Био-гель диск-электрофорез

Исследование электрофоретической подвижности лактатдегидрогеназы методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (с. 94) [c.338]

Еще лучшее разделение дает диск-электрофорез [40, 41], при котором используют дискретную (прерывающуюся) разделительную систему из различных буферных растворов и работают с акриламидными гелями, имеющими различные размеры пор. Несколько (минимум два) слоев геля с различными pH наслаивают один на другой, благодаря чему процессу разделения предшествует концентрирование компонентов и в результате получаются очень узкие полосы белков. [c.351]

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка. [c.46]

Рис. 1.11. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат).

В настоящее время, сочетая методы экстракции буферными растворами, хроматографии на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой и диск-электрофореза в полиакриламидном геле, удалось выделить из ткани мозга около 100 различных растворимых белковых фракций. [c.629]

Фнг. 12. Подставка для заполнения стеклянных трубок гелем, входящая в комплект прибора для аналитического диск-электрофореза (описание см. в [c.89]

Приготовление геля. В вакуумной колбе смешивают 7 мл раствора Б, 3,5 мл раствора В и 17 мл раствора А и с помощью вакуумного насоса удаляют из смеси воздух. Затем добавляют 0,7 мл раствора Г и, смешав, заполняют полученным раствором стеклянные трубки прибора для диск-электрофореза, как рекомендуется [c.92]

В основном эта методика соответствует обычной прописи для диск-электрофореза, детально описанной Дэвисом [99]. Однако подготовка для электрофокусирования осуществляется несколько проще и быстрее. Для достижения хорошего разрешения нет необходимости готовить несколько слоев геля и формировать плоскую поверхность столбика. [c.324]

Образец можно вносить при формировании геля или же наслаивать сверху, как в обычном диск-электрофорезе. В первом случае при подготовке рабочего раствора необходимо ввести поправку на объем образца и несколько уменьшить количество воды. Наслаивание образца производится после сборки всего прибора или даже после создания градиента pH предварительным электролизом. Для этого верхнюю часть трубок заполняют 1%-ным раствором амфолитов-носителей в 5%-ной сахарозе. В электродные камеры осторожно заливают электролиты, а затем с помощью микрошприца или тонко оттянутой пипетки наслаивают образец (в 10%-ном растворе сахарозы) на поверхность геля. [c.325]

Определение общего содержания белка в муке семядолей мутантов проводили по Барнштейну. Затем методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле исследовали альбумины и глобулины семян, извлеченные 10%-ным раствором поваренной соли из обезжиренной муки. Навеска — 1,0 г. [c.85]

Р и с. 10.1. Прибор для диск-электрофореза. Показаны верхний и нижний резервуары перед сборкой [слева) и в составе прибора после образования гелей в трубках (справа). [c.228]

Из этих исследований видно, что для разделения 23 S и 16 S РНК метод электрофореза в геле по чувствительности, разрешающей способности и скорости анализа превосходит метод центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или хроматографию на колонке метилированного альбумина на кизельгуре (МАК). Используя метод диск—электрофореза, после окрашивания или сканирования в УФ-свете можно обнаружить уже 1 мкг нерадиоактивной РНК, тогда как в случае метода центрифугирования в градиенте плотности сахарозы или хроматографии на МАК нужны в 100 раз большие количества. Применяя капилляры или [c.246]

Диск-электрофорез в геле [c.258]

Использование диск-электрофореза в полиакриламидном геле, т. е. электрофореза в неоднородной разделяющей среде, добавляет к этому эффект концентрирования, что позволяет проводить разделение белков из разбавленных растворов без их предварительного когщентрирования. [c.94]

Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсуль-фата натрия в присутствии р-меркаптоэтанола, распадаются на отдельные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значительно превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последующем разделении с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле белковые зоны распределяются на электрофореграммах таким образом, что подвижность белковой зоны обратно пропорциональна логарифму молекулярной массы. Метод дает возможность определять молекулярные массы субъединиц олигомерных белков. Электрофоретическое разделение можно проводить различными методами. Ниже описаны два из них метод Вебера и Осборн, а также метод, предложенный Лэммли. [c.119]

Исследуют изозимный состав лактатдегидрогеназы в гиалоплазме сердечной и скелетной мышц крысы методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле. [c.339]

Для исследования спектра И. используют ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез и изоэлектрофокусирование, а также иммунохим. методы с использованием антител. Наиб, широко используется диск-электрофорез в полиакриламидном геле. Однако применение только этого метода для поиска И. недостаточно, т. к. он не позволяет выявить генетически разл. формы ферментов, не различающиеся по заряду. В связи с этим для более полной характеристики спектра И. необходимо применять иммунохим. аиализ и сравнивать спектры И. мутантов. При выявлении И. необходимо избегать условий выделения, при к-рых возможно возникновение артефактных форм. Так, для предотвращения частичного протеолиза в процессе выделения и хранения работу часто проводят в присут. ингибиторов протеаз. При разделении мембранных ферментов необходимо максимально снижать концентрацию детергента, что позволяет избежать появления новых форм в результате образования мицелл с разным содержанием искомого мембранного фермента. Процедура выделения И. должна быть максимально сокращена по времени. [c.202]

Электрофорез (электрофорез без носителя, электрофорез на носителе гель-электрофорез, диск-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, изотахоэлектрофорез, иммуноэлектрофорез ) Ионообменная хроматография Аффинная хроматография [c.347]

Поперечносшитые полиакрилимидные гели оказались прекрасными носителями и разделительными матрицами для электрофоретического разделения белков в способах, основанных на плоском слоевом электрофорезе, таких как ДИСК-электрофорез, ДДСН-ПААГ-электрофорез или ИЭФ. Это указывает на гидрофильный характер таких гелей, которые проявляют только слабые взаимодействия с биомолекулами. В КЭ возможно также покрытие кварцевой поверхности акриламидом. [c.75]

Диск-электрофорез обычно проводят в узких стеклянных трубках, содержащих два разнопористых геля, Б ходе электрофореза в верхнем относительно более крупнопористом геле происходит концентрирование смеси, а в нижнем мелкопористом — ее разделение. Верхний и нижний гели готовят на различных буферных растворах, которые в свою очередь отличаются от буфера в электродных сосудах. [c.148]

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ. dis ontinuous-прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями pH и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле-10, а в полиакриламидном геле-до 18 разных белковых фракций. [c.31]

В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле —методы двухмерного электрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций. [c.32]

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фоьсусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в ввде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая [c.32]

Кристаллизация фермеявляется сложным методом их очистки и применяется для субстанций, проше1Щ1их концентрирование и многоступенчатую очистку [49]. Кристаллическое состояние не является единственным критерием гомогенности ферментного белка, а требует дополтштель-ного подтверждения другими методами (диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, ультрацентрифугированием и др.). Методы и техника кристаллизации подбираются индивидуально для каждого фермента. [c.170]

Проблема гомогенности белков в свое время решалась относительно просто с помощью традиционных методов анализа. Препарат считали гомогенным, если он не делился на фракции при электрофорезе или при ультрацентрифугировании. В настоящее время эти критерии гомогенности утратили свое значение. В нашем распоряжении появились более чувствительные методы исследования и стали обязательными более строгие показатели гомогенности. Ионообменная хроматография и электрофорез в геле являются сейчас наиболее чувствительными методами выявления так называемой микрогетерогенности белковых препаратов, какова бы ни была ее природа. Термин микрогетерогенность предложили Синг [82] в 1943 г. и Колвин с сотр. [6] в 1954 г. Из методов электрофореза в геле наиболее чувствительным для анализа микрогетерогенности белков оказался вертикальный диск-электрофорез. При использовании этого метода требуются весьма малые количества необходимого для исследования материала, с его помощью можно одновременно анализировать большое число образцов и к тому же он отличается высокой разрешающей способностью. Диск-электрофорезом можно обнаружить микрогетерогенность препарата даже в том случае, [c.31]

Принцип метода. Миграция и разделение белков происходят в небольших цилиндрических колонках полиакриламида. [Термин диск-электрофорез происходит от дископодобной формы фрагментов колонки геля, в которых содержатся фракции, а также от английского слова dis ontinuous , которым названа неоднородная ( прерывистая ) буферная система, обычно используемая в этом методе.] [c.88]

Одним из наиболее значительных преимуществ этого метода является его пригодность для исследования очень небольших количеств белка или пептидов. Это особенно ценно, например, для анализа разбавленных элюатов, получаемых при хроматографии и гель-фильтрации. Диск-электрофорез позволяет анализировать эти элюаты без предварительного концентрирования. [c.92]

Диск-электрофорез в акриламидном геле, содержащем мочевину. Раствор А 8М раствор мочевины (24,0г перекристаллизован-ной мочевины растворяют в 50 мл деионизованной воды и муравьиной кислотой доводят pH до 3,2). Раствор Б 30%-ный цианогум. Раствор В 0,12 мл N, N, N, N -тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД) в 25 мл раствора А. Раствор Г насыщенный раствор персульфата калия. [c.92]

За последние пять лет преимущество разделения белков при помощи микрометодов получило общее признание. В 1965 г. Гроссбах [1] описал модификацию диск-электрофореза на полиакриламидном геле для определения 10 г количеств белка с помощью стеклянных капилляров. В 1966 г. авторы этой главы предложили микрометод разделения белка в количествах 10 — 10 г при использовании полиакриламидного геля в стеклянных капиллярах, имеющих диаметр 200 мк [2]. В 1967 г. Фельген-хауер [3] описал подобный метод для разделения 10—30 мкг белка с разрешающей способностью 1—3 мкг для одного белка. Гофман [4] для микроэлектрофореза белков вместо стеклянных капилляров применил плексигласовую камеру. [c.277]

Диск-электрофорез проводили по методу [3, 4] в аппарате Кеапа , в котором угольные электроды заменены платиновыми. Белки разделяли в щелочной среде (т мс-глициновый буфер, pH 8,3, разделяющий гель, pH 8,9) при температуре 5—7° и силе тока из расчета 5—8 мА на одну электрофоретическую трубочку. Белковые компоненты характеризовали по относительной электрофоретической подвижности (ОЭП), толщине (Т, см) и интенсивности окрашивания зон в столбиках геля. [c.85]

Единственное в мировой литературе практическое пособие по новому методу электрофореза в гелях. Метод диск-электрофореза за последние годы не только все шире применяется в научно-исследовательских лабораториях, но и внедряется в практику медицинских учреждений. В книге рассмотрены теоретические основы метода, способы очистки реактивов и приготовления геля, окрашивание и денситометрирование разделенных компонентов, результаты применения диск-электрофореза в различных областях биологии и медицины. [c.280]

Метод окрашивания полисахаридов перед электрофорезом [478] использовали Павленко и Оводов [479] для анализа ряда нейтральных и кислых полисахаридов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Для разделения различных компонентов полидисперсных декстранов и амилопектинов с помощью диск-электрофореза ими использованы буферы, содержащие тетраборат натрия (или борную кислоту), трис(гидроксиметил)-аминометан и натриевую соль ЕВТА при pH 9,2—9,3. Электрофорез в полиакриламидном геле используют также для анализа пектиновых веществ [480] и сульфатированных полисахаридов из морских водорослей [481], однако основной областью применения данного метода в химии углеводов является исследование гликопротеинов [482] и гликозаминогликанов (483, 484]. В по- [c.75]

В недавно введенной модификации метода электрофореза в гелях используется ступенчатое изменение концентрации ионов буфера и pH. Этот модифицированный метод называется диск-электрофорезом. Он дает некоторое увеличение разрешающей силы, а аппаратура сконструирована таким образом, что подлежащий анализу материал концентрируется в тонком слое, прежде чем диффундировать в гель, где происходит электрофоретическое разделение. Таким образом, можно использовать достаточно разбавленные растворы. Подробные практические и теоретические данные можно найти в работе Орнстейна и Дэвиса [40]. [c.48]

При проведении гель-фильтрации в препаративном масштабе, например при очистке ферментов и антител, часто приходится идти на компромисс, выбирая между высокой степенью разрешения и большой скоростью потока. Таким образом, хорошее разделение в какой-то мере приносится в жертву при использовании более крупных частиц геля, позволяющих быстрее пропускать через колонку нужный объем жидкости. Пористость частиц должна быть подобрана (часто эмпирически) так, чтобы можно было разделить как можно больше компонентов и чтобы на кривой элюирования нужный компонент располагался между Уо и Уо+У1. Для этого успешно применяется либо только одна гель-фильтрация, либо гель-фильтрация в сочетании с другими способами разделения. Молекулярную массу растворимых белков можно определять с помощью гель-фильтрации на сефа-дексах 0-75 и 0-100 [30, 50]. Для этого строят график линейной зависимости отношения Ух1Уо, где Ух — объем пика неизвестного компонент-э, а Ко — свободный объем, от логарифма молекулярной массы ряда ферментов и белков с известными молекулярными массами. Молекулярную массу неизвестного компонента находят по графику. Этот очень полезный метод в основном вытеснен сейчас другим, более быстрым и удобным методом диск-электрофореза в геле (разд. 16.5.1). [c.225]

Диск-электрофорез в его многочисленных вариантах, позволяющий проводить разделение макромолекул, стал в астоящее время очень важным методом, применяемым в биологических и медицинских исследованиях, а также в клинической диагностике и промышленности (для контроля за технологическими процессами). С тех пор как в 1959 г. Орнстейн [67] и Дэвис [64] впервые описали метод прерывистого электрофореза, проводится широкое изучение всех аспектов гель-электрофореза, в результате чего был внесен большой вклад в разработку теории этого метода, получена подробная информация [c.258]

Рис. 16.10. Слои геля и поведение ионов при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле. А. Образец в геле. Б. Образец, сконцентрированный иа границе раздела между гелем-прокладкой и разделяющим гелем. В. Образец, разделенный на полосы в коиие процесса.

Изоэлектрическое фокусирование применяется как в препаративном, так и в аналитическом вариантах. Для аналитических целей используют методики, очень сходные с диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, при этом полиакриламид с низкой степенью сшивки служит в качестве антиконвекционной среды. Для препаративного разделения можно использовать готовое оборудование или изготовить его самим. [c.276]

Хорошо известно, что при разделении белков с помощью диск-электрофореза в одной полосе не всегда -содержится только один белок, т. е. разделение сложных смесей может быть неполным. Наиболее эффективный подход предусматривает две стратегии разделения на основе различий в размерах молекул и в значениях р1. Например, образец можно вначале подвергнуть изо-электрическому фокусированию в полиакриламидном геле. Затем гель извлекают из трубки или (если электрофорез проводился на пластине) вырезают узкую полоску геля. Эту полоску помещают у верхнего края новой пластины геля в том месте, где обычно делают канавки для образцов, и закрепляют ее растопленным агаром. Проводят второй этап разделения — гель-электрофорез в присутствии ДСН, после чего гель окрашивают. Пример особенно эффективного разделения белков этим методом описан О Фарреллом [77], которому удалось обнаружить 1000 белков в экстракте клеток Es heri hia oli. [c.278]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология