выявлении сходства штаммов и идентификации различий между вариантами вирусов. Наиболее важные из этих методов — клонирование и определение последовательности нуклеиновых кислот, картирование РНК и пептидов, а также антигенный анализ белков с помощью моноклональных антител. Задача последней обзорной главы данной книги — обсуждение эпидемиологии вируса гриппа в свете применения этих новых методов. Особое внимание уделено оценке последних достижений и изучению вопросов эпидемиологии, которые могут быть успешно решены при использовании молекулярных методов. [c.313]

Известны различные методы выделения ДНК из большинства органов некоторых видов растений. В отдельных экспериментах по трансформации может понадобиться анализ геномной ДНК (как ядерной, так и ДНК органелл) для выявления перенесенных последовательностей. В данной главе описаны методы выделения как небольших количеств нуклеиновых кислот, так и процедуры их крупномасштабного выделения. Эти методики нашли широкое применение для получения тотальной клеточной ДНК, а также ДНК из ядер и органелл. [c.238]

Методы электронно-микроскопического выявления нуклеиновых кислот лишь начинают разрабатываться. Имеющиеся в распоряжении исследователя методы по--зволяют проводить ультраструктурное выявление ДНК и РНК главным образом с помощью различных приемов контрастирования все они, однако, сопряжены со значительной неопределенностью получаемых результатов. Хорошее контрастирование ДНК и РНК достигается с помощью растворов уранилацетата и солей свинца. Можно повысить специфичность контрастирования по отношению к нуклеиновым кислотам путем исключения белков. Применяемые методы приведены в табл. 22. [c.101]

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.101]

Из приведенных в табл. 33 методов наиболее надежным следует считать метод установления базофилии с помощью забуференных растворов метилового синего для отграничения от кислых мукоидных веществ и нуклеиновых кислот. Выявление кислых липидов, кроме того, воз-можно при помощи нильского синего. [c.157]

В нуклеиновых кислотах остатки, участвующие в образовании водородных связей с комплементарными гетерощ1клами, имеют, как правило, резко сниженную реакционную способность но сравнению со свободными гетероциклами. Например, реакция (VII.2) остатков аденина и цитозина с галогенацетальдегидами проходит с участием экзоциклической аминогруппы и атома азота гетероцикла, которые являются непосредственными участниками уотсон-криковских взаимодействий (см. рис. 26). Поэтому в этенопроизводные легко превращаются остатки, находящиеся в однонитевых участках, и существенно труднее — остатки, образующие двуспиральную структуру. Реагенты, различающие одно- и двунитевые структуры полинуклеотидов, широко используются для детального изучения вторичной структуры нуклеиновых кислот, в частности для выявления шпилечных структур. В табл. 7.7 приведены некоторые реагенты, широко применяемые для изучения пространственной структуры белков и нуклеиновых кислот методом химической модификации. [c.324]

В основу книги Методы биохимии и цитохимии нуклеиновых кислот растений положены методы и схемы исследований нуклеиновых кислот, разра1ботавные или усовершенствованные в нашей ла боратории. Сюда следует отнести 1) схему анализа нуклеиновых кислот с одновременным определением других фосфорных соединений 2) количественный анализ нуклеиновых кислот по пуриновым основаниям 3) схему фракционного экстрагирования нуклеиновых кислот для выявления гетерогенности ДНК и РНК 4) обнаружение, получение и определение количественного соотношения фракций лабильной, стабильной [c.3]

Пример, который мы только что подробно рассмотрели, показывает, что эксперименты по тритиевому обмену в принципе являются достаточно информативными. Однако при исследовании более сложных систем разграничить разные кинетические процессы становится труднее. Еше большие трудности возникают при идентификации этих процессов. Ранние исследования на тРНК показали, что в этой молекуле происходит значительно более медленный обмен протонов, чем тот, который можно объяснить наличием водородных связей. В то время казалось, что сушествование столь низких скоростей связано с особенностями третичной структуры этой молекулы. Теперь, после всестороннего изучения процессов обмена в ДНК, детальный анализ данных для тРНК представляется слишком сложной задачей. Таким образом, основная проблема состоит в том, что при наблюдении лишь за обшей скоростью обмена теряется большая часть информации. Нужны методы, которые позволили бы независимо следить за обменом отдельных протонов или по крайней мере определенных групп протонов. Такую возможность дает использование метода ЯМР, который обладает достаточно высоким разрешением, чтобы можно было выполнить это требование. Следует иметь в виду, однако, что расшифровка спектров ЯМР представляет серьезную проблему. Примеры применения этого метода были приведены выше, когда мы рассматривали спектры ЯМР не способных к обмену протонов одиночных цепей. Другой подход состоит в прямом проведении химического обмена, отборе молекул, в которых произошло частичное замещение, и анализе локализации отдельных обменивающихся остатков путем фрагментации молекулы нуклеиновой кислоты и выявления локализации атомов трития в каждой точке последовательности. Такая процедура является довольно громоздкой, но затрачиваемые усилия вознаграждаются тем, что удается получить много ценной информации. [c.300]

ДНК-зонды применяют для поиска родственных генов в реакциях гибридизацрш с РНК — для выявления экспрессии данного гена в различных клетках. Для вьывления молекул нуклеиновых кислот, комплементарных всему зонду (или его участку), ДНК-зонды часто сочетают с методом гель-электрофореза, что позволяет получать информацию о размерах гибридизируемых молекул ДНК. Эффективное использование современных приборов, способных автоматически синтезировать любые нуклеотидные последовательности за короткий промежуток времени, дало возможность перестраивать гены, что представляет собой один из важных аспектов генной инженерии. Обмен генами, а также введение в клетку гена другого вида организма осуществляют посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на Е. соИ. Он основан на важном свойстве ДНК — способности к перестройкам, изменяющим комбинацию генов в геноме и их экспрессию. Такая уникальная способность ДНК позволяет приспосабливаться данному виду к изменяющейся среде. Генетическую рекомбинацию подразделяют на два больших класса общую рекомбинацию и сайт-специфическую рекомбинацию. В процессе общей рекомбинации генетический обмен в ДНК происходит между гомологичными нуклеотидными последовательностями, например между двумя копиями одной и той же хромосомы в процессе мейоза (кроссинговера), или при скрещивании и перегруппировке генов у бактерий. [c.112]

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

Метод нашел также широкое применение для выявления элементов пространственной организации комплексов биополимеров, в частности комплексов белков с нуклеиновыми кислотами. Если, например, фрагмент нуклеиновой кислоты принимает участие во взаимодействии с белком, то реагент, действующий на свободную нуклеиновую кислоту, не сможет атаковать фрагмент, экранированный молекулой белка. Поэтому на картине, отражающей распределение модифицированных фрагментов вдоль цепи нуклеиновой кислоты, на участке, закрытом бел-1<ом, будет наблюдаться резко пониженный уровень модификации, своего рода отпечаток белковой молекулы. Этот метод получил название футприптита, что означает <отпечаток ноги>. [c.324]

Экспресс-диагностика. В качестве экспресс-диагностики используются молекулярно-биологические методы выявление в клинических образцах нуклеиновых кислот возбудителя с помощью ПЦР и метод гибридизации на основе ДНК-зондов. Разработана мультиплексная ПЦР, позволяющая одновременно определять в клинических образцах нуклеотидные последовательности М. genitalium, и. urealyti um и М. hominis. Однако в связи с высокой частотой носительства полученные результаты требуют подтверждения методами серодиагностики. [c.252]

Протопласт. Содержимое бактериальной клетки без клеточной оболочки получило название протопласта. Протопласт состоит из цитоплазмы, покрытой мембраной. Разработан метод освобождения протопласта грамположительных бактерий посредством обработки клеток ферментом лизоцимом. Оболочки клеток при этом растворяются, а протопласты сохраняются живыми, способными к росту, делению, синтезу протеинов и нуклеиновых кислот [363]. Цитоплазма представляет собой водянистую или слегка вязкую массу — сложную композицию белков, жиров, углеводов и многочисленных других органических соединений, минеральных веществ и воды. Цитоплазма не гомогенная коллоидная жидкость, она содержит множество субми-кроскопических мембранных структур, выявленных электронной микроскопией. В цитоплазматических белках найдено 20 различных аминокислот, обусловливающих различные свойства белков. Например, аминокислота тирозин имеет спиртовые группы (ОН) в боковой цепи и этим обусловливает гидрофильность цитоплазмы. Липоиды, наоборот, обусловливают гидрофобность цитоплазмы. [c.26]

Применение. В обычной и флуоресцентной микроскопии для выявления нуклеиновых кислот и кислых мукополисахаридов в клеточных и тканевых структурах. В гистохимии в качестве флуорохрома для выявления муцина [2] и нуклеиновых кислот. При исследовании нефиксированных тканей с помощью флуоресцентного микроскопа в сиЕзем свете ядра (ДНК) окрашиваются в зеленый цвет, нуклеиновые кислоты (РНК) ядрышек и цитоплазмы — в красный, волокнистая соединительная ткань окрашивается в зеленый цвет [3, 4]. В бактериологии в качестве флуорохрома для диагностики туберкулеза [5]. В гельминтологии для выявления трихомонад методом люминесцентной микроскопии [OJ. Для прижизненной окраски ядра живая клетка во флуоресцентном микроскопе дает зеленое свечение, мертвая — медно-красное [7, 8]. [c.17]

Применение. В гистохимии в качестве реактива на органический фосфор нуклеиновых кислот [1], для обнаружения ионов РО " в хромосомах [Пирс, 175] ив со.четанци с бензидином для выявления фосфатов по методу Бантинга. В микроскопической технике как составная часть гематоксилиновых растворов ло Ганзену [2] и по Кларку [3] и как активатор пероксидазной реакции [4]. b э-лектронной микроскопии в качестве контрастируюидего вещества. [c.36]

Сведений об изменении свойств нуклеиновых кислот костного мозга в разные сроки после облучения в литературе нет (не считая данных, опубликованных в последнее время нами) [1—4]. Одним из фактов, затрудняющих выявление изменений в нуклеиновых кислотах тотчас после облучения, по нашему мнению, является некоторое несоответствие методов исследования исследуемому объекту. А именно либо авторы уже в процессе выделения ДНК выделяли ее не всю, а только определенную ее фракцию (это имеет место прн выделении ДНК через промежуточное получение дезоксирибонуклеонротеида), либо, выделяя все фракции ДНК, авторы затем не фракционировали ее, а исследовали средние свойства всех фракций. [c.45]

Проведенные нами исследования показали, что наиболее отчетливо радиационно-биохимические изменения в нуклеиновых кислотах сразу после рентгеновского облучения in vivo могут быть выявлены при помощи фракционированного осаждения нуклеиновых кислот при определенном способе их выделения. Основное внимание в нашей работе было уделено разработке методов отчетливого выявления изменений в ДНК и РНК непосредственно после облучения in vivo. [c.45]

Марцинка [815] сравнил несколько красителей, применяемых для выявления нуклеиновых кислот, и сделал вывод, что для окрашивания РНК лучше всего использовать следующий метод. В смеси уксусной кислоты, метанола и воды (1 1 8 по объему) растворяют 0,5% пиронина Y и 1% ацетата лантана. В этом растворе гели выдерживают в течение 16 ч. Обесцвечивание фона проводят путем электрофореза в смеси уксусной кислоты, метанола и воды (1 2 17 по объему) или повторными промываниями гелей в нескольких сменах той же смеси. Окрашенные гели можно хранить в разбавленной уксусной кислоте (3—10%-ной) в течение нескольких лет. Описанный метод позволяет обнаруживать 0,01 мкг РНК. В идентичных условиях толуидиновый синий дает менее чистый фон, а акридиновый оранжевый — менее интенсивную окраску. [c.385]

Эффективность гибридизации in situ зависит от следующих параметров (I) частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей-мишеней (т. е. числа специфических последовательностей нуклеиновой кислоты, присутствующих в цитологическом препарате) (II) чистоты зонда (III) удельной радиоактивности меченого зонда (IV) чувствительности метода гибридизации (V) усиления сигнала (VI) эффективности метода радиоавтографического выявления пробы. [c.305]

Первоначально метод гибридизации in situ был наиболее успешно применен для выявления нуклеиновых кислот, находящихся в клетках в большом количестве копий. Этим методом выявляли, например, повторяющиеся последовательности сател-литных ДНК, амплифицированные рибосомальные ДНК в ооци-тах амфибий, латерально амплифицированные ДНК в политен-ных хромосомах двукрылых, рибосомальную и 5S РНК. Более того, с помощью этой же техники были идентифицированы и локализованы накапливающиеся в клетках транскрипты генов. [c.305]

Предшествующий опыт свидетельствует о том, что метод замещения в замороженном состоянии обеспечивает стабилизацию структуры тканей, особенно в сочетании с подходящей фиксацией. Очень, хорошими фиксаторами оказались четырехокись осмия и хлорид ртути (табл. 2). Метод замещения в замороженном состоянии, обеспечивающий прекрасную сохранность гликогена (табл. 2), можно рекомендовать также для выявления углеводов, белков и нуклеиновых кислот. Сульфгидрильные группы, связанные с белкам лучше всего выявляются после фиксации в 2,5%-ной трихлоруксусной кислоте в 95%-ном этаноле. Этот метод дает также хорошие результаты при выявлении неорганических веществ и ферментов. Весьма успешной оказалась фиксация при низкой температуре, которую можно проводить сразу же вслед за замоцшием [c.24]

Имеющиеся в нашем распоряжении гистохимические реакции охватывают методы для выявления белков и аминокислот, углеводов, нуклеиновых кислот, липидов, биогенных аминов, неорганических веществ и ферментов. Поскольку выявление ферментативной активности во многих отношениях отличается от выявления веществ, ферменты рассматриваются отдельно от белков. В специальные методические разделы выделены также радиоавтография и иммуногистохимия. [c.53]

Разработанные Касперссоном методы поглощения ультрафиолетовых отчей для Количественного и качественного выявления ДНл и РНК основаны на свойстве гетероциклических колец пуршювых и пиримидиновых оснований поглощать ультрафиолетовый свет при длине волны 260 нм. Этот трудоемкий и технически сложный метод дал сильный толчок исследованиям нуклеиновых кислот. Правда, с его помощью нельзя проводить прямое дифференциальное выявление ДНК и РНК. [c.93]

Поскольку исследование нуклеиновых кислот в ультрафиолетовом свете требует сложной аппаратуры, в последние годы все чаще используют стандартизованные реакции окрашивания в сочетании с цитофотометрией. Так как классическая реакция Фёльгена недостаточно воспроизводима (Sandritter), на первый план выдвигаются методы выявления фосфатных групп нуклеиновых кислот с помощью основных красителей. [c.311]

Помимо количественного определения РНК по поглощению ультрафиолетового света имеют значение также методы выявления РНК по окрашиванию основными красителями. В основе такого окрашивания лежит полиа-нионный характер нуклеиновых кислот и связывание ими [c.312]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология