Методы гидролиза нуклеиновых кислот

МЕТОДЫ ГИДРОЛИЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.441]

Количественное определение нуклеиновых кислот. Принцип метода основан на выделении рибонуклеиновых (РНК) и дезоксирибонуклеиновых (ДНК) кислот и на дальнейшем их анализе прямыми и косвенными методами. К прямым методам относятся такие, которые включают гидролиз нуклеиновых кислот с последующим выделением из гидролизатов пуринов и пиримидинов и определение их хроматографическим методом. Хроматография позволяет производить точный микроанализ нуклеиновых кислот. Исследование пуринов и пиримидинов проводят в ультрафиолетовом свете, наблюдая флуоресценцию пятен на хроматограммах или в экстрактах, полученных из соответствующих участков хроматограмм. Кроме хроматографического метода, применяют также способ электрофореза на бумаге. [c.60]

В последние 15 лет были разработаны различные хроматографические методы, позволяющие фракционировать высокомолекулярные нуклеиновые кислоты для этой же цели применяют электрофорез. Хроматографией на бумаге и другими распределительными методами, а также ионообменной хроматографией удалось выделить продукты гидролиза нуклеиновых кислот. Определяя концентрации выделенных оснований, нуклеозидов, моно- и олигонуклеотидов, в настоящее время проводят количественный анализ с очень небольшим количеством гидролизата. [c.437]

Распределительную хроматографию на бумаге используют в качестве быстрого стандартного метода анализа нуклеиновых кислот. Ионообменная хроматография на колонках (см. стр. 446) нашла применение прежде всего для препаративного выделения мононуклеотидов и высокомолекулярных продуктов гидролиза дезоксирибонуклеиновых кислот. Опыты по фракционированию на крахмале [26, 31] или на адсорбенте [55, 56] не привлекли достаточного внимания. [c.442]

Применение описанных здесь методов для анализа продуктов гидролиза нуклеиновых кислот пока неизвестно. [c.451]

Хроматографические методы, позволившие разделить продукты химического или ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот, сделали возможным в последние годы объяснение строения последних [14, 15, 44, 91]. Эти методы служат также для анализа мононуклеотидов [91, 92], олигонуклеотидов и смесей полинуклеотидов, получающихся при химическом синтезе [36, 44, 45, 90] или под действием ферментов [50, 65, 66). [c.451]

Метод ХТС облегчает открытие еще неизвестных пуринов и пиримидинов [1, 971, а также их нуклеозидов и нуклеотидов [20, 27] в продуктах гидролиза нуклеиновых кислот. [c.451]

Помимо рассмотренных выше реакций замещения аминогрупп оснований (в составе нуклеозидов и нуклеотидов) следует отметить дезаминирование под действием щелочи и переаминирование. Эти реакции протекают при бо ее жестких условиях, однако представляют определенный интерес. Щелочной гидролиз нуклеиновых кислот является одним из наиболее распространенных методов их анализа, и данные по дезаминированию оснований в условиях гидролиза необходимы для правильной оценки нуклеотидного состава. При условиях гидролиза (обычно действие 0,3 н. щелочи, 37° С, [c.353]

Нуклеотиды. 2, 3 -Нуклеотиды получают при щелочном гидролизе нуклеиновой кислоты. В связи с тем, что в состав молекул нуклеотидов входят фосфатные РО4-ГРУППЫ, имеющие сильнокислый характер, они находятся в растворах в виде анионов. Таким образом, разделение этих веществ следует проводить методом ионообменной хроматографии. В состав молекул входят также ароматические хромофоры, которые обычно сильно поглощают в ультрафиолетовой области. Поэтому для регистрации компонентов на выходе из колонки был выбран ультрафиолетовый (УФ) детектор. Молекулы анализируемых веществ сильно отличаются по своим [c.203]

В течение многих лет результаты трудоемких и весьма грубых анализов нуклеиновой кислоты, проведенных первыми исследователями, указывали, как полагали, на эквимолекулярные отношения двух пуриновых (аденин и гуанин) и двух пиримидиновых (урацил и цитозин) оснований. Позже применение хроматографии на бумаге [222] и, в меньшей степени, ионообменной техники дало быстрые и относительно точные методы количественного определения компонентов рибонуклеиновых кислот. При гидролизе нуклеиновой кислоты щелочью образуются мононуклеотиды, которые могут быть затем разделены либо как таковые, либо в виде нуклеозидов, после дефосфорилирования. Кислотный гидролиз, напротив, дает пуриновые основания и пиримидиновые мононуклеотиды. Спектрофотометрическое определение подвергнутых разделению компонентов после элюирования их с бумаги (с применением электрофореза [223] или хроматографии) или с ионообменной смолы позволяет получать молярные соотношения оснований. [c.404]

Определение молекулярного веса нуклеиновых кислот (полинуклеотидов) седиментационным методом на ультрацентрифуге дает величины от 200 ООО и менее до нескольких миллионов. При полном гидролизе нуклеиновых кислот ядра клетки установлено наличие трех групп составных частей этих так называемых дезоксирибонуклеиновых кислот (они обычно обозначаются как ДНК). Это — фосфорная кислота, Д-2-дезоксирибоза (т. е. Д-рибоза, у которой второй углеродный атом несет второй водородный атом вместо гидроксила, кн. I, стр. 461) и смесь четырех гетероциклов двух пуриновых — аденина и гуанина и двух пиримидиновых — тимина и цитозина (см. стр. 349, 361). Полный гидролиз нуклеиновых [c.711]

Для количественного определения нуклеиновых кис лот в культурах бактерий по описанным ниже методи кам необходимо, чтобы клетки присутствовали в доста точном количестве в среде, не мешающей определению или чтобы их можно было собрать из ростовой среды отмыть от компонентов среды, мешающих определению и ресуспендировать в нужной концентрации в отсутст вие лизиса бактерий или гидролиза нуклеиновых кислот нуклеазами. Важным условием для точного определения содержания в них нуклеиновых кислот является полная экстракция нуклеиновых кислот из клеток. [c.334]

Изучение деструкции биологических полимеров — белков, нуклеиновых кислот, целлюлозы и др. — является одним нз важнейших методов исследования состава и строения этих полимеров. Деструкция полимеров используется для получення мономеров из природных полимеров, например для получения аминокислот и нуклеотидов. Наконец, изучение кинетики и механизма деструкции биологических полимеров под действием ферментов представляет большой интерес в связи с тем, что эти процессы являются важными звеньями обмена веществ в живых организмах. Поскольку все важнейшие природные полимеры получаются путем поли конденсации, то их деструкция, представляющая собой обратный процесс, идет путем гидролиза этих полимеров. [c.436]

Нуклеиновые кислоты представляют собой высокомолекулярные гетерополимеры, которые в результате гидролиза дают эквимолярную смесь гетероциклических аминов, пентозы и фосфорной кислоты. Молекулярная масса этих гигантских молекул достигает десяти миллионов. Неустойчивость их структуры долгое время не позволяла химикам выделить неповрежденные гомогенные нуклеиновые кислоты. К счастью, современная химия располагает достаточно совершенными методами, которые дают возможность выделить интактную нуклеиновую кислоту из смеси нуклеиновых кислот. [c.466]

После получения нуклеиновых кислот в чистом виде их подвергают гидролизу для изучения химического состава. Для этих целей используют ферментативные методы (экзо- и эндонуклеазы), а также чисто химические методы гидролиза, в частности нагревание нуклеиновых кислот с хлорной кислотой. [c.97]

Различия в высшей структуре нуклеиновых кислот легко обнаруживаются по гиперхромному эффекту после тепловой или химической денатурации или после химического или ферментативного гидролиза. Важную информацию можно также получить при помощи других аналитических методов о гетерогенности по мол. массам, химическом составе и размерах молекул — методами ультрацентрифугирования [19, 35], о соответствии (комплементарности) первичной последовательности в двух полинуклеотидах— методами гибридизации [36, 37], о размерах и [c.68]

Метод, используемый в химии белков, иллюстрирует общие принципы ионообменной хроматографии, которые применимы также и к изучению других объектов, например нуклеиновых кислот. На первой стадии анализа белок гидролизуют 6 М соляной кислотой при 110°С в течение 12 ч или более. При этом бе- [c.373]

Определение содержания фосфора и азота всегда имело большое значение для анализа нуклеиновых кислот. Для идентификации и количественного определения пурина и пиримидина в продуктах гидролиза нуклеиновых кислот использовали полупрепаративные методы выделения, различные цветные реакции, а также полярографию и микробиологические методы. В настоящее время эти методы анализа, за редким исключением, представляют только исторический интерес. [c.437]

Метод фотокопий [57] для локализации и регистрации производных нуклеиновых кислот непригоден в случае пластинок с нанесенными на них слоями [72]. Цветные реактивы, употребляемые в хроматографии на бумаге-продуктов гидролиза нуклеиновых кислот, до настоящего времени не применялись для тонкослойных хроматограмм. Все реактивы, служащие для обнаружения пентоз в нуклеозидах и 5-нуклеотидах, а также реактивы, реагирующие с эфирами фосфорной кислоты, являются весьма ценным дополнением к методу обнаружения в УФ-свете. Реактив тетраацетата свинца [9] должен быть пригоден для обнаружения нуклеозидов и нуклеотидов на тонкослойных хроматограммах для обнаружения нуклеотидов должна быть пригодна также реакция Хейнса и Ишервуда [37]. [c.444]

Описанные здесь методы разделения еще не применялись для анализа продуктов гидролиза нуклеиновых кислот, однако вполне вероятно, что метод ХТС скоро заменит бумажнохроматографические методы анализа. [c.446]

Для оптимального разделения продуктов гидролиза нуклеиновых кислот на колонках с ионообменными смолами необходим градиент элюирования, т. е. непрерывное или ступенчатое изменение концентрации ионов или pH вымываюш его раствора или того и другого. Рандерат [73] сообш ает, что на ионообменном слое из модифицированной целлюлозы (эктеола или ДЭАЭ) можно добиться разделения, наблюдаемого на колонках с ионообменной смолой (дауэкс) только при применении градиента элюирования. Этот автор предполагает, что при использовании метода ХТС вследствие фронтального разделения растворителя на слое возникает градиент, которым и объясняется хорошее разделение . [c.447]

Практические методы получения продуктов гидролиза нуклеиновых кислот подробно описаны в сборнике, изданном под редакцией Коловика и Каплана [44]. [c.25]

Хотя на данном этапе методы химического гидролиза не позволяют сделать выбора между 3 —5 - и 2 —5 -межнуклеотидными связями, доказательства, по-видимому, исключительного присутствия 3 —5 -структуры были получены на основании исследований ферментативного гидролиза рибонуклеиновых кислот и простых нуклеотидных производных. Из различных источников был выделен ряд нуклеаз, которые катализируют гидролиз нуклеиновых кислот на более мелкие фрагменты. Панкреатическая рибонуклеаза [93] — один из группы ферментов, обнаруживающих высокую специфичность к рибонуклеиновым кислотам,— была тщательно изучена и дано объяснение механизма ее действия. Ранние исследования показали, что фермент действует по пиримидиннуклеозидным звеньям, так как крупные педиализуемые остатки после ферментативного расщепления рибонуклеиновой кислоты значительно обогащены пуринами [94] кроме того, выделяются пиримидиновые мононуклеотиды, но не обнаружено свободных пуриновых мононуклеотидов [75, 95, 96]. Дальнейшие исследования кислотного или щелочного гидролиза продуктов, полученных в результате последовательной обработки рибонуклеиновой кислоты рибонуклеазой и фосфомоноэстеразой предстательной железы, привели к заключению, что специфичность рибонуклеазы такова, что нуклеиновые кислоты расщепляются ею с образованием смеси пиримидиновых мононуклеотидов и пуриновых олигонуклеотидов, содержащих в качестве концевой единицы пиримидиновый нуклео-зид-2 (или 3 )-фосфат [75, 97]. [c.377]

Этот метод был впервые описан Ружицким и Найтом [40], которые использовали его для изучения продуктов ферментативного гидролиза нуклеиновой кислоты, выделенной из вируса табачной мозаики. Петер- [c.23]

Определение молекулярного веса нуклеиновых кислот (полинуклеотидов) седиментационным методом на ультрацентрнфуге дает величины от 200 000 и менее до нескольких миллионов. При полном гидролизе нуклеиновых кислот ядра клетки уста1Ювлено наличие трех групп составных частей этих так называемых дезоксирибонуклеиновых кислот (они обычно обозначаются как ДНК). Это — фосфорная кислота, D-2-дез-оксирибоза (т, е. й-рибоза, у которой второй углеродный атом несет второй водородный атом вместо гидроксила, кн. I, стр. 432) и смесь четырех гетероциклов двух пуриновых — аденина и гуанина и двух пиримидиновых— тимина и цитозина (см. стр. 319, 329). Полный гидролиз нуклеиновых кислот клеточной плазмы, так называемых рибонуклеиновых кислот (РНК), также дает фосфорную кислоту, /)-рибозу (вместо )-дезоксирибозы) и смесь тех же аденина, гуанина, цитозина и, кроме того, урацила. Тимин (метильный гомолог урацила) в них отсутствует. [c.673]

Методы анализа фракций могут быть физическими, химическими и биологическими. Одним из лучших методов считается детектирование радиоактивных изотопов. Результаты измерений оформляют в виде кривой зависимости определяемой величины от объема злюата. По распределению пиков на хроматограмме судят о возможности объединения некоторых фракций, совершенно чистых, без примесей других компонентов. Методом ионообменной хроматографии можно разделять различные катионы и анионы, четвертичные аммониевые основания, амины, аминокислоты, белки, продукты гидролиза пептидов, физиологические жидкости, гидролизаты клеточных оболочек микробов, антибиотики, витамины, нуклеиновые кислоты. [c.361]

Данный метод является одной из модификаций метода Шмидта и Таннгаузера. Разделение РНК и ДНК в результате щелочного гидролиза осуществляется после предварительного выделения нуклеиновых кислот из биологического материала. [c.166]

О-Рибоза. О-Рибоза может быть получена из дрожжей путем гидролиза содержаш ихся в них нуклеиновых кислот [51 ]. Из 2 кг дрожжей можно получить 1—2 г чистой рибозы [52]. Синтетическим методом О-рибозу получают из глюкозы путем окисления ее в щелочной среде кислородом воздуха в арабоновую кислоту, эпимеризации последней, получения рибо-нолактона и восстановления последнего амальгамой натрия в )-рибозу [37, 53, 54]. [c.113]

Нуклеозиды могут быть получены прямым гидролизом нуклеияовы.х кислот, минуя стадию выделения мононуклеотидов и именно этим методом они обычно получаются в препаративных целях. Для этого нуклеиновые кислоты подвергаются химическому или ферментативному гидролизу. Обычно их нагревают с концентрированным аммиаком 3—3,5 часа при 175—180°. Ферментативный гидролиз НК вызывают специальные ферменты, называемые нуклеазами. Ввиду неустойчивости дезоксирибозы и дезоксирибозидов при препаративном гидролчзе ДНК, с целью получения нуклеозидов успеха можно достигнуть только при ферментативном гидролизе. [c.190]

Главная трудность при поисках метода последовательной деструкции полимерной цепи нуклеиновых кислот заключается в том, что при гидролизе полимерная цепь нуклеиновой кислоты разрушается одновременно по всем фосфорноэфирным связям, так как специфичность гетероциклического основания не сказывается в достаточной мере на прочности этой связи. Последнее понятно, так как основание не связано непосредственно с фосфатной группой, а находящийся между ними остаток моносахарида не содержит кратных связей или каких-либо иных электропроводных группировок. [c.252]

В то время как основные типы РНК, обнаруживаемые в природе, являются однонитевыми нуклеиновыми кислотами, небольшая часть вирусов, например реовирусы, содержат РНК в виде двойной спирали. Эти РНК имеют такой состав оснований, в котором А = и и О = С. Они проявляют заметную устойчивость к гидролизу рибонуклеазами, если их не подвергать предварительной тепловой денатурации. Такие РНК могут быть выделены из растворов в виде нитей или же аналогичные нити могут быть приготовлены из препаратов синтетических двухцепочечных полимеров типа [(гА)-(ги)] и использованы для исследования методом диффракции рентгеновских лучей [63]. Данные рентгеноструктурного анализа свидетельствуют о том, что двухцепочечные РНК принимают спиральную форму, имеющую очень близкое сходство с /4-формой ДНК (наклон плоскости пар оснований к основной оси спирали около 10°, и на один виток спирали приходится 11 —12 оснований). Создается впечатление, что конформация такой /4-формы РНК, подобно /4-форме ДНК, диктуется формой углеводного кольца, находящегося в С-3-з/ (Зо-конформации. Вполне очевидно, что урацил может взаимодействовать с аденином столь же эффективно, как и тимин в образовании водородных связей. [c.60]

В выяснении первичной структуры РНК решающую роль сыграли методы ступенчатого гидролиза, осуществленного в основном экзонуклеа-зами и заключающегося в последовательном отщеплении по одному мононуклеотиду с одного конца молекулы нуклеиновой кислоты. Ниже представлена первичная структура первой РНК, имеющей 77 нуклеотидов, для которой была расшифрована нуклеотидная последовательность в 1965 г. Р. Холли и сотр., а именно аланиновой тРНК [c.106]

К непрямым (косвенным) методам относятся такие, в которых нуклеиновые кислоты определяют по количеству освобождаемого Н3РО4 в процессе их гидролиза и по количеству пентоз или по содержанию азота в нуклеиновых кислотах, определяемому методом Кьельдаля. [c.60]

В блочном методе определения последовательности нуклеиновых кислот весьма существенна методология структурного анализа. В одном из возможных вариантов используется полное расщепление полинуклеотидной цепи двумя (или более) ферментами с различной специфичностью. В случае РНК это может быть осуществлено различными рибонуклеазами, например гидролиз последовательно рибонуклеазой Т,, а затем — панкреатической рибонуклеазой. Структуры полученных олигонуклеотидов сравниваются для поиска перекрывающихся последовательностей Если это оказывается недостаточным, используется третья РНаза. [c.314]

Быстрые методы определения последовательности не решают всех задач, стоящих перед исследователем первичной структуры нуклеиновых кислот, поскольку они не дают информации о Положении и природе минорных компонентов нуклеиновых кислот- Такие задачи встречаются при изучении структуры тРНК. В этих случаях сохраняют свое значение старые методы определения последовательности, заключающиеся в исчерпывающем нли частичном гидролизе рибонуклеазами, выделении индивидуальных олигонуклеотидов, определении их клеотидного состава и идентификации минорных компонентов [c.329]

Расщепление К-гликозидиых связей. N-Гликoзидныe связи нук-леозидоа и нуклеотидов весьма устойчивы в нейтральной и щелочной средах и расщепляются при этих значениях pH только в жестких условиях. Однако они относительно лабильны в кислой среде, что послужило основой первых методов определения нуклеотидного состава нуклеиновых кислот (гидролиз хлорной кислотой в течение [c.395]

Подробный анализ процесса хроматографии нуклеиновых кислот и их продуктов гидролиза на ионообменнике был опубликован Коном [14, 22, 23], а также Собером и Петерсоном [81]. Рандерат впервые описал фракционирование низкомолекулярных осколков нуклеиновых кислот (нуклеиновых оснований, нуклеозидов и мононуклеотидов) на эктеола [68, 69, 73] и на слоях ДЭАЭ [72, 73]. Он установил, что нуклеотиды можно разделить методом ионообменной ХТС значительно быстрее и лучше, чем при использовании других методов кроме того, метод ХТС значительно чувствительнее метода хроматографии на бумаге. [c.447]

Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помошью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее характерных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела— с антигенами (против которых получены), а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т. д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография. [c.9]

Уже давно было обнаружено, что нуклеиновая кислота, полученная первоначально из дрожжей, содержит пентозу. Пользуясь не вполне безупречными методами, Левин [1] в 1909 г. идентифицировал эту пентозу как рибозу. В дальнейшем Гуланд [2] и его сотрудники с несомненностью установили, что пентоза в дрожжевой РНК представляет собой В-рибозу. Альдоновая кислота из сахара, полученного в результате гидролиза пуриновых нуклеотидов дрожжевой РНК, была превращена ими в соответствующий бензиминазол, легко поддающийся идентификации. [c.18]

Определению нуклеотидного состава нуклеиновой кислоты тем или иным методом должен предшествовать ее гидролиз. РНК и ДНК можно гидролизовать до входящих в них оснований обработкой 98%-ной муравьиной кислотой при 175° в течение 30 мин или 12 н. хлорной кислотой при 100° в течение 1 час [8, 9]. Ни один из этих методов не является строго количественным, поскольку в первом случае наблюдается низкий выход урацила, а во втором — разрушение части тимина. ДНК можно гидролизовать также обработкой 6 н. НС1 при 120° в течение 2 час, однако при этом теряется часть пуринов [25]. Удовлетворительный гидролиз РНК до смеси пуриновых оснований и пиримидиновых нуклеотидов достигается в результате нагревания с 1 н. соляной кислотой при 100° в течешге 1 час [5]. Количественный гидролиз РНК до нуклеозид-З -фосфатов легко вызвать обработкой 0,3 н. NaOH при 37° в течение 16 час. Следует избегать употребления слишком крепкой щелочи, чтобы не вызвать дезаминирования цитидиловой [c.29]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология