Методы концевой метки

До развития методов последовательной дегидратации пептидов и белков, ДНФ-метка Л -конца с последующим частичным гидролизом широко использовалась. Зоны, отвечающие пептидам, содержащим концевой ДНФ-остаток, можно выделить, разделить и анализировать аминокислоты после полного кислотного гидролиза. Таким путем можно устанавливать короткие последовательности. [c.266]

Позднее такие измерения проводили, наблюдая под микроскопом радиальное сжатие и соответствующее продольное удлинение образца [18]. Моноволокно растягивали между двумя подвижными зажимами, установленными на столике микроскопа. Для определения изменений длины на моноволокно наносили две чернильные метки. Дифракционные эффекты на концах образца уменьшали использованием иммерсионной жидкости. Метод обладает недостаточно высокой точностью, так как ошибки достигают 10% при доверительном интервале измеряемой величины, составляющем 95%. [c.218]

Определение коэффициента диффузии в растворах капиллярным методом. Вещество, содержащее радиоактивную метку, коэффициент диффузии которого хотят определить, помещают в капилляр, запаянный с одного конца. Капилляр помещают в [c.559]

Метод (г) дал на практике хорошие результаты. Пипетку наполняют жидкостью, вытирают кончик ее полотенцем или фильтровальной бумагой и дают жидкости осторожно стечь до метки, держа кончик пипетки у стенки сосуда, из которого был отобран раствор. Затем, держа пипетку вертикально и прикасаясь концом к стенке сосуда-приемника, дают жидкости вылиться. Когда ток жидкости прекратится, отнимают конец пипетки от стекла и ждут столько времени, сколько указано в прописи хода анализа, а если указаний нет, то по истечении 15 сек. снова прикасаются к стенкам сосуда . [c.15]

Пробу обрабатывают по известному методу Лоуренс-Смита прокаливанием с хлоридом аммония и карбонатом кальция. После улетучивания аммонийных солей остаток переводят в стакан емкостью 250 мл и кипятят в течение 30 мин. с 50—60 мл воды (в конце выпаривания объем раствора должен быть около 40 мл), фильтруют, фильтрат переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и разбавляют до метки. В аликвотной части раствора определяют калий, как описано выше, при pH раствора, равном 2 или 6,5, в последнем случае — в присутствии комплексона. Холостой опыт проводят таким же способом z Ъ мл 0,5 %-ного раствора хлорида калия. [c.151]

Методы включения метки в З -концевые группы более разнообразны. Так, а двухцепочечные ДНК метка вводится в составе (а- Р1-дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов с помощью ДНК-полимеразы I Е. соИ или фага Т4 (см. с. 348). Двух- и одноцепочечные ДНК могут быть помечены по 3 -концевому звену с использованием концевой нуклеотидилтрансферазы. В одном из вариантов этого метода к З -ОН-группе олигодезоксирибонуклеотида присоединяются а- Р -меченые рибонуклеозидтрифосфаты. После ферментативной реакции продукт подвергается щелочному гидролизу, в результате чего на З -конце образуется только одно рибонуклеотидное звено. Во втором способе используются аналоги природных нук- [c.316]

Липкие концы ДНК. Комплементарные одноцепочечные участки ДНК, выступающие на противоположных концах двухцепочечной молекулы. Ник-трансляция. Метод введения метки в ДНК основан на том, что ДНК-полимераза Es heri hia oli способна осуществлять деградацию одной из цепей ДНК, в которой до этого был сделан разрез ( ник ), и тут же строить новую цепь, используя неповрежденную в качестве матрицы. Если в реакционную смесь ввести меченые нуклеозидтрифосфаты, то вновь образуемая цепь окажется радиоактивной, что дает возможность ее использования в качестве зонда. [c.51]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Сравнительно новым методом маркировки редуцирующих концов углеводных цепей является восстановление альдегидных групп бортри-тидом натрия (ЫаВШ4). Введенная таким способом радиоактивная метка дает возможность по радиоавтографам хроматограмм определять положение фрагментов, отщепленных от редуцирующих концов. [c.177]

Еще задолго до того, как был разработан метод радиоактивных меток, Кнооп в 1904 г. синтезировал жирные кислоты, которые в качестве метки содержали на конце, противоположном карбоксильному, ковалентно связанное бензольное кольцо. Он синтезировал меченые жирные кислоты, содер-жавщие как четное, так и нечетное число атомов углерода в неразветвленной цепи, и ввел их с пищей собакам. Затем из мочи собак он выделил два соединения, гиппуровую кислоту и фенилацетуровую кислоту — амиды глицина соответственно с бензойной и фенилуксусной кислотами. Кнооп показал, что фенилуксусная кислота образовалась из жирных кислот, имевщих четное число атомов углерода, тогда как бензойная кислота — из жирных кислот с нечетным числом атомов углерода. Отсюда Кнооп сделал вывод, что при окислении жирных кислот происходит отщепление сразу двух атомов углерода, и предложил свою знаменитую теорию р-окисления. [c.311]

Предлагаемый метод был использован для изучения механизма реакции Вильгеродта с алифатическими кетонами. При перемещении функциональной группы на любой конец цепи метилэтилкетона образуется амид масляной кислоты поэтому частичная миграция к обоим концам в случае несимметричных нормальных алкилкетонов может быть установлена путем радиоактивной метки лишь одного конца. [c.576]

В методе электронного парамагнитного резонанса (ЭПР фиксируется перегиб на зависимости ширины линии в спектре ЭПР радикалов или парамагнитных зондов, введенных в полимер, от температуры, Исследования ведут на частотах 10 -10 Гц с использованием стабильных радикалов, в концентрациях не более 10 моль/л. В зависимости от способа ввода радикалов различают спиновые зонды - радикалы, растворенные в полимере, и спиновые метки - радикалы, химически связанные с макромолекулами. Считается, что зонды юкализуются в аморфной фазе, а метки могут присоединяться по всей длине или по концам макромолекулы, что позволяет разделить, идентифицировать движение отдельных участков цепей. [c.385]

Метод определения последовательности ДНК Максама-Гилбер-та получил известность, начав широко применяться еще до его публикации [19]. Он, в сущности, связан с использованием четырех контролируемых процессов химической деградации, каждый из которых проявляет большую или меньшую избирательность по отношению к одному из четырех оснований. Этот метод в равной степени хорошо применим и к одно- и к двунитевым ДНК предполагая, что только одна цепь радиоактивно мечена Р. Это достигается фосфорилированием конца молекулы с использованием 7- P-мeчeннoгo АТР и либо З -концевой, либо 5 -концевой киназы. Этим способом вводится Р метка по обоим концам дуплекса, но По чередующимся цепям. Поэтому расщепление ферментом рестрикции дает разделимые фрагменты, каждый из которых имеет одну метку и потенциально перекрывающуюся последовательность по отношению к другому (зависящую от выбора фермента рестрикции). В результате четырех отдельных реакций этот материал Подвергается четырем химическим деградациям в мягких условиях с тем, чтобы модифицировалось примерно лишь одно основание из 50 — 100. Расщепление цепи по модифицированному положению дает смесь фрагментов, каждый из которых кончается определенным основанием. Точно так же, как и в плюс и минус -методе, [c.189]

Незначительные ограничения этого метода компенсируются информацией, которая может быть получена из независимых анализов комплиментарных цепей. Применение ферментов в этом методе ограничивается введением метки в концевой фосфат и рестрикционным расщеплением цепей на блоки подходящей длины, примерно в 100—150 остатков, с частичным их перекрыванием. Метод нашел наибольшее применение в определении последовательности оснований контролирующих областей генов, например для исследования дуплекса в 223 пары оснований, представляющего собой ген 5S РНК пекарских дрожжей и имеющего промоторный и тер-минаторньй участки транскрипции [24]. Другой прекрасный пример использования этого метода — установление полной первичной структуры -глобиновой мРНК кролика, структура которой была закреплена получением с помощью транскриптазы соответствующей ей циклической ДНК [25]. В ходе амплификации этой циклической ДНК клонированием бактериальных плазмид (см. разд. 22.3.4) были потеряны 13 остатков с 5 -конца. К счастью, их последовательность удалось установить в результате исследований с использованием метода плюс и минус [26]. Совместное применение этих методов позволило установить последовательность гена длиной в 589 пар нуклеотидов. [c.192]

По окончании бурной реакции содержимое колбы нагревают 15 минут на слабом огне, по окончании реакции восстановления раствор охлаждают, фильтруют в мерную колбу емкостью 250 мл, осадок на фильтре промывают 3—4 раза водой, объем раствора в колбе доводят водой до метки. Из полученного раствора после тщательного перемешивания отбирают 50 мл, охлаждают до температуры ниже 10° и титруют 0,1 М раствором NaN02 по методу диазотирования с выдержкой конца реакции по йодокрахмальной бумаге 5 минут. [c.112]

Для определения серебра в покрытиях на молибдене 0,5 мг посеребренной проволоки растворяют в 5 мл конц. HNO3. Раствор выпаривают почти досуха, добавляют в качестве фона раствор, 0,01 М по аммиаку и 0,0001 М по NH4NO3, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, устанавливают pH 9 добавлением раствора аммиака и доводят до метки раствором фона. Переносят раствор в электролизер и удаляют кислород током азота. Электрод из графитовой пасты подвергают анодной поляризации в течение 5 мин. при потенциале - -0,5 в по отношению к выносному меркур-сульфатному электроду. Затем проводят электролиз перемешиваемого раствора в течение 10 мин. при потенциале —0,4 е. Прекращают перемешивание и регистрируют дифференциальную анодную кривую. Концентрацию серебра находят методом добавок. [c.190]

Радиоиммунологический метод анализа (РИА) был предложен в конце 50-х годов. Возможность определять метку (изотоп 1) в очень малых концентрациях позволила достичь высокой чувствительности анализа (до пкг/мл) при высокой избтательности и экспрессности. За разработку этого метода его авторы Р. Йалоу и С. Берсон были удостоены Нобелевской премии в 1977 г. Недостатками этого метода являются ограниченный срок жизни радиоактивной метки относительно дорогое оборудование дпя регастрации радиоактивности возможность радиоактивного. заражения окружающей среды при проведении серийных анализов. В качестве альтернативы радиоактивным меткам было предложено использовать флуоресцентные метки и ферменты. [c.114]

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т. е. пространственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на нерастворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидролиза. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипептидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заключающийся в анализе полипептида только с Ж-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стойкое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицируется хроматографическим методом. После идентификации концевого Ж-амино-кислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток, [c.41]

Проблемой, которую каждый раз приходится решать при использовании метода Максама — Гилберта, является получение полинуклеотидов, меченных только по одному из концов. Обычно для анализа используются двухцепочечные фрагменты ДНК (например, образовавшиеся после расщепления рестриктазами), а все методы введения концевых меток приводят к образованию фрагментоа, меченных по двум 5 - нлн двум 3 -концам. Поэтому приходится прибегать к дополнительным операциям, таким, как разделение комплементарных цепей ДНК после введения метки. [c.325]

Можно отщеплять остатки аминокислот не с К-конца макромолекулы, как это делалось в описанном методе, а с С-конца с применением радиоактивной тритиевой метки. По количеству найденных концевых звеньев определяют еще число полипептидных цепей в молекуле белка, В настоящее время вся работа по анализу белковых гидролизатов полностью автоматизирована (на гидролиз и анализ требуется всего 2—4 ч) П. Эдманом создан сиквенатор, работающий по заданной программе и намного облегчающий установление порядка чередования аминокислотных остатков в макромолекуле. [c.329]

Манометрический метод Эллиса и сотр. [57]. Навеску жидкости, например этилацетата, содержащую до 1,5 г воды, помещают в мерную колбу емкостью 50 мл, разбавляют до метки обезвоженным ацетоном, колбу закрывают и встряхивают. В латунный контейнер вводят пипеткой точно 40 мл полученного раствора. Одновременно в держатель вставляют в горизонтальном положении закрытую стеклянную трубку, в которой находится большой избыток порошкообразного СаСа, просеянного через сито № 22. Держатель прикрепляют болтами к контейнеру, а плунжер устанавливают над стеклянной трубкой. (На рис. 11-9 эта трубка изображена пунктиром.) Контейнер присоединяют к ртутному манометру с открытым концом длиной 1 м, используя латунный штуцер и гибкий вывод, и затем помещают на термостатированную водяную баню. Через несколько минут, после достижения температурного равновесия, давление внутри контейнера доводят до 1 атм, ослабляя и подтягивая штуцер. Ввинчивая плунжер, разламывают трубку с карбидом, плунжер отводят обратно и запускают встряхивающее устройство. После того, как давление перестанет подниматься (обычно через 5—20 мин), встряхивание прекращают и контейнер вновь помещают на водяную баню. Через несколько минут регистрируют показания манометра. Содержание воды в образце рассчитывают по графику зависимости давления от количества воды в граммах график строят по данным анализа образцов с известным содержанием воды. (При построении калибровочного графика следует использовать те же объемы образца и растворителя, что и при анализе образцов, так как выделя- [c.566]

Ход определения. Ход определения в основном совпадает с Ходом определения разд. 9.17.2 нефтепродуктов гравиметрическим методом. Анализируемый раствор должен иметь pH > 2. Перед экстракцией вводят в него 2—3 г Na l. Если разделение слоев после экстракции проходит плохо, количество прибавляемого Na l увеличивают. Экстрагентом служит петролейный эфир экстракцию проводят несколько раз порциями по 20—25 мл, обмывая им стенки всех примененных стеклянных сосудов делительных воронок, склянки, в которой была проба. Экстракт высушивают прокаленным сульфатом натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 100—150 мл и разбавляют петролейным эфиром до метки. Отобрав аликвотную порцию экстракта, переносят ее во взвешенный предварительно бюкс и осторожно удаляют петролей-ный эфир нагреванием, в конце при 100 105 °С, после чега снова взвешивают бюкс. Так находят суммарное содержание всех извлекаемых петролейным эфиром веществ в отобранной аликвотной части экстракта. [c.289]

Важным ключом к пониманию механизма фиксации СО2 у фотосинтезирующих организмов послужили работы Мелвила Кальвина и его сотрудников в Калифорнийском университете в Беркли, вьшолненные в конце 40-х годов. Исследователи освещали суспензию зеленых водорослей в течение всего нескольких секунд в присутствии радиоактивной двуокиси углерода ( СОг), а затем быстро убивали клетки, экстрагировали их и хроматографическими методами определяли, в каких метаболитах радиоактивный углерод появлялся раньше всего. Первым соединением, включившим Метку, оказался 3-фосфоглицерат, один из промежуточных продуктов гликолиза (разд. 15.76). Расщепление этого соединения показало, что радиоактивный углерод сосредоточен главным образом в карбоксильной группе. Это бьшо очень важным открытием, потому что в животных тканях в присутствии радиоактивной СО2 не наблюдается быстрого включения метки в углерод карбоксильной группы. Полученные результаты, следовательно, давали все основания считать, что 3-фосфоглицерат является одним из первых промежуточных продуктов фотосинтеза. В пользу этого говорил и тот факт, что 3-фосфоглицерат быстро превращается в глюкозу в растительных экстрактах. [c.701]

С достаточной для практических целей точностью можно измерять поверхностное натяжение на границе масло — вода простым методом в пипетке Донана [23, 24]. Один из возможных вариантов прибора, изготовленного из обыкновенной химической пипетки, показан на рис. 8. К концу пипетки припаян капилляр, наружная поверхность которого (срез) должна быть тщательно отшлифована. Объем пинетки может колебаться от 3 до 5 мл, что составляет 40— 60 капель (от верхней до нижней метки). Определение поверхностного натяжения по этому методу продолжается 15—20 мин., при [c.16]

Смотреть страницы где упоминается термин Методы концевой метки: [c.592] [c.41] [c.283] [c.592] [c.68] [c.20] [c.503] [c.298] [c.171] [c.93] [c.336] [c.402] [c.20] [c.201] [c.266] [c.141] [c.116] [c.127] [c.198] [c.196] [c.564] [c.131] [c.666] [c.81] [c.283]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология