Нингидрин в разделении аминокислот

Для разделения аминокислот, образовавшихся в результате гидролиза полипептида, еще Э. Фишер предложил использовать фракционную вакуумную перегонку их эфиров. Этот метод требует сравнительно большого количества вещества. В самое последнее время он, однако, вновь становится очень актуальным, так как газовая хроматография позволяет разделить ничтожные количества смеси эфиров аминокислот. Широкое применение для разделения смесей аминокислот нашла за последние годы бумажная хроматография. Если требуется определить качественный состав смеси аминокислот, то проводят двухмерное хроматографирование на листе бумаги и проявляют хроматограмму нингидрином, причем каждая аминокислота дает окрашенное пятно. [c.384]

Растворитель пропускают через бумагу столько раз, сколько это необходимо для четкого разделения аминокислот исследуемой пробы, Хроматограмму затем высушивают, проявляют, погружая на несколько секунд в 0,5%-ный раствор нингидрина, снова подсушивают в течение нескольких, минут на воздухе и нагревают для развития окраски (15 мин) в сушильном шкафу при 60° С. [c.301]

Другой метод разделения аминокислот — хромато-Г 1 М",жн графия (см. разд, 8.7.3). Положение бесцветных аминокислот на хроматограмме устанавливают с <и 1 , помощью нингидрина, который дает с аминокисло- Г ) р,ь1)и1 тами сине-фиолетовое окрашивание. [c.731]

Разделение аминокислот проводят в закрытой камере, насыщенной парами растворителя, восходящим способом при 50° С. После окон-чания хроматографии (60—90 мин, растворитель должен подняться па пластинке на расстояние примерно 18 см) вынутую из камеры пластинку высушивают на воздухе и проявляют раствором нингидрина. Для этого пластинку осторожно опрыскивают из пульверизатора [c.135]

Важное изменение в хроматографирование аминокислот внесли Штейн и Мур, которые предложили проводить разделение аминокислот на колонке, заполненной бумажным порошком или крахмалом. Через колонку пропускают сначала раствор аминокислот, а затем разделяют их вымыванием смесью растворителей, собирая раствор с помощью специального автоматического коллектора в серию пробирок. Затем колориметрируют растворы с нингидрином. Этот метод оказался особенно удобным для тонкого разделения аминокислот, а [c.480]

Обычно готовят две хроматограммы, на одну из них наносят 0,003— 0,005 мл исследуемого вещества, содержащего 0,6—1 мг азотистых веществ, на другую — 0,007—0,01 мл пробы, содержащей 1,4—2 мг азотистых веществ. Хроматограмму с меньшей навеской выдерживают в растворителе дольше обычного времени для более четкого разделения аминокислот с близким Rf. Камерой для хроматографирования может служить стеклянный аквариум соответствующего размера или же специально изготовленная камера, которую насыщают парами воды и растворителя и герметически закрывают Когда растворитель переместится на 350—450 мм, бумагу вынимают из камеры широкими щипцами (не прикасаясь к ней пальцами) и высушивают в сушильном шкафу при 100° С. Сухую бумагу поворачивают на 90° и ту часть, на которой распределились аминокислоты, опускают во второй растворитель, который желательно помещать в другую камеру. Когда он продвинется на 400—450 мм, бумагу вынимают из камеры, вторично высушивают уже на воздухе при комнатной температуре. Аминокислоты проявляют 0,5%-ным раствором нингидрина в насыщенном растворе н-бутанола в течение 5—10 мин при 100° С. Положение- искомых аминокислот устанавливают по найденному Rf аминокислот. [c.29]

При разделении аминокислот смесью н-бутанола, уксусной кислоты и воды (4 1 5) в кювету наливают верхний слой (см. тр. 127) растворителя, который пропускают через бумагу три раза подряд (каждый раз до конца бумаги). После каждого пропускания бумагу высушивают и вновь помещают в камеру. Затем образовавшуюся хроматограмму высушивают на воздухе и проявляют нингидрином. [c.147]

При построении калибровочного графика растворитель пропускают через бумагу столько раз, сколько это необходимо для четкого разделения аминокислот исследуемой пробы. После пропускания растворителя хроматограмму высушивают и проявляют, погружая на несколько секунд в 0,5%-ный раствор нингидрина (готовится смешиванием 95 частей 0,5%-ного раствора нингидрина в ацетоне, 1 части ледяной уксусной кислоты и 4 частей воды непосредственно перед определением), подсушивают в течение нескольких минут на воздухе и прогревают для развития окраски в затемненном сушильном шкафу в течение 15 мин при 60 °С. Концентрацию соответствующей аминокислоты определяют описанными ниже методами. [c.149]

Рис. 5-13. Разделение аминокислот методом электрофореза на бумаге. На полоску бумаги наносят каплю раствора, содержащего смесь аминокислот. Ей дают высохнуть, после чего эту полоску бумаги смачивают буфером с заданным значением pH и помещают между охлаждающими пластинами. Концы полоски погружают в кюветы с электродами и включают высокое напряжение. В возникающем при этом постоянном электрическом поле аминокислоты разделяются в соответствии с их суммарным электрическим зарядом при выбранном pH. Аминокислоты, которые при этом значении pH представляют собой катионы, мигрируют к катоду (отрицательному полюсу), а аминокислоты, имеющие форму анионов, перемещаются к аноду (положительному полюсу), как это показано на схеме, изображающей электрофореграмму в момент времени Т . В конце процесса (на схеме-в момент времени Та) бумагу высушивают, опрыскивают нингидрином и нагревают, в результате чего на бумаге проступают пятна, соответствующие расположению различных аминокислот, которые можно идентифицировать путем сравнения их положения с положением аутентичных аминокислот, используемых в качестве свидетелей .

Нингидрин находит широкое применение при двух хроматографических методах анализа аминокислот. Одним из них является хроматография на бумаге в этом методе разделение аминокислот происходит вследствие различия коэффициентов распределения между водой и органическим растворителем. Водная фаза удерживается [c.108]

Количественный анализ аминокислот может быть проведен при пропускании анализируемого раствора через колонки, заполненные ионообменными смолами разделение аминокислот при этом происходит вследствие различий в их способности к комплексообразова-нию с высокополярными участками смолы. Раствор, вытекающий из колонки, смешивают с раствором ниНгидрина и интенсивность возникающего синего окрашивания измеряют с помощью фотоэлектроколориметра. Затем строят график зависимости интенсивности от времени при постоянной скорости потока. Типичная хроматограмма, полученная при анализе смеси аминокислот этим методом, приведена на рис. 20-4. [c.111]

Для анализа белковых гидролизатов разработаны очень удобные хроматографические методы. Тем не менее электрофорез, особенно электрофорез на бумаге, очень часто применяют, когда смеси не очень сложны и когда имеющиеся в смеси аминокислоты значительно отличаются по кислотно-основным свойствам. Пример успешного разделения довольно сложной смеси приведен на рис. 16. Электрофоретическое разделение аминокислот можно провести очень быстро, особенно если применить высоковольтный электрофорез. Проявление электрофореграмм осуществляют с помощью нингидрина. [c.105]

В этих условиях разделение аминокислот (кислых, нейтральных и основных) происходило за 21 час. В указанной колонке высокого разрешения были проанализированы 186 нингидрин-положительных соединений (рис. 11). Использование чувствительного фотометра, работаюш,его в области 95—100%-го пропускания, уменьшение ширины пиков аминокислот за счет снижения поперечного сечения колонки и уменьшения диаметра частиц смолы позволило анализировать до 10" моль аминокислот с точностью 5%, при этом максимальная чувствительность составляла 10 моль. [c.159]

Хроматографическое разделение аминокислот. Для аналитических целей определения аминокислот в смесях разделение их производится хроматографией на бумаге или на ионитах. Метод десорбционного анализа, разработанный Муром и Штейном [29], основан на сорбции аминокислот сульфокатионитом и десорбции кислотой или буфером—нитратом натрия. Фракции с колонн собираются обычно автоматическим приспособлением и анализируются колориметрически реакцией с нингидрином. Аминокислоты в отдельных фракциях идентифицируются по порядку, в котором они [ВЫХОДЯТ из колонны при десорбции буферами с повышающимся pH. [c.597]

Нингидрин находит широкое применение при двух хроматографических методах анализа аминокислот. Одним из них является хроматография на бумаге в этом методе разделение аминокислот происходит вследствие различия коэффициентов распределения между водой и органическим растворителем. Водная фаза удерживается в стационарном состоянии в микропористой структуре бумаги. Различия коэффициентов распределения приводят к различным скоростям миграции по поверхности влажной (но не мокрой) фильтровальной бумаги, по которой медленно движется фронт насыщенного водой органического растворителя. Рассмотрим более подробно один из нескольких широко применяемых способов хроматографирования. Каплю анализируемого раствора наносят на край листа влажной фильтровальной бумаги, который далее помещают в прибор, подобный изображенному на рис. 20-2, таким образом, чтобы органический растворитель мог под действием капиллярных сил двигаться по бумаге вверх, увлекая за собой аминокислоту вдоль одного из краев. Кислоты, наиболее растворимые в органическом растворителе, двигаются с наибольшей скоростью прежде чем [c.65]

Обычные аминокислоты Катионит Цитрат натрия Нингидрин Разделение оптических изомеров 36 [c.40]

По своим задачам хроматография разделяется на аналитическую и препаративную. Аналитическая хроматография преследует цель констатировать наличие нескольких компонентов в анализируемой смеси, идентифицировать эти компоненты (или убедиться, что какие-то из них не соответствуют никакому из ранее исследованных химических соединений) и количественно определить содержание каждого из них. При аналитической хроматографии можно для обнаружения веществ на выходе из колонки, в тонком слое или на бумаге превратить их в какие-либо другие, легче обнаруживаемые вещества. Например, при анализе аминокислотного состава белков на выходе из колонки к бесцветному раствору, вытекающему из колонки, добавляют специальное вещество — нингидрин, которое превращет аминокислоты в синий краситель. В результате этого зоны, содержащие разделенные аминокислоты, выходят в виде окрашенного раствора, измерение оптической плотности которого позволяет определить содержание красителя, а значит, и исходное содержание аминокислоты в каждой зоне. [c.343]

При разделении аминокислот во втором направлении хроматографию также ведут до тех пор. пока растворитель не поднимется по пластинке на 5 см, тогда ее ei>i-нимают, высушивают при 105° С до полного исчезновении запаха фенола (под тягой ). Высушспную пластинку опрыскивают раствором нингидрина и снопа прогревают в течение нескольких минут в сушильном шкафу при 100—105° С. Па пластинке появляются пятна аминокислот красновато-фиолетово го или сине-фиолетового цвета. [c.145]

Определение концевых М-аминных групп разработано достаточно детально. Самым простым, хотя и не совершенным, является метод дезаминирования пептида азотистой кислотой, хлористым нитрознлом, или же окисления бромноватистой кислотой или нингидрином. В результате аминогруппа заменяется гидроксильной или карбонильной и после гидролиза пептида и разделения аминокислот на хроматограмме одна аминокислота исчезает. [c.510]

В качестве детектора используют фотометр видимой области (А, = 440 и 570 нм), либо флуориметр. Разделенные аминокислоты переводят в производные, используя специальную гидравлическую схему, устанавливаемую между ионообменной колонкой и детектором. С помощью отдельного насоса подают раствор реагента (чаще всего нингидрина), который смешивается с элюатом. Полученная смесь поступает в реактор, который в простейшем случае представляет собой отрезок тефлонового капилляра. Объем реактора, его температура и расход раствора реагента подбирают таким образом, чтобы при минимальном размывании зон Лримерно за 1 мин реакция аминокислот с нингидрином произошла полностью. [c.329]

При получении слоя силикагель — гипс для разделения аминокислот необходимо соблюдать ряд условий [82]. Не следует активировать иластинку нагреванием, достаточно просушить ее на воздухе нри разделении не допускать подъема нчидкости выше 10 см от линии старта. Наносить аминокислоты на пластинку следует в количествах, не превышающих 1—5 Л1кг. При соблюдении этих условий получают воспроизводимые результаты. Смесь аминокислот разделяли в нескольких системах 96 о-ный этанол — вода (70 30) и.нронанол — вода (70 30) н.бутанол — уксусная кислота — вода (80 20 20) фенол — вода (75 25) н.пропано.л — 34%-ный аммиак (70 30) 96%-ный этанол — 34%-ыый аммиак (70 30). Более четкое разделение достигнуто в системах н. бутаиол — уксусная кпслота — вода (60 20 20) и фонол — вода (75 25) (табл. 15) особенно хорошие результаты получены прн двумерном разделении в этих системах. Для обнаружения пятен иластинку опрыскивали реагентом нингидрин — нитрат меди. [c.91]

Основы метода. Сайндж [10] показал, что сырой картофельный крахмал может быть употреблен в качестве неподвижной водной фазы. Если подвижной фазой служит водонасыщенный н-бутиловый спирт, то аминокислоты и пептиды двигаются на такой крахмальной колонке в виде резко очерченных полос в порядке, определяемом нх коэфициентами распределения между водой и н-бутиловым спиртом. Разделение аминокислот и пептидов на фракции может быть прослежено, если пропускать 0,5 д эфирный раствор нингидрина через проявленную /т -бутило-вым спиртом колонку. Эта реакция, как указывает Сайндж, позволяет различать аминокислоты от пептидов, так как окрашиваются только аминокислоты пептиды не дают окраски до нагревания. Хроматограмма на крахмале оказалась пригодной для разделения частичных гидролизатов белка, что очень важно для решения вопросов о структуре белка. [c.389]

Через несколько часов, когда можно ожидать разделения аминокислот, бумагу вынимают из ванночки и растворитель удаляют высуи иванием. После этого для лучшего разделения аминокислот лист бумаги поворачивают на 90° и снова помещают в ванночку и по бумаге пропускают другой растворитель. После вторичного пропускания растворителя бумагу обрабатывают каким-либо реактивом, дающим окрашивание при взаимодействии с аминокислотами, чаще всего нингидрином или изатином. На бумаге появляются окрашенные пятна, соответствующие отдельным аминокислотам. По месту положения пятен и интенсивности их окраски судят о наличии и содержании в гидролизате белка тех или иных аминокислот. Фотография хроматограммы показана на рисунке 21. Метод распределительной хроматографии на бумаге позволяет быстро и точно определить содержание аминокислот. В последние годы хроматографические методы успешно применяются для разделения и определения сахаров, органических кислот и ряда других соединений. [c.218]

После полного гидролиза белка производится количественное онределе-ние каждой из аминокислот, присутствующих в гидролизате. Для разделения аминокислот чаще всего применяется метод ионообменной хроматографии. В качестве ионообменника обычно используют сульфополистирольный катионит. Смесь аминокислот вносится в верхнюю часть колонки при pH 3 в этих условиях индивидуальные аминокислоты полонштельно заряжены. Аминокислоты в форме катионов сорбируются на сульфополистирольной смоле (содержащей группы — SOg Na ), замещая часть ионов натрия, и удернги-ваются на материале колонки электростатическими силами. Очевидно, что прочность сорбции аминокислоты возрастает с увеличением ее основности. После внесения смеси начинается элюция аминокислот при постепенном увеличении pH и 1тонной силы буферных растворов, пропускаемых через колонку. В этих условиях положительный заряд на аминокислотах постепенно нейтрализуется и ионные взаимодействия ослабляются. Первыми с колонки снимаются кислые аминокислоты (глутаминовая и аспарагиновая кислота), затем нейтральные и, наконец, основные. С помощью этого метода можно разделять все аминокислоты, обычно встречающиеся в белках, поскольку прочность сорбции аминокислоты смолой зависит как от ионных, так и от неионных взаимодействий. Сульфополистирольный катион адсорбирует аминокислоты достаточно избирательно, так что все нейтральные аминокислоты, которые нельзя разделить с помощью ионного обмена, тем не менее элюируются с колонки в разных фракциях. Индивидуальные аминокислоты, элюируемые с колонки, собираются автоматическим коллектором фракций. Затем их количественно определяют путем измерения интенсивности окраски, возникающей при действии нингидрина. В настоящее время промышленность выпускает несколько типов автоматических амино- [c.57]

Разделение аминокислот из их смеси производят на катионообменной синтетической смоле типа Во уех50 -Х8. Удобно пользоваться готовыми пластинками типа Р1х1оп50-Х8 (Венгрия), на которые нанесен сильный катионит в натриевой форме. При нанесении образца на пластинку все аминокислоты должны сорбироваться в стартовой позиции путем их обмена с катионом натрия. Следовательно, все аминокислоты в исходной пробе должны быть в форме катионов, что достигается доведением наносимого раствора до pH < 2,2. Степень удержания аминокислот смолой зависит от степени диссоциации основных и кислотных групп аминокислот (т.е. от величины их рК), от числа этих групп в молекуле, от способности к гидрофобным взаимодействиям со смолой и некоторых других условий. Ароматические и основные аминокислоты (арг, гис, лиз, фен, тир), а также лейцин прочно удерживаются на катионите. Для их разделения применяют пропускание нитратного буфера pH 5,25 с концентрацией Ка+ 0,35 моля через слой смолы. В этих условиях все остальные аминокислоты (кислые и нейтральные) приобретают высокую подвижность и идут с фронтом растворителя. Для выявления отдельных аминокислот пластинку опрыскивают раствором нингидрина. Появляются фиолетовые пятна аминокислот, располагающиеся по всей длине пластинки по степени возрастания подвижности аминокислот. Полуколичественная оценка содержания аминокислоты в смеси достигается путем сравнения величины пятна из анализируемого образца с пятном соответствующей стандартной аминокислоты. [c.55]

Порядок расположения аминокислот вдоль полосы бумаги различен для различных растворителей. Испошь-зуя это обстоятельство и механические свойства бумаги, удалось разработать двухмерное разделение аминокислот. Капля раствора а-мянокислот помещается около верхнего угла куска фильтровальной бумаги (40 X 55 см). Сначала хроматограмму проявляют в одном направлении коллидином в течение 48—72 часов. Затем бумага высущивается, и производится вторичное проявление, но уже для это1 1 цели применяется насыщенный водой фенол в атмосфере, содержащей МНз. После вторичного проявления полоска снова высушивается. Кислоты растекаются по бумаге характерным образом, и их положение может быть обнаружено путем обрызгивания бумаги раствором нингидрина, с последующим высушиванием 11 нагреванием. Рис. 4 показывает фотографию полученной таким образом хроматограммы. [c.82]

С 1951 г. введен ряд модификаций нингидринового реагента некоторые из этих модификаций удовлетворяют требованиям отдельных методик разделения аминокислот, другие — улучшают колориметрию. Метод Смита [96] отличается главным образом тем, что нингидрин, хлористое олово и буферные растворы прибавляют отдельно, а не в виде одного реагента. Мур и Стейн [4] изменили состав своего прежнего реагента, увеличив буферную емкость в пять раз прибавлением раствора ацетата натрия (pH 5,5). Это устранило необходимость отдельной нейтрализации фракций. Вместо хлористого олова в нингидриновый реагент был введен гидриндантин во избе- [c.145]

Общее содержание цистина и цистеина можно, однако, определить, окисляя интактный белок надмуравьиной кислотой, которая превращает оба типа остатков в цистеиновую кислоту. Белок затем гидролизуют и сильную цистеиновую кислоту отделяют или на сильноосновной анионообменной смоле, такой, как дауэкс-2 [108], или на сильнокислотной катионообменной смоле типа, обычно используемого для разделений аминокислот [102]. Последний способ более удобен, так как цистеиновая кислота вымывается в виде пика с нулевым удерживаемым объемом (фракции 3—10 на колонке длиной 15 см), но первый метод дает возможность более строгой хроматографической идентификации и отделения цистеиновой кислоты от других сильнокислых соединений, реагирующих с нингидрином. Скорость окисления остатков цистина в белках сходна со скоростью окисления свободной аминокислоты. Нерастворимые белки для полного окисления требуют более продолжительной обработки. [c.148]

РИС. 8.4. Разделение аминокислот ионообменной хроматографией п одноколоночной системе. Колонка (6X460 мм), заполненная смолой типа W-3 до высоты 220 мм. Натрийцитратные буферы pH 3,25 (0,2 М Na+, с 17о-ным пропапо-лом-2 pH 3,95 (0,4 М Na+) pH 6,4 (1,0 М Na+). Температура 50-60 °С. Скорость потока 44 мл/ч (буфер), 22 мл/ч (нингидрин). Кювета 12 мм. Вся шкала 2,0 Л. Смесь аминокислот для построения градуировочного графика (50 нмоль каждого компонента в 100 мкл). С разрешения фирмы Be kman. [c.276]

Разделение аминокислот можно проводить разными методами, но для анализа аминокислотного состава полипептида после его гидролиза обычно используют автоматическую ионообменную хроматографию. Полное разделение аминокислот, их идентификация и количественная оценка занимают менее трех часов. В методе Мура и Штейна используют короткую и длинную колонки, заполненные смолой из сульфонированного полистирола в Ыа+-форме. Когда кислотный гидролизат при pH 2 наносят на колонку, аминокислоты связываются в результате катионного обмена с Na+. Далее колонку элюируют раствором цитрата натрия при заранее запрограммированных значениях pH и температуры. Короткую колонку элюируют одним буфером, длинную— двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя интенсивность окраски с помощью проточного колориметра. Данные автоматически регистрируются на ленте самописца и могут передаваться в компьютер для вычисления площади под пиком (рис. 3.12). [c.31]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология