Ультрацентрифуги ячейки

С е д и м е н т а ц и о н н ы й м е т о д определения молекулярного веса полимера основан на установлении седимента ционного равновесия в растворах полимера. Раствор полимера фракционируют в ультрацентрифуге и одновременно определяют молекулярный вес каждой фракции полимера, т. е. из каждого слоя раствора после его расслаивания. Для этого определяют скорость седиментации каждой фракции исследуемого полимера (в растворах с известными концентрациями). Измерение скорости седиментации основано на наблюдении за передвижением границы раздела между раствором и растворителем в ячейке центрифуги. По данным наблюдений строят график изменения скорости седиментации при различной концентрации и определяют по этому графику константу седиментации 5 данного полимера при бес конечном разбавлении его раствора. Одновременно определяют константу диффузии полимера при бесконечном разбавлении. Молекулярный вес каждой фракции вычисляют по следующему уравнению [c.80]

Первые роторы были круглыми, что лучше обеспечивает установление теплового равновесия. Такая форма ротора и сейчас используется в некоторых современных ультрацентрифугах, однако при высокоскоростном центрифугировании стали применять роторы овальной формы, в которых напряжение распределяется более равномерно. Для материала, из которого изготавливается ротор, существенна величина отношения прочности на разрыв к удельной массе материала. Следует, однако, иметь в виду, что существует определенный предел, меньше которого ячейка весить не должна. Именно по этой причине роторы Сведберга были сделаны из стали, а не из алюминиевых сплавов, уже известных в то время. Однако другие конструкторы (их имена будут упомянуты ниже) предпочли тем не менее роторы, сделанные из сплавов алюминия. [c.21]

Рис. 5. Ультрацентрифуга (ячейки и ротор).

При разработке ультрацентрифуги диктующим обстоятельством является конструкция ячейки. Для устранения столкновений седиментирующих частиц со стенками ячейки необходимо, чтобы полости, в которые заливается исследуемое вещество, имели секториальную форму. Однако в случае опытов по седиментационному [c.20]

Из других методов определения молекулярного веса наиболее надежным является метод седиментации.в ультрацентрифуге [39]. Для определения полимеров с молекулярным весом в пределах от 10000 до 30 000 может быть использована техника седиментацион-ного равновесия [40, 41]. По скорости седиментации полисахарида или по степени распределения его в центрифужной ячейке в равновесных условиях можно вычислить молекулярный вес и установить степень его полидисперсности [21, 40]. [c.148]

Это соотношение описывает распределение концентраций частиц вдоль оси пробирки при установлении равенства встречных потоков диффузии и седиментации, т. е. при седиментационном равновесии. Нетрудно видеть, что, измеряя концентрацию исследуемого вещества вдоль ячейки после установления равновесия (это можно сделать в аналитической ультрацентрифуге), легко определить молекулярную массу полимера. Действительно, из (18.20) следует, что если концентрация исследуемого полимера в точках, находящихся на расстоянии r и Га от оси ротора, равна соответственно i и Сг, то [c.336]

Кривая построена по данным, полученным с помощью равновесной ультрацентрифуги г — О соответствует верхней границе раствора, г — 6,25 — дну ячейки. [c.64]

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

Ультрацентрифуга была создана Сведбергом около 30 лет назад специально для того, чтобы создать большую, чем сила тяжести, седиментационную силу. Она состоит из ротора, вращающегося вокруг оси с высокой постоянной скоростью. В этот ротор помещается на некотором расстоянии от оси вращения небольшая ячейка, в которую наливают изучаемый раствор. Центробежная [c.299]

Ультрацентрифуги с верхним пределом скорости вращения 60 000 об/мин, и имеющие ячейку, расположенную на расстоянии 6 см от центра вращения, дают увеличение силы тяжести в 250 000 раз. [c.129]

Движение макромолекул в ячейке ультрацентрифуги описывается, исходя из баланса сил трения, центробежных сил с учетом архимедова множителя и сил случайного, диффузионного движения. В условиях равновесия = 0 можно по вели- [c.183]

Вкладыш кюветы (рис. VI 1.12) изготовлен из инертного материала, например, фторопласта и имеет две емкости в виде сквозных полостей шириной 6—12 мм, высотой 30 мм и длиной по ходу оптического луча 5—50 мм. В нижней части (и только в нижней, в отличие от седиментационных вкладышей) полости соединены капилляром малого сечения (0,01—0,1 мм ), выполненным в массе вкладыша на одном из его торцов. Если в седиментационной ячейке уровни жидкости выравниваются за счет перетекания из одного сектора в другой под действием центробежного поля ультрацентрифуги, то в данной кювете перетекание и подслаивание достигается изменением давления воздуха в одной из полостей вкладыша. [c.172]

Основной частью ультрацентрифуги является ротор, способный вращаться с очень большой скоростью в термостатируемой вакуумной камере. В роторе имеются две ячейки для кюветы с раствором и для противовеса. Возникающий в кювете градиент распределения концентрации макромолекул за счет центробежных сил обусловливает соответствующее распределение величины показателя преломления, которое регистрируется оптическим методом. Коэффициент седиментации 5 определяют по градиенту концентрации [c.156]

Автор не имеет личного опыта работы на аналитической ультрацентрифуге MSE, однако ему часто приходилось слышать хорошие отзывы о плавности вращения ротора этой машины даже при малых скоростях. Изготовители указывают, что это позволяет очень точно определять коэффициент диффузии с использованием ячейки для образования искусственной границы. Оптика и камера ротора размещены на удобной для оператора высоте. [c.33]

Ультрацентрифуга устроена следующим образом. На ось насажен ротор (рис. 7) из никелированной стали, вращающийся со скоростью 18 000—130 000 об/мин. При этом развивается центробежная сила, в 16 000 — 70 000 раз превышающая силу земного притяжения. В теле ротора установлена стеклянная ячейка высотой 6—12 мм. К ячейке подведена трубка, снабженная оптическими приборами, дающими возможность периодически фотографировать происходящее в ячейке. [c.57]

Ротор ультрацентрифуги представляет собой стальной или дюралюминиевый диск (рис. 5). В двух отверстиях в роторе (см. рис. 5) помещены две маленькие ячейки. В одной из них находится центрифугируемый раствор, в другой, уравновешивающей, ячейке — чистый растворитель. Вся эта конструкция закреплена и вращается с большой скоростью. В первых моделях ультрацентрифуги диск был насажен на простую ось в обычном подшипнике и приводился во вращение маленькой масляной турбиной на конце оси. Если вращение с большой скоростью происходит на воздухе, то ротор сильно разогревается, что нарушает процесс осаждения частиц и делает невозможным точные измерения их движения. Поэтому в некоторых современных моделях ротор ультрацентрифуги вращается в атмосфере водорода при пониженном давлении для охлаждения. В других конструкциях вращение осуществляется воздушной турбиной, [c.51]

Клинообразные окошки. В одном опыте можно ультрацентрифуги-ровать сразу четыре ячейки (по методу, впервые предложенному В. Ши-бальским). Благодаря применению призматических окошек с боковым скосом, отклоняющим вправо или влево проходящий через ячейку пучок света, можно получить снимки каждой из ячеек по отдельности. Эти окошки можно подобрать таким образом, что пучок света, прошедший через ячей- [c.176]

При конструировании ультрацентрифуг — приборов, в которых исследуемый раствор вращается со скоростями вплоть до 70 ООО об/мин, было проявлено немало изобретательности. На рис. 11.2 дано схематическое изображение аналитической ультрацентрифуги. Образцы находятся в ячейках или пробирках (рис. 11.3) в алюминиевом или титановом роторе, приводимом в движение с помощью электромотора. При обычно используемых скоростях трение между вращающимся ротором и воздухом может вызвать недопустимый разогрев ротора. Поэтому в камере, в которой вращается ротор, необходимо создать высокий вакуум. Чтобы избежать конвекционного перемешивания, температура исследуемого образца должна поддерживаться на постоянном уровне с довольно высокой степенью точности, а это может быть нелегкой задачей. Силы, которые развиваются внутри ротора, — огромны, и случается, что при больших скоростях ротор разлетается [c.224]

Сведберг воспользовался центробежной силой в своем методе определения молекулярного веса коллоидных веществ с помопдью седиментации. Ультрацентрифуга состоит в основном из ротора М (рис. 2), приводимого в движение двумя одинаковыми масляными турбинами Т, несущими прозрачную ячейку С, в которую помещена изучаемая дисперсия. Степень седиментации может быть измерена как колориметрически, так и рефрактометрически или путем поглощения ультрафиолетовых лучей. В последнем случае пучок света Ь пропускается через ячейку в камеру Р необходимая экспозиция достигается с помощью электромагнетически регулируемых щитков и Е2, которые пропускают свет только в короткий промежуток времени, когда ячейка попадает в световой поток при каждом обороте турбинки. [c.117]

Существует несколько выпускаемых промышленностью приборов, с помощью которых можно определять молекулярные веса полимеров путем исследования равновесного распределения молекул в центробежном поле. Для иллюстрации рассматриваемого метода будут описаны типичные результаты, полученные в Национальном бюро стандартов [131] на модифицированной равновесной ультрацентрифуге Сведберга. Этот прибор снабжен оптической системой Лэмма, которая позволяет непосредственно измерять радиальный градиент показателя преломления. В любой точке ячейки смещение линии шкалы пропорционально градиенту концентрации в этой точке. [c.63]

Аналитическое центрифугирование основано на зависимости скорости седиментации макромолекул от их молекулярной массы в центробежном поле ультрацентрифуги. Под действием центробежной силы в начальный момент макромолекулы седиментируют в ячейке ультрацентрифуги с разными скоростями — более тяжелые быстрее. Появ.чяется полоса раздела между раствором и чистым растворителем, в которой оптическими методами можно зарегистрировать отставание малых молекул от больших ультрацентрифуга работает как масс-спектрометр, превращая спектр масс в спектр смещений. По этому спектру получают распределение по седиментационным коэффициентам, которое пересчитывают в распределение по молекулярным массам [114]. [c.26]

В 1923 г. Сведберг создал первую ультрацентрифугу, за которую он получил в 1926 г. Нобелевскую премию. В дальнейшем конструкция ультрацентрифуг была усовершенствована в частности, вместо масляных и воздушных турбин в них стали применять электрические приводы. В настоящее время обычно применяются дюралюминиевые роторы эллипсоидальной формы, что позволяет уменьшить их вес и предотвратить локализацию напряжений на отверстиях для ячеек. Скорость вращения достигает 60 ООО об/мин. В современных ультрацентрифугах вставки в ячейках имеют рабочие полости секториальной формы, что сводит к минимуму конвекцию седиментируемого материала. [c.184]

Если ультрацентрифуга вращается достаточно долгое время со скоростью порядка 8000—15000 об1мин, то скорость переноса веществ за счет седиментации будет мала и соизмерима со скоростью переноса за счет диффузии. В результате через определенный промежуток времени достигается равновесное распределение концентраций во всей ячейке. Скорость переноса растворенного белка через поверхность поперечного сечения А за счет центробежной силы равна с-А-йх/сИ. Скорость диффузии через ту же поверхность по закону..Фика составляет — 0-А-(1с1(1х. Как следует из уравнения (35), скорость кх1(И равна центробежной силе, деленной на коэффициент трения (<р//). Отсюда результативная скорость движения белка [c.148]

В настоящее время отдают предпочтение двухлучевой системе, хотя она очень дорога. В этом случае в нижней части ультрацентрифуги Be kman размещается монохроматор. Система фотоэлектрического сканирования, работающая на принципе раздвоенного луча, позволяет сравнивать раствор исследуемого вещества и чистый растворитель, находящиеся в разных секторах двухсекторной ячейки (фиг. 12 и 16). Такая ячейка аналогична двум кюветам (образец и контроль), используемым в обычной спектроскопии. Перед каждым сканированием регистрируются калибровочные сигналы, охватывающие диапазон оптических плотностей от О до 1 или от О до 2. Сканирование можно проводить с тремя различными скоростями, а поглощение, отвечающее растворителю, автоматически вычитается из показаний для раствора. Эта система позволяет также получить производную от кривой изменения концентрации. Сканирующую систему можно использовать для определения молекулярной массы методом седиментационного равновесия с хорошей точностью при малых концентрациях, что особенно важно для получения экстраполированных к нулевой концентрации идеальных значений. [c.42]

Фиг. 17. Расстояния (д ) пика от оси вращения находят по полосам на седиментационной диаграмме, получающимся от индексных отверстий в балансировочной ячейке. Расстояния даны для ультрацентрифуги Be kman.

ДЛЯ стабильного вращения при малых скоростях. Фирма MSE также обеспечивает очень стабильное центрифугирование при малых скоростях. По данным этой фирмы, в ультрацентрифуге MSE можно определять коэффициенты диффузии с точностью, сравнимой с точностью измерений на стационарных приборах. Для диффузионных (и других) измерений эта фирма поставляет ячейки для искусственного образования границы с длиной оптического пути 20 мм. Имеются две модификации метода получения искусственной резкой границы между раствором и растворителем наслоение растворителя на раствор и подслаивание раствора под растворитель. Для работы с интерференционной оптикой или для наложения на изображение диффузионного пика базальной линии (при помощи шлирен-системы) применяется двухсекторная ячейка. Поскольку изучение диффузии в ультрацентрифуге осуществляется в ячейке с рабочей полостью секториальной формы, исследуемая граница несколько искривляется. Это, однако, не мешает анализировать результаты методом максимальная ордината — площадь , так как на высоту пика это искривление практически не влияет. Подобное искажение границы может также вызываться изменением величины D, происходящим при изменении концентраций, но этот эффект, как правило, невелик. Чаще всего искривление границы связано с дефектами ее формирования в самом начале. Введение небольшой поправки на начало отсчета времени служит и для частичной компенсации этих искажений. [c.81]

Фиг. 25. Данные опыта [8] с бычьим сывороточным альбумином с применением многоканальной ячейки и аналитической ультрацентрифуги Be kman, модель Е. Приведена зависимость Igy от х , где г/ — вертикальное смещение полосы и х — расстояние до оси

Непосредственно наблюдать вызываемое скоростной стадией опыта перемещение систе.мы полос ко дну ячейки удобно при помощи передвигаемой фотопластинки с узкой диафрагмой, как в ультрацентрифуге Be kman, что дает возможность на одной фотопластинке совмещать большое число последовательных изображений узкой зоны ячейки. [c.114]

Другие методы. Ультрацентрифуга используется также для определения молекулярного веса методом приближения к равновесию , который был теоретически разработан Арчибальдом [42] и получил дальнейшее развитие в работах Кегелеса [43]. При этом методе условие равновесия, т. е. такое состояние, при котором пет переноса вещества через сечение ячейки, фактически выполняется на линии мениска и на линии дна. Главный недостаток метода Арчибальда состоит в том, что для величин молекулярного веса, значительно превышающих 100 ООО, он не точен. В применении к РНК он оказался весьма полезным для определения молекулярного веса тРНК. Полное описание этого метода имеется в обзоре Шахмана [38]. [c.265]

Один из способов расчета молекулярной массы белков при йомощи метода приближения к равновесию можно проиллюстрировать на следующем эксперименте. Температура опыта составляла 293 К, скорость вращения— 24 630 об/мин, величина v принята равной 0,74 мл/г, а плотность растворителя — единице. Фазовую пластинку для проведения эксперимента по методу Арчибальда устанавливали под углом 70° (ультрацентрифуга Be kman), так же как для опыта с ячейкой для искусственного образования границы, поэтому угол фазовой пластинки в расчет не входит. Общий коэффициент увеличения F изображения от ячейки до фотопла- [c.122]

Это обычное центрифугирование без применения градиента плотности. Растворенные компоненты, вначале равномерно распределенные по всему объему ячейки, седиментируют каждый со своей скоростью ко дну ячейки, вызывая перемещение соответствующей границы, что позволяет следить за ходом эксперимента. В аналитической ультрацентрифуге этот процесс можно наблюдать по перемещению шлирен-пиков. [c.181]

Улътрацентрифуга. Аналитическая ультрацентрифуга фирмы Spin-со (модель Е) оборудована ультрафиолетовой оптикой, вращающейся диафрагмой и синхронизирующим устройством, задающим время при работе с двумя и четырьмя ячейками. Для работы с двумя ячейками используется ротор An-D или эквивалентный ему титановый ротор Ап-Н для опытов с 4 ячейками требуется ротор An-F и соответствующая диафрагма для конденсорной линзы. Заглушку из реперного отверстия в роторе и контрбаланс перед работой необходимо удалить. [c.175]

Чтобы уменьшить время работы ультрацентрифуги, Ифантис [41] предложил использовать ячейку с 6 отдельными камерами, что дает возможность работать сразу с тремя концентрациями образца. Эти ячейки теперь имеются в продаже, однако работать с ними труднее, чем с обычными ячейками. В статьях Ифантиса можно найти подробное описание методики работы и изложение теоретических основ данной модификации метода равновесного ультрацентрифугирования. [c.265]

Сейчас можно по анализу формы кривой подвижной границы в ультрацентрифуге получить данные о степени полидисперспости по коэффициентам седиментации и описать их распределение. Это может быть достигнуто путем улучшенной регистрации границы в результате введения фазовой пластинки и точного установления положения базальной линии благодаря использованию двухсекторной ячейки. Эти два фактора позволяют определить йс/йг и, после интегрирования, с как функцию от г в зоне границы, причем точность будет достаточно высока для того, чтобы стало возможным применение недавно разработанной теории, связывающей эти параметры с распределением коэффициентов седиментации. Математически эта теория сложна [91, 118], и для ее использования требуется много точных измерений, расчетов и экстраполяций. Наблюдаемая градиентная кривая может быть пересчитана в кривую, описывающую функцию распределения коэффициентов седиментации (я), путем введения поправок к каждой точке наблюдаемой кривой, как это описано Зингером и Гроссом [119]. Последующая экстра- [c.60]

Коэффициенты диффузии. Коэффициенты диффузии почти всех биологических макромолекулярных препаратов были определены методом свободной диффузии, при котором наблюдают изменение во времени формы первоначально резкой границы между раствором и чистым растворителем. При этом используют шлирен- или интерференционную оптические системы. Исчерпывающее квалифицированное изложение этого вопроса содержится в обзоре Гостинга [53]. Две доступные интерферометрические системы (Гои [126—128] и Релея [129—132]) обеспечивают высокую степень прецизионности. Шлирен-оптика также дает точность, достаточную для многих целей. При изучении более вязких гликонротеинов основная практическая трудность состоит в создании хорошей первоначальной границы при соблюдении этого условия нет необходимости в очень высокой точности измерений. Эта трудность в известной степени может иметь место при применении для измерения диффузии ячейки ультрацентрифуги для искусственного образования границы. Очень резкие и симметричные границы позволяют проводить определения при малом расходовании изучаемого вещества. Ультрацентрифуга нри подобных экспериментах должна работать на низких скоростях вращения ротора, чтобы не происходило перераспределение компонентов полидисперсной смеси [133] и не было обострения границы за счет седиментации. Если благодаря высокому коэффициенту седиментации это невозможно, тогда Т) можно определить при различных скоростях вращения ротора и экстраполировать полученные данные к нулевой скорости вращения ротора [134]. [c.61]

Методы равновесия и приближения к равновесию. Классический метод седиментациоппо-диффузионпого равновесия [102] требует весьма большой продолжительности эксперимента (порядка нескольких недель) для достижения полного равновесия. Поэтому этот метод представляет главным образом теоретический интерес. Недавно вопрос о времени, необходимом для достижения равновесия в ультрацентрифуге, был рассмотрен вновь [137]. Оказалось, что это время определяется прежде всего высотой слоя жидкости и коэффициентом диффузии изучаемого вещества. Путем уменьшения слоя раствора в ячейке до 1—3 мм для веществ с не очень низкими коэффициентами диффузии время достижения равновесия удалось сократить до одного дня, а при высоте слоя порядка 0,7 мм большинство веществ, за исключением крупных эпителиальных гликопротеинов, становятся доступными для исследования [151]. Такие тонкие слои получают путем нанесения тонкого слоя раствора на относительно тяжелую прозрачную не смешивающуюся с водой органическую жидкость. Время, необходимое для достижения равновесия, лучше всего вычислять но уравнению Ван-Хольда и Болдуина однако для этого необходимо приблизительно знать молекулярный вес и коэффициент диффузии. Если такие сведения отсутствуют, оценку критериев равновесия можно нолучить [152] из графика зависимости [c.65]

Крайне важно, чтобы ротор был механически сбалансирован. Допустим, что массы двух ячеек с веществом, расположенных симметрично относительно оси ротора, различаются на 1 мг. При 400 000 возникщая за счет этого разность сил, действующих на ротор, составит 400 г. Это весьма ощутимая сила, которая приведет к вибрации ротора. Но, как ни важно уравновесить ячейки, это нельзя сделать идеально. Поэтому в любой ультрацентрифуге используется гибкий вал, чтобы ротор мог сам найти точное положение своего центра масс и вращаться вокруг оси, проходящей через этот центр. В случае аналитических роторов это позволяет уравновешивать образцы с допуском 0,5 г без нежелательных последствий. [c.226]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология