Ультрацентрифуги оптические системы

При проведении седиментационного анализа с применением центрифуг в случае сравнительно грубодисперсных систем иногда используют весовые методы (центробеж- ные весы). Для высокодисперсных С/ систем и растворов высокомолекулярных веществ применяют ультрацентрифуги со значениями ротора, доходящими до 10 д, с оптической системой регистрации оседания частиц, позволяющей судить о распределении концентрации с= [c.157]

Для проведения седиментометрического анализа кинетически устойчивых систем (золей, растворов ВМВ) с целью определения размеров и массы их частиц недостаточно силы земного тяготения. Последнюю заменяют более значительной центробежной силой центрифуг и ультрацентрифуг. Идея этого метода принадлежит А. В. Думанскому (1912), который впервые применил центрифугу для осаждения коллоидных частиц. Затем Т. Сведберг разработал специальные центрифуги с огромным числом оборотов, названные ультрацентрифугами. В них развивается центробежная сила свыше 250 ООО Современная ультрацентрифуга представляет собой сложный аппарат, центральной частью которого является ротор (с частотой вращения 60 000 об/мин и выше), с тончайшей регулировкой температуры и оптической системой контроля за процессом осаждения. Кюветы для исследуемых растворов вмещают всего 0,5 мл раствора. В ультрацентрифуге оседают не только частицы тонкодисперсных золей, но и макромолекулы белков и других ВМВ, что позволяет производить определение их молекулярной массы и размеров частиц. Скорость седиментации частиц в ультрацентрифуге рассчитывают также по уравнению (23.9), заменяя в нем g на о) х, где (О — угловая скорость вращения ротора л — расстояние от частицы до оси вращения. [c.378]

С увеличением угловой скорости активность осаждаемых частиц снижается. Скорость осаждения частиц dr/dt при заданной угловой скорости со и положении раздела г фиксируется с помощью оптической системы ультрацентрифуги 4. [c.46]

Подобные кюветы значительно расширяют возможности метода ультрацентрифугирования, поскольку, применяя их, можно добиться образования резкой исходной границы седиментации в центре столба жидкости. Существует несколько вариантов конструкции таких кювет, каждый из которых применяют для проведения экспериментальных исследований определенного типа. Недавно была создана многоканальная кювета для одновременного ультрацентрифугирования четырех столбиков жидкости. Для ряда специальных задач описаны другие кюветы, хотя большинство из них пока не нащли широкого применения в исследовании полимеров. Все оптические методы, применяемые для регистрации границ седиментации в ультрацентрифуге, основаны на поглощении или преломлении света, проходящего через раствор полимера. Абсорбционные оптические системы регистрации нашли довольно ограниченное применение в исследованиях полимеров, поскольку большинство полимеров не поглощает свет в ультрафиолетовой части спектра . Но если полимер обладает сильным поглощением в указанной области спектра, то абсорбционный метод позволяет проводить весьма точные измерения при крайне низких концентрациях полимера [9]. Методы регистрации, основанные на разности показателей преломления раствора и растворителя, как правило, применяются в системе скрещенных диафрагм или в интерференционной оптической системе . Система скрещенных диафрагм регистрирует градиент показателя преломления (dn/dr) в зависимости от расстояния (г) до центра вращения, как показано на рис. 8-1 для скоростной седиментации полистирола в циклогексане. Интерференционные регистрирующие системы позволяют получать зависимость показателя преломления от расстояния г, на рис. 8-2 подобная регистрация представлена для низкоскоростной седиментации полистирола в циклогексане. Кривые изменения показателя прелом-. Ленин можно преобразовать в кривые изменения концентрации, определив постоянные такого преобразования по изменению показателя преломления стандартных растворов с помощью кюветы с искусственной границей. Возможности применения интерференционных методов регистрации основаны на большом различии показателя преломления растворителя и показателя преломления исследуемого полимера. [c.221]

Имеется несколько приемов, позволяющих получить резкую начальную границу для измерения диффузии. Мы не будем касаться экспериментальных деталей. Отметим только, что точность измерений зависит от остроты начального распределения концентраций, а также от полного исключения конвекционных возмущений в кювете. Для достижения последнего условия прибор термостатируют с точностью до 1 10 —3 10 градуса. Далее оптическим путем (с помощью рефрактометрии или интерферометрии) определяют изменение концентрации с координатой х внутри кюветы. Практически, так же как и в оптических системах ультрацентрифуги, регистрируемой величиной является гра- [c.126]

Взаимодействующие системы- могут быть исследованы количественно также с помощью аналитической ультрацентрифуги, если за связыванием лиганда можно проследить с помощью абсорбционной оптической системы [105, 107]. На рис. 9 представлены седиментационные диаграммы серии опытов с различными смесями НАД-Н (ДПМ-Н) лактатдегидрогеназы. Диаграмма, относящаяся к раствору НАД-Н (слева), показывает, что весь материал, поглощающий свет при длине волны 340 нм, мигрирует медленно, тогда как после добавления фермента часть или весь кофермент, в зависимости от концентрации фермента, седиментирует с тем же коэффициентом седиментации, что и нативный фермент. Из распределения поглощения света в кювете ультрацентрифуги в процессе седиментации можно рассчитать концентрацию связанного и свободного кофермента на основе этих данных рассчитывается среднее число связанных с ферментом молекул кофермента и по уравнению (3)—число связывающих, участков и константы диссоциации. [c.409]

Быстрое развитие техники исследования макромолекул в сильных гравитационных нолях привело к существенному улучшению методов определения молекулярного веса полимеров. Первая ультрацентрифуга была построена в 1925 г. Сведбергом и его сотрудниками. Ультрацентрифуга состоит из следующих основных частей ротора, в котором находятся кюветы, содержащие исследуемый материал охлаждаемой вакуумной камеры, в которой вращается ротор скоростного электромотора оптической системы, позволяющей в процессе вращения ротора измерять концентрацию белка или другого вещества в каждой точке кюветы. На фиг. 15 показано сечение ультрацентрифуги с электрическим приводом. Скорость вращения ротора [c.64]

МНОГО полезного в технику ультрацентрифугирования. В этом обзоре описаны многие важные экспериментальные детали — конструкция кювет, оптические системы и пр., — а также теоретические основы метода.) Существует несколько методов определения молекулярного веса с помощью ультрацентрифуги. Ниже мы рассмотрим наиболее важные из них, начиная с классического метода, основанного на измерении скорости седиментации. [c.65]

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

Оптическая система ультрацентрифуги позволяет фиксировать распределения концентраций в кювете в процессе опыта. Эти рас- [c.206]

Ультрацентрифуга состоит из металлического ротора диаметром несколько сантиметров, который вращается в вакууме при постоянной температуре. Ротор приводится в движение через электрический привод или каким-либо другим способом с заранее определенной постоянной скоростью вращения в диапазоне 1000—70 ООО об/мин. Небольшая цилиндрическая кювета, содержащая исследуемый раствор, помещается в ротор ближе к его внешней части. Устанавливающиеся в кювете градиенты концентрации определяют оптическим способом с помощью луча света, проходящего в направлении, параллельном оси вращения, и при каждом обороте ротора пересекаемого кюветой с раствором. Преломление или поглощение света, проходящего через различные участки кюветы, регистрируется соответствующей оптической системой. Последняя регистрирует концентрацию или изменение концентрации вдоль направления седиментации внутри кюветы. Развитие процесса осаждения молекул растворенного вещества можно проследить, фотографируя последовательные картины распределения по концентрации через определенные увеличивающиеся промежутки времени от начала седиментации. [c.220]

В этой связи необходимо кратко остановиться на методах определения молекулярно-весового распределения с помощью седиментации в ультрацентрифуге. Принцип ее действия известен в сильном центробежном поле между чистым растворителем и раствором полимера образуется граница, которая перемещается в радиальном направлении кюветы, вследствие оседания макромолекул. Оптическая система ультрацентрифуги регистрирует дифференциальные кривые изменения градиента показателя преломления с1п [c.124]

На ультрацентрифуге устанавливаются все основные оптические системы, причем интерференционная оптика MSE дает больше полос, чем обычно, что облегчает определение их числа. [c.29]

Фиг. 5. Оптическая система аналитической ультрацентрифуги MSE.

При любом типе ультрацентрифуги или оптической системы определение молекулярного веса может быть проведено одним из следующих двух методов. Скорость ультрацентрифугирования должна быть очень большой, и тогда измеряется скорость седиментации. Последняя определяется обычно в течение нескольких часов. Другой метод определения состоит во вращении центрифуги с более умеренной скоростью при этом достигается равновесное состояние раствора, который становится более концентрированным по мере удаления от осй центрифуги. [c.334]

Существуют два главных явления, изучаемых при помощи ультрацентрифуги скорость седиментации и седиментационное равновесие вещества в растворе. Для изучения этих явлений необходима аппаратура двух типов, так как при сравнительно низких скоростях вращения—от 1000 до 20 ООО об/мин — скорость седиментации белков и высокополимерных соединений имеет тот же порядок величины, что и скорость диффузии, тогда как для того, чтобы преодолеть диффузию и получить пригодную для наблюдения перемещающуюся границу седиментации, необходимы чрезвычайно высокие скорости — до 75 ООО об/мин. Основными требованиями, предъявляемыми ко всем типам ультрацентрифуг, являются отсутствие вибрации и конвекции и, для оптической системы, четкость изображения. [c.488]

Основными частями масляной ультрацентрифуги являются собственно центрифуга, система циркуляции масла под давлением, водородная система пониженного давления, оптическая система . [c.495]

Оптическая система этой установки подобна таковой в ультрацентрифуге Сведберга. Кварцевые окна, которыми снабжены верхнее и нижнее днища, располагаются на одной линии с прозрачной [c.505]

Оптическая система. На рис. 127 представлена схема оптической системы. Она во многих отношениях повторяет оптическую схему, использованную в ультрацентрифугах Сведберга (етр. 494). В этой системе применяются такие же объективы, как и для низкоскоростной аппаратуры (стр. 490). Для удобства работы применяются два фотоаппарата один при методе поглощения света, а другой [c.507]

Одним из наиболее часто употребляемых и наиболее старых критериев гомогенности является наблюдение единственной границы при исследовании седиментации в ультрацентрифуге. Важно провести этот эксперимент, но при этом следует иметь в виду некоторые положения. Хотя гетерогенность по коэффициентам седиментации обычно легко обнаружить, если примеси присутствуют в количествах, достаточных для наблюдения с помощью используемой оптической системы, форма границы является очень плохим показателем степени полидисперсности. Асимметричные или гибкие молекулы взаимодействуют гидродинамически даже при достаточно высоких разбавлениях раствора, вызывая уменьшение коэффициентов седиментации с увеличением концентрации, что ведет к искусственному обострению границы. Более того, как уже отмечалось, для больших гибких молекул даже в очень разбавленных растворах может происходить интенсивное физическое взаимодействие, а именно переплетение и спутывание цепей. Образование исклю- [c.48]

Раствор, исследуемый в скоростной ультрацентрифуге, помещается в кювету с толстыми кварцевыми окнами. Она имеет форму сектора, если смотреть под прямым углом к плоскости вращения ротора центрифуги, так как седиментация происходит радиально. По мере того как компонент с высоким молекулярным весом оседает во всем объеме раствора, образуется перемещающаяся граница, за которой находится только растворитель. За движением такой границы в кювете можно проследить с помощью оптической системы, основанной на принципе различного светопропускания (стр. 381). [c.614]

Виды ультрацентрифуг. Все отечественные и зарубежные ультрацентрифуги можно разделить на два типа аналитические и препаративные. Аналитические центрифуги позволяют анализировать распределение вещества в пробирке в течение всего времени. Препаративные, как правило, используются для получения и очистки клеточных органелл и макромолекул, т. е. для получения чистых фракций, препаратов (отсюда название—препаративная). Для беспрерывного наблюдения аналитические центрифуги снабжены оптической системой. При работе на препаративных центрифугах применяют фракционирование содержимого центрифужной пробирки с тем, чтобы в каж- [c.104]

Для экспериментального исследования седиментации необходимо создание, во-первых, достаточно мощного постоянного силового поля и, во-вторых, конструирование установки, позволяющей с большой точностью регистрировать седиментацию полимеров в этом поле Ультрацентрифуги, применяющиеся в настоящее время для этих исследований, состоят из ротора, в который помещгна кювета с исследуемым раствором, силового двигателя, вращающего ротор, и оптической системы регистрации. [c.135]

Существует несколько выпускаемых промышленностью приборов, с помощью которых можно определять молекулярные веса полимеров путем исследования равновесного распределения молекул в центробежном поле. Для иллюстрации рассматриваемого метода будут описаны типичные результаты, полученные в Национальном бюро стандартов [131] на модифицированной равновесной ультрацентрифуге Сведберга. Этот прибор снабжен оптической системой Лэмма, которая позволяет непосредственно измерять радиальный градиент показателя преломления. В любой точке ячейки смещение линии шкалы пропорционально градиенту концентрации в этой точке. [c.63]

В современных ультрацентрифугах, оснащенных оптической системой Фильпота — Свенсона, роль наклонной щели выполняет фазоконтрастная пластинка. Приведенная схема регистрации dnldr широко используется во многих моделях ультрацентрифуг вследствие ее хорошей точности и относительной простоты. [c.162]

Рис. VII.3. Конструктивная (а) и принципиальная (б) схемы оптической системы Филпота—Свенссона, установленной на ультрацентрифуге

Термин ультрацентрифуга был предложен для центрифуг с оптической системой. Термин суперцентрифуга, использовавшийся фирмой Sharpies o., был оставлен для скоростных центрифуг без оптики. В настоящее время, однако, это терминологическое различие стерлось, и ультрацентрифугами теперь называют пре-фативные и аналитические машины, в которых ротор ащается с большой скоростью в вакууме или в атмо-[)ере водорода. [c.17]

В аналитических ультрацентрифугах Be kman обычно имеются три оптические системы шлирен-система, интерференционная и ультрафиолетовая абсорбционная системы. Последнюю сейчас заменяют двухлучевой ультрафиолетовой системой регистрации. [c.29]

Аналитические и препаративные ультрацентрифуги изготовляются также специальным конструкторским бюро биофизической аппаратуры (Москва). Аналитические ультрацентрифуги (УДА) имеют электрический привод с питанием от генератора повышенной частоты, скорость вращения ротора до 65 000 об/мин, диапазон рабочих температур от —5 до 25° С. Улырацентрифуги снабжены несколькими современными оптическими системами. Препаративные ультрацентрифуги рассчитаны на скорость вращения ротора до 40 000 об/мин (УПР-8) и до 60 000 об/мин (УЦП-60) и снабжены несколькими роторами, в том числе и с подвесными стаканами. Конструкции отечественных ультрацентрифуг постоянно совершенствуются в соответствии с возникающими новыми задачами. — Ред.] [c.38]

Оптические системы составляют очень важную часть аналитических ультрацентрифуг, поэтому их описанию мы посвятим отдельную главу. Известны три основные системы. Ультрафиолетовая абсорбционная система издавна используется для наблюдения за движением границы раствор — растворитель. Она существует в однолучевом и двухлучевом вариантах с регистрацией, осуществляемой путем фотографирования или при помощи самописца. Существуют еще рефрактометрические системы шлирен-система Филпота — Свенссона и интерференционная система Рэлея. В настоящее время распространены все три системы, но в будущем, вероятно, главенствующее положение займут новейшие двухлучевые абсорбционные системы с фотоэлектрическим умножителем и самописцем. [c.39]

В обзоре Гостинга [19] детально описаны различные методы определения величины О. Наблюдение за процессом диффузии при помощи шлирен-оптики не дает достаточно высокой точности, однако мы рассмотрим именно этот метод, поскольку он основан на использовании оптической системы ультрацентрифуги. Другие оптические системы, применяемые для очень точных исследований диффузии, обычно не входят в стандартное оснащение ультрацентрифуг. Между растворителем и раствором создается резкая граница. За ее постепенным расширением наблюдают при помощи той или иной оптической системы рефрактометрической со шкалой Ламма [23] в старых ультрацентрифугах или шлирен-системы в современных ультрацентрифугах. О деталях этих измерений читатель может прочесть в упомянутой работе Гостинга [1б]. Здесь же, чтобы не усложнять изложения, мы опишем наиболее распространенный указанный метод — метод определения О по максимальной ординате и площади, чаще всего сочетающийся со шли-рен-оптикой. При помощи этой оптической системы получают кривую, приведенную в нижней части фиг. 19. По мере развития диффузионного процесса максимальная ордината уменьшается, однако площадь пика во времени не изменяется. Площадь пика является мерой перепада концентраций на границе, который в течение опыта должен оставаться постоянным. Если принять X —О (положение границы), то экспоненциальный сомножитель в уравнении (IV. 17) обращается в единицу и это уравнение упрощается [c.77]

Макромолекулы почти нечувствительны к воздействию силы тяжести, однако в растворах, оставленных на длительное время в спокойном состоянии, постепенно возникает градиент концентрации. Сходное явление наблюдается в земной атмосфере, плотность которой, как известно, убывает с высотой. Седиментация под действием силы земного тяготения не нашла широкого применения при изучении макромолекул. Попытки использовать центрифугирование для очистки и идентификации белков оставались безуспешными вплоть до 1923 г., когда Сведберг и Ни-кольс сообщили о разработанной ими высокоскоростной центрифуге. Эта центрифуга содержала остроумно сконструироранное устройство, которое позволяло пропускать свет через кювету с образцом и регистрировать движение границы расположения макромолекул. Высокоскоростные центрифуги сведберговского типа получили название аналитических ультрацентрифуг в отличие от других высокоскоростных центрифуг, в которых отсутствует оптическая система. Устройство современной аналитической ультрацентрифуги схематически показано на рис. 7.14. Поскольку к изучаемому раствору нет прямого доступа, его концентрацию определяют оптическими методами. Если через кювету пропускается ультрафиолетовое излучение, то почернение фотографической пленки, установленной позади кюветы, будет тем меньше, чем выше концентрация макромолекуляр-ного соединения в растворе. При использовании рефрактометрических методов положение границы будет соответствовать пику, природу которого мы рассмотрели при объяснении рис. 7.13. Третий метод слежения за границей основан на использовании интерферометра, позволяющего определить положение и концентрацию растворенного вещества. Подсчитывая число интерференционных полос, можно определить концентрацию с точностью порядка 0,1%. [c.409]

Рис. 7.14. Оптическая система (Л) и сборные детали кюветы (Б) ультрацентрифуги Спинко, модель Е.

Коэффициенты диффузии. Коэффициенты диффузии почти всех биологических макромолекулярных препаратов были определены методом свободной диффузии, при котором наблюдают изменение во времени формы первоначально резкой границы между раствором и чистым растворителем. При этом используют шлирен- или интерференционную оптические системы. Исчерпывающее квалифицированное изложение этого вопроса содержится в обзоре Гостинга [53]. Две доступные интерферометрические системы (Гои [126—128] и Релея [129—132]) обеспечивают высокую степень прецизионности. Шлирен-оптика также дает точность, достаточную для многих целей. При изучении более вязких гликонротеинов основная практическая трудность состоит в создании хорошей первоначальной границы при соблюдении этого условия нет необходимости в очень высокой точности измерений. Эта трудность в известной степени может иметь место при применении для измерения диффузии ячейки ультрацентрифуги для искусственного образования границы. Очень резкие и симметричные границы позволяют проводить определения при малом расходовании изучаемого вещества. Ультрацентрифуга нри подобных экспериментах должна работать на низких скоростях вращения ротора, чтобы не происходило перераспределение компонентов полидисперсной смеси [133] и не было обострения границы за счет седиментации. Если благодаря высокому коэффициенту седиментации это невозможно, тогда Т) можно определить при различных скоростях вращения ротора и экстраполировать полученные данные к нулевой скорости вращения ротора [134]. [c.61]