Трипсин основных аминокислот

Рассмотрим механизм действия фермента и основные стадии ферментативного катализа на примере очень хорошо изученного фермента, химо-трипсина. Это - гидролаза, а точнее - эндопептидаза, расщепляющая такие пептидные связи внутри полипептидной цепи белка, в образовании которых участвует карбоксильная группа ароматических аминокислот. [c.30]

Трипсин гидролизует пептидные связи, образуемые основными аминокислотами, т. е. связи, в которых участвуют остатки лизина и аргинина. Пептидные связи Лиз-Про и Арг-Про устойчивы к гидролизу. Частичной устойчивостью к трипсиновому гидролизу обладают также некоторые другие пептидные связи, например в структуре. .. Лиз-Лиз-Х... связь Лиз-Лиз или связи в пептидах Арг-Арг, Арг-Лиз и Лиз-Арг. Скопление основных аминокислот в определенных участках пептида обусловливает частичную устойчивость его к гидролизу. То же самое справедливо и для пептидных связей Лиз-Глу и Арг-Глу. [c.35]

Попытки использования оксиаминокислот более подробно описаны в следующем разделе. Как указывалось выше, расщепление аминокислот основного характера проводилось только при действии трипсина (см. стр. 179—198). Известны работы, посвященные селективному расщеплению пептидных связей в ароматических аминокислотах путем облучения белка светом соответствующей длины волны. В большинстве случаев исследования имели эмпирический характер и предпринимались главным образом с целью изменения свойств белков, часто обладающих ферментативными или иммунологи- [c.215]

Трипсин 21 расщепляет пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы лизина и аргинина. К гидролизу трипсином устойчивы связи лизина и аргинина с пролином (лиз—про и арг—про). Замедление гидролиза этим ферментом наблюдается тогда, когда остатки лизина и аргинина находятся рядом со свободными а-амино- и а-карбоксильными группами, а также в участках полипептидной цепи с повышенным содержанием основных аминокислот (связи ЛИЗ—лиз, арг—арг, лиз—арг и арг—лиз расщепляются только частично). Селективность расщепления трипсином можно повысить путем блокирования e-NH2-rpynn лизина (например, ангидридами янтарной, малеиновой или цитраконовой кислот) или же гуанидиновых группировок аргинина (дикетоновыми реагентами, такими как диацетил, циклогександион, фенилглиоксаль и др.). Гидролизу трипсином могут подвергаться связи, образованные и остатками цистеина, после превращения его в аминоэтилцистеин обработкой белка этиленимином. [c.140]

Уже много лет назад было известно, что некоторые нативные белки устойчивы к действию трипсина и что протеолиз легко протекает после денатурации белков. Зная количество основных аминокислот в белке, можно точно предсказать, сколько пептидов может образоваться при триптическом гидролизе денатурированного белка. [c.123]

Трипсин обладает сравнительно узкой субстратной специфичностью, разрывая пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы лизина и аргинина, т. е. основных аминокислот. [c.363]

Методика получения пептидных карт или отпечатков пальцев очень полезна при определении идентичности полипептидных цепей. Согласно этой методике, белок обрабатывают трипсином, который избирательно гидролизует пептидные связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот, аргинина и лизина. Образующаяся смесь пептидов разделяется с помощью хроматографии и электрофореза. Эквивалентный вес полипептидной цепи рассчитывают по количеству аргинина и лизина в белке и числу разных пептидов, получаемых при триптическом гидролизе. Теоретически общее число пептидов должно равняться сумме числа остатков аргинина и лизина плюс один, [c.401]

Трипсин проявляет наибольшую активность по отношению к пептидам, у которых карбоксильная группа принадлежит остатку основной аминокислоты. [c.427]

Трипсин проявляет высокую специфичность, расщепляя лишь пептидные связи, в образовании которых принимают участие основные аминокислоты, такие, как лизин и аргинин. Наряду с пептидными трипсин гидролизует амидные и сложноэфирные связи, образованные лизином и аргинином, причем амиды расщепляются быстрее пептидов, а сложные эфиры — еще быстрее. [c.305]

Ферментативные методы гидролиза особенно ценны благодаря присущей им во многих случаях специфичности. Трипсин, представляющий собой так называемую эндопептидазу, быстро расщепляет пептидные связи лишь в том случае, если карбонильная группа расщепляемой амидной связи принадлежит одной из основных аминокислот — лизину или аргинину. Таким образом, трипсин превращает белок в сравнительно малое число триптических пептидов, которые можно разделить и охарактеризовать. Трипсин расщепляет только денатурированные белки, причем для получения хороших результатов нужно предварительно разорвать дисульфидные мостики. [c.166]

Значение этих двух ферментов определяется прежде всего их использованием при установлении первичной структуры протеинов. С целью определения стерической однородности пептидов трипсин и химотрипсин применяются в тех случаях, когда рацемизация предположительно могла произойти в момент создания пептидной связи с ароматической или основной аминокислотой [2096, 1821, 1904] или когда перед определением [c.403]

При рассмотрении вопроса о природе ферментов и их компонентов нужно всегда помнить, что наличие ферментов обнаруживается только по их действию на соответствующий субстрат. Чтобы определить специфичность фермента, необходимо исследовать его действие на различные субстраты, отличающиеся друг от друга лишь некоторыми особенностями строения молекулы. Этот метод исследования специфичности ферментов был в особенности развит Бергманом и его сотрудниками, работы которых имели исключительное значение для выяснения специфичности действия протеолитических ферментов. До появления этих работ не было известно, какие именно пептидные связи расщепляются пепсином, трипсином и другими протеолитическими ферментами. Бергман и его сотрудники [21] по разработанному ими методу синтезировали большое число различных пептидов и использовали эти пептиды в качестве субстратов для протеолитических ферментов. В результате этих исследований было установлено, что трипсин расщепляет преимущественно пептиды, содержащие основные аминокислоты — аргинин или лизин, тогда как пепсин действует главным образом на пептиды, содержащие ароматическую аминокислоту тирозин [22]. Эти данные позволили заключить, что щелочные боковые цепи аргинина или лизина специфически реагируют с молекулярными группами, расположенными на поверхности трипсина, тогда как структура ароматического кольца тирозина соответствует строению поверхности пепсина. [c.278]

Связь а) разрывается химотрипсином, так как ее СО-группа принадлежит ароматической аминокислоте — тирозину. Связь б) расщепляется трипсином, который действует на пептидные связи, образованные карбоксильной группой основных аминокислот. Пепсин и карбоксипептидаза не могут расщеплять связей (а) и (б), однако они могут разорвать связь (б). Действие пепсина обусловлено тем, что группа МН у (в) принадлежит ароматической аминокислоте. Расщепление связи карбоксипептидазой зависит от смежной со связью конечной карбоксильной группы [14]. [c.364]

Белковые вещества входят в состав протоплазмы и часто составляют больше половины ее массы. Общее содержание белков в растениях зависит от их принадлежности к тому или иному виду (см. табл. 4). В деревьях оно меньше и колеблется от 1 до 10%. Значительно больше белковых веществ в простых водорослях (20—30%), а в некоторых бактериях их содержание достигает 80%. Молекулярная масса различных белков колеблется в широких пределах от (17500 до 6800000). Изучение белков затруднено тем, что они представляют собой сложные смеси, выделение которых из растений в неизмененном виде почти невозможно. Основной способ выяснения их строения состоит в изучении продуктов их гидролитического распада, осуществленного с помощью минеральных кислот или оснований. Белковые вещества легко гидролизуются не только в присутствии кислот и оснований, но и под действием различных ферментов (протеаз, пепсина, трипсина и др.). При их распаде образуется смесь до 30 различных аминокислот. Большинство из них относится к группе аминокарбоновых кислот, а некоторые имеют ароматический и гидроароматический характер [10, с. 90]. [c.25]

Предшественники (зимогены) — пепсиноген, трипсиноген и химо-трипсиноген получены в чистом виде. Активация заключается в удалении небольшого пептидного фрагмента и катализируется либо активной формой самого фермента, либо энтерокиназой, другим ферментом, имеющимся в пищеварительном тракте. При превращении трипсиноге-на в трипсин с N-конца белка отщепляются гексапептид вал— (асп)4 — лиз и N-концевой аминокислотой становится изолейцин (Нейрат , 1955). Активация других зимогенов более сложна. Ранние работы Бергмаина (1937) на простейших модельных пептидах показали, что ферменты избирательно расщепляют определенно пептидные связи. Пепсин, трипсин и химотрипсин известны как эндопептидазы, так как они расщепляют пептидные связи, расположенные внутри молекулы. Пепсин расщепляет амидные связи, образованные аминогруппами фенилаланина или тирозина химотрипсин расщепляет связи, образованные карбоксильными группами этих ароматических аминокислот. Трипсин расщепляет амидные связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот (лиз, арг). Эти протеолитические ферменты расщепляют также эфиры аналогичной структуры. Во всех случаях затрагиваются только пептиды, образованные -аминокислотами. Предположение Михаэлиса (1913), что реакции, катализируемые ферментами, проходят через стадию образования промежуточного фермент-субстратного комплекса, были подтверждены всеми последующими работами. С большой очевидностью показано, что каталитическая активность определяется небольшим участком фермента, так называемым его активным центром. [c.697]

Разработанные в последние годы методы селективного гидролиза, разделения и идентификации открыли новые возможности для химического изучения структуры полипептидов и белков. Как уже указывалось, эти природные продукты включают разнообразный материал антибиотики, гормоны, токсины, ферйенты,. вирусы, волокна и т. д. Хотя за короткий период времени был достигнут большой прогресс в выяснении структуры различных природных продуктов, работа по установлению химической структуры белков в значительной степени осложнена их макромолеку-лярной природой. Изучение последовательности аминокислот в полипептидах и белках показывает наличие в них своеобразных группировок аминокислот. Например, из семи основных аминокислот, имеющихся в АКТГ, четыре расположены по соседству, а все семь включены в последовательность из 14 аминокислот из семи кислых аминокислот, ирисутствуюпщх в этом гормоне, три находятся по соседству друг с другом. В рибонуклеазе три остатка серина и три остатка аланина находятся рядом аналогична располагаются три ароматические аминокислоты в инсулине. Для ряда ферментов — тромбина, трипсина, химотрипсина и фосфоглюкомутазы было отмечено наличие одинаковой последовательности из шести аминокислот. Отмечено, что в структуре-и механизме действия протеолитических ферментов важную роль играют определенные трипептиды [160]. В настоящее время из-за ограниченности наших знаний относительно точного молекулярного механизма действия гормонов и ферментов можно делать только предположения о значении тёх или иных аминокислотных группировок. Вопрос о связи определенной последовательности аминокислот с функциями различных соединений может быть выяснен лишь по мере накопления экспериментального материала. Тем самым, по-видимому, станет возможным значительно более полное понимание механизма действия природных соединений на молекулярном уровне. [c.418]

Преждевременное превращение таких проферментов, как трипсиноген, в активные протеиназы в поджелудочной железе может иметь губительные последствия. Чтобы предотвратить такую преждевременную активацию, поджелудочная железа должна вырабатывать также специфические ингибиторы. Панкреатический ингибитор трипсина представляет собой небольшой белок с мол. весом 6500, специфически связывающийся в активном центре трипсина (Л[г=10 М в щелочной среде) . Определение кристаллической структуры самого трипсина и его ингибитора показало, что эти две молекулы плотно прилегают друг к другуб. Ингибитор связывается таким образом, как будто он является пептидным субстратом один край молекулы ингибитора образует антипараллельную р-структуру с пептидной цепью фермента. Лизин-15, образующий часть этой р-структуры, входит в специфический связывающий центр для основной аминокислоты субстрата. Таким образом, ингибитор протеиназы представляет собой модифицированный субстрат, который фактически может подвергаться атаке в активном центре. Однако подгонка двух молекул является настолько тесной, что молекула воды не может участвовать в завершающей стадии каталитического акта, и комплекс остается нереакционноспособным. (В тонкой кишке количество ингиби- [c.113]

Последовательность аминокислотных остатков в белковой цепи называется ее первичной структурой. Определение первичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь нежду определенными остатками. Так, трипсин режет лишь связи, образованные СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь пептидов — коротких фрагментов белковой цепи. Их идентификация производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, электрофорез). Воздействуя вторым ферментом, можно разрезать другие связи в белке и получить смесь других фрагментов (пептидов) и т. д. [c.33]

Последовательность аминокислотных остатков в полипептид-,ной цепи называется ее первичной структурой. Определение пер.-вичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью специфических протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь между определенными остатками. Так, трипсин атакует лишь те пептидные связи, которые образованы СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь коротких полипептидных цепей, олигомеров. Такие короткие цепи называются пептидами. Их исследование производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, масс-спектроскопия). Воздействуя другим ферментом, можно разрезать белок по другим связям, получить смесь других пептидов. N- и С-конце-вые остатки белка (см. стр. 68) определяются в результате их химической модификации, предшествующей частичному гидролизу. Зная строение пептидов, полученных при специфическом расщеплении различными ферментами, можно установить первичную структуру белка. Допустим, что белковая цепь имеет структуру [c.73]

Каждый из этих ферментов атакует вполне определенные пептидные связи. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, карбонильная группа которых принадлежит одной из основных аминокислот, обычно аргинину или лизину. Пепсин и химотрипсин предпочтительно катализируют гидролиз тех пептидных связей, в образовании которых участвуют ароматические аминокислоты, в частности триптофан, тирозин и фенилаланин. Среди протеолитических ферментов наиболее высокой специфичностью обладает трипсин поэтому именно он наиболее подходит для такого рода анализа. Ясно, однако, что при помощи только одного, пусть даже абсолютно специфичного, фермента невозможно определить полную последовательность аминокислот в полипептиде. Если, например, триптическое расщепление полипептида дало пять фрагментов (пептидов), в сумме соответствующих всей цепи, и если даже для каждого из них удалось установить аминокислотную последовательность, то это еще не все требуется узнать, в каком порядке эти пептиды располагались в нативном полипептиде. Чтобы узнать это, необходимо получить другие пептиды, которые перекрывались бы с первыми. Главное преимущество ферментативного гидролиза — специфичность реакции расщепления в отношении природы расщепляемых пептидных связей накладывает в то же время строгое ограничение на применимость этого метода. В идеале желательно было бы, например, иметь возможность расщеплять иногда те пептидные связи, которые в норме трипсином не атакуются, или, наоборот, предохранять от расщепления связи заведомо чувствительные. Недавно были предложены некоторые модификации методики, которые позволяют в какой-то мере решить эту задачу. Так, например, реакция е-аминогруппы лизина с этилтрифтортиоацетатом в слабо щелочном растворе дает блокированный по аминогруппе остаток, пептидная связь которого не атакуется трипсином [c.90]

Как и в случае трипсина и змеиного яда, индуцированное калликреином образование кининов связано с эстеразной активностью ферментов. По-видимому, все три кининобразующих фермента имеют практически одинаковые активные центры , в которых, вероятно, имеется остаток серина, так как и трипсин, и змеиный яд, и калликреин инактивируются после обработки диизопропилфторфосфатом [907, 911]. Роша э Сильва [1832] высказал предположение, что брадикинин связан с входящим в состав белка остатком основной аминокислоты сложноэфирной связью, в создании которой, возможно, принимают участие производные фосфорной кислоты. Эллиотт [662] указывал, что, [c.109]

Двенадцатиперстная кишка переваривание белков осуществляет группа сериновых (в активном центре ОН-группа серина) протеиназ панкреатического происхождения. Ферменты вырабатываются в виде неактивных предшественников — проферментов. Их активация осуществляется в тонком кишечнике вначале образуется активный трипсин, который затем активирует остальные протеиназы. Трипсин — эндопептидаза, синтезируется в поджелудочной железе в виде неактивного трипсиногена. В тонком кишечнике энтерокиназа, а затем активный трипсин аутокаталитически, катализируют отщепление от 7У-конца трипсиногена гексапептида (вал-асп-асп-асп-асп-лиз), в результате чего формируется активный центр фермента. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, в образовании которых участвуют карбоксильные группы основных аминокислот (лизин, аргинин). Химотрипсин — эндопептидаза, вырабатывается в поджелудочной железе в виде химотрипсиногенов А и В. В тонком кишеч- [c.245]

Некоторые белки содержат большие участки цепи, в состав которых не входят ни ароматические, ни основные аминокислоты. Эти участки не разрушаются ни трипсином, ни химотриисином, что затрудняет изучение таких белков [c.81]

Содержание остатков основных аминокислот — лизина и аргинина — в трансферрине человека показывает, что химическое определение генетических вариаций трансферрина (подобно тому, как это было проведено для гемог.11обина) потребует разделения 80—85 пептидов, которые будут получены после расщепления трансферрина трипсином. [c.128]

При эгом они основывались на специфическом действии ферментов. В пептидах, образовавшихся в результате трипсинного гидролиза, С-концевыми аминокислотами являются аргинин и лизин. Пептиды, выделенные из гидролизата рибонуклеазы химотрипсином, содержат основном в качестве концевых С-аминокислот остатки тирозина и фенилаланина. [c.524]

Вазопрессин. Вазопрессин содержит одну аминокислоту основного характера, которая в вазопрессине быка (XII) представляет собой аргинин, а в гормоне свиньи — лизин. Трипсин в обоих случаях вызывает выделение глициламида [83]. Некоторый интерес представляет тот факт, что в вазо- [c.187]

Этот фермент может быть выделен из экстрактов поджелудочной железы в чистом виде [128], но до использования для определения последовательности аминокислот его рекомендуется инкубировать с диизопропилфторфосфатом, чтабы инактивировать возможные примеси химотрипсина, трипсина и субтилизина [122, 267, 300]. Основные свойства и специфич-кость действия карбоксипептидазы подробно рассмотрены в ряде работ [228 293]. В Других работах [114, 136, 226, 320] приводятся данные об использовании фермента для определения последовательности аминокислот в белках. Карбоксн-Пептйдаза специфична в отношении С-концевых аминокислот [c.232]

Экспериментальное доказательство избирательности этих способов приведено на рис. 8.3.8 в виде фильтрованного двумерного корреляционного спектра протеина — основного панкреатического ингибитора трипсина (ОПИТ). Только системы АзХ остатков аланина дают вклад в сильные перекрестные и диагональные пики в фильтрованном спектре OSY, в то время как треонин и лейцин дают лишь слабые отклики и ни одна из других аминокислот не вносит значительного вклада. [c.322]

Если селективные по связанности спинов последовательности U и V включены в последовательность для фильтрации корреляционных 2М-спектров, то остаются сигналы только от выбранных схем взаимодействий. Из рис. 8.3.8 видно, как можно упростить обычный спектр OSY основного панкреатического ингибитора трипсина путем подавления откликов аланиновых остатков, которые отличаются от других аминокислот тем, что они содержат спиновые системы типа АзХ [8.37]. Слабые ложные отклики треонина и лизина могут быть объяснены подобием их схем взаимодействий. [c.521]

На рис. 8.3.11 приведен пример экспериментального эстафетного корреляционного спектра. Показаны четыре сечения 2М-спектра протеинового основного панкреатического ингибитора трипсина (ОПИТ) диагональные пики, связанные с протонами ЫН, область кросс-пиков, обусловленных одноступенчатым С Н -> ЫН-перено-сом, область эстафетных сигналов, возникающих из-за двойного переноса С Н -> С Н ЫН. Эти дополнительные сигналы могут быть полезными при идентификации сигналов аминокислот с почти вырожденными резонансами С Н, а в более щироком смысле для последовательной идентификации резонансов, когда две линейные спиновые системы к — / — тик — / — т имеют вырожденные сдвиги П = П,. [8.38—8.40]. [c.525]

Многие особенности 2М-спектроскопии NOE ( NOESY ) были изучены при исследовании основного панкреатического ингибитора трипсина (ОПИТ), маленького глобулярного белка с 58 остатками аминокислоты и молекулярной массой 6500 [9.7, 9.10, 9.11, 9.15, 9.28 — 9.31]. Как показано на нижней правой треугольной части 2М-спектра NOE на рис. 9.7.4, имеются три области, представляющие наибольший интерес NOE между протонами разных амидов (треугольная область, отмеченная штриховыми линиями), между амидами и С Н-протонами (прямоугольник, обрамленный пунктиром) и между амидами и С Н-протонами (прямоугольник, обрамленный штрихпунктирными линиями). Некоторые примеры идентификации линий показаны в верхнем левом треугольнике. [c.619]

Основное внимание мы будем уделять тем белкам, структура которых в ативном состоянии была (расшифровала с 1по мощью рентгеноструктурного анализа лизоциму, рибонуклеазе, миоглоби-ну, гемоглобину и инсулину. Некоторое внимание будет уделено трипсину, химотрипсину и их предшественникам, а также цитохрому, для которых структура известна частично или, по крайней мере, определена последовательность аминокислот. В основном исследования выполнялись с помощью протонного магнитного резонанса, но ограниченное применение в специальных исследованиях получил и ЯМР других ядер ( Р, Р, и др.). [c.348]