Химотрипсин зависимость активности

Известен еще один способ активации КФ, связанный с действием протеолитических ферментов [23, 24, 48, 111—ИЗ]. В ранних работах в препаратах КФ из мышц был обнаружен белковый ки-назо-активирующий фактор (КАФ), повышающий активность фермента при pH6,8 [ИЗ—115]. Этим фактором оказалась Са +-зависимая протеиназа [116]. Эффект активации фермента при ограниченном протеолизе трипсином и химотрипсином наблюдали также при изучении КФ из сердца и мозга [38, 115, 117]. Активирующее действие эндогенных протеиназ выявлялось при хранении очищенных препаратов КФ, которые за две недели при 4°С активировались в 12 раз [23]. Имеет ли физиологическое значение активация КФ протеолизом, пока остается неясным. Однако он широко использовался для изучения регуляторных свойств и функциональной роли субъединиц КФ [21, 23, 54, 112, ИЗ, 118, 119]. В нашей работе с этой целью был применен субтилизин, действие которого вызывало 10-кратное увеличение активности КФ при рн 6,8. Одновременно с активацией фермента исчезала зависимость активности от Са . Такое же явление оказывало действие трипсина [14]. Протеолиз КФ субтилизином протекал более медленно, чем протеолиз трипсином, и это давало возможность детально анализировать изменение активности и структуры фермента во времени. Под действием протеиназ первой разрушалась -а-субъединица. Если сравнить активацию фермента цАМФ-зави- симой протеинкиназой, которая главным образом зависела от фосфорилирования р-субъединицы, то активация протеолизом коррелировала с деградацией а-субъединицы. Следовательно, механизмы этих двух путей активации различны., хотя в обоих случаях [c.62]

Хотя карбоксильная группа полностью погружена вглубь белковой глобулы, она окружена полярными остатками и связанными с белком молекулами воды. Было высказано предположение, что погруженная карбоксильная группа ионизирована в активном протонированном состоянии фермента позже это предположение подтвердилось (гл. 5, разд. Ж.2.е) [74]. Еще один сюрприз преподнесли исследователям данные, полученные с помощью ЯМР [75], а затем и с помощью ИК-спектроскопии [76], которые показали, что группа, ионизующаяся с р/Са 7, принадлежит погруженному внутрь белковой глобулы аспарта-ту, а не His-57 (гл. 5, разд. Ж.2). Если эти данные правильны, то имидазол His-57 остается непротонированным в химотрипсине вплоть до pH 2, поскольку на графике зависимости активности от pH не обнаруживается данной стадии ионизации при низких pH [77]. [c.364]

Обработкой данных табл. 18 в координатах Лайнуивера-Берка можно показать, что профлавин является конкурентным ингибитором а-химотрипсина. Однако зависимость в координатах (Кт(кяж), [I]) в данном случае является нелинейной (рис. 68), в отличие от простого конкурентного типа ингибирования. Одной из возможных причин подобной зависимости может быть связывание с активным центром фермента двух молекул конкурентного ингибитора [c.141]

Рис. 106. Определение значения рКа ионогенной группы активного центра фермента из кривой рН-зависимости деацилирования транс-циннамоил-химотрипсина

Рис. 116. Определение температуры конформационного перехода активного центра а-химотрипсина по температурной зависимости эффективной константы скорости инактивации фермента под действием ультразвука

Существует множество примеров зависимости катализа и связывания от конформационных изменений. Участок связывания химотрипсина решающим образом зависит от наличия солевого мостика между аспарагиновой кислотой-194 и концевой аминогруппой изолейцина-16 (см. рис. 24.1.14). В неактивном предшественнике химотрипсина, химотрипсиногене, например, каталитические группы расположены так же, как и в нативном ферменте, но гидрофобный карман отсутствует [49]. Последний формируется в результате индуцированных образованием солевого мостика изменений конформации аспарагиновой кислоты-194 и соседних остатков аминокислот — глицина-193 и метионина-192. Согласно кинетическим экспериментам, проведенным на химотрипсине, нечто подобное происходит при протонировании свободной формы (ЫНг) изолейцина-16. Форма фермента, характерная для высоких значений pH, неактивна, так как она не способна связывать субстрат. При быстром понижении pH раствора неактивной формы фермента с 12 до 7 связывание наблюдается, но только по прошествии определенного отрезка времени (менее секунды), во время которого фермент принимает активную конформацию [111]. В этом случае конформационное изменение должно предшествовать связыванию и явно слишком медленно для того, чтобы являться частью нормального механизма. [c.516]

Рис. 12.3. Зависимость от pH при низкой ионной силе (Г/2 = 0,001) активности химотрипсина (1), полианионного производного химотрипсина на сополимере этилена с малеиновой кислотой (2) и поликатионного производного химотрипсина с поли-Ь-орнитином (3), определенной по гидролизу этилового эфира М-ацетил-Ь-тирозина [17].

Об активном центре эстераз мы знаем еще довольно мало. Илюется много оснований думать, что наряду с серином в него входит гистидин. Это следует, во-первых, из данных но фотоокис-лительной инактивации ферментов, во-вторых, из зависимости активности фермента от pH. Кривые активности ферментов как функции pH имеют характерную колоколообразную форму. Для сахаразы п трипсина подобные кривые изображены на рис. 50. Их можно истолковать как результат наложения двух кривых титрования. Так, например, можно полагать, что для действия трипсина необходимо, чтобы какая-то группа с р порядка 5—6 и вторая группа с рК 8—9 находились в ионизованном состоянии. Первая группа — кислая, вторая — основная. У химотрипсина [c.149]

Ферменты, катализирующие гидролиз (гидролазы), расщепляют пептидные связи в белках и пептидах. Представители этого класса ферментов пепсин желудочного сока, трипсин, химотрипсин, амино-пептидаза кишечника, гипаза, фосфатаза и т. д. Активность действия таких ферментов зависит от pH среды. Кривая, выражающая зависимость активности ферментов от pH, проходит через максимум. Положение максимума зависит от природы фермента. Многие ферменты проявляют повышенную активность в изоэлектрическом состоянии (см. 78). [c.131]

Влияние pH на скорость ферментативных реакций может быть обусловлено различными факторами. Ферменты, подобно другим белкам, являются амфолитами и имеют большое число ионоген-ных групп. Если функционирование фермента зависит от наличия некоторых специфических группировок, то каждая из них в дан-ных условиях должна находиться в определенном состоянии (не-ионизированном или ионизированном). Нередко оказывается возможным идентифицировать участвующие в катализе ионогенные группы активного центра путем анализа зависимости активности фермента от pH и сопоставления полученных данных с известными величинами р/С ионогенных групп белков (табл. 5.2). В качестве примеров можно указать на идентификацию каталитически активных остатков гистидина в активных центрах трипсина, химотрипсина и субтилпзина и тиоловой группы в активном центре папаина (гл. 9). На участие ионогенных групп в функционировании ферментов указывает также влияние ионной силы на скорость ряда ферментативных реакций (это влияние сильно выражено при действии карбоксипептидазы и уреазы). Такого рода эффект обычно наблюдается при неферментативном катализе, осуществляемом ионогенными соединениями. [c.260]

Константы равновесия в том и другом случае отличаются незначительно (в 2—4 раза). В то же время при переходе от профлавина к родамину 6Q процесс комплексообразования красителя с активным центром замедляется почти в 10 paat Структуры молекул этих лигандов различаются в основном лишь тем, что молекула родамина 6Q содержит дополнительное бензольное кольцо. Как показало изучение температурной зависимости кинетики комплексообразования, энергия активации этого процесса порядка 17 ккал/моль (71,4 кДж/моль). С другой, стороны, известна, что энергия активации процессов, контролируемых диффузией, не превышает, как правило, 5 ккал/моль (21 кДж/моль) [62, 63]. Поэтому следует заключить, что образование комплекса химотрипсина с более объемной молекулой родамина 6G возможно лишь в результате конформационных изменений в молекуле фермента. Такой механизм (1.8) комплексообразования органических молекул с белками, по-видимому, весьма распространен. [c.31]

З-образный характер зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в катализе химотрипсином. Изменение среды в результате добавки органических соединений также оказывает заметное влияние на эффективность сорбции на активном центре химотрипсина гидрофобных компонентов реакции. Причина этого заключается, как правило, в том, что органическая добавка, повышая растворимость субстрата (или субстратоподобного ингибитора) в воде, удерживает его в водном растворе и затрудняет тем самым [c.145]

Величина называется временем релаксации. При анализе зависимости времени релаксации от равновесных концентраций Е и А могут быть найдены элементарные константы скорости реакции (5.197). В качестве примера на рис. 69 приведены кинетические данные реакции комплексообразования активного центра а-химотрипсина с красителем ак-рифлавином [41]. Представленные экспериментальные данные хорошо описываются уравнением (5.206). По тангенсу угла наклона и отрезку, отсекаемому на оси ординат, найдены, соответственно, константы скорости процесса комплексообразования 12 = 2,4-10 М" -с , = = 2,7-10 с-1. [c.208]

В качестве примера рассмотрим механизм комплексообразования с активным центром а-химотрипсина красителя профлавина [411. Кинетическая кривая комплексообразования описывается суммой двух экспоненциальных членов. Из их цоказателей были найдены два времени релаксации и т . На рис. 70 представлена зависимость функции от суммы равновесных концентраций фермента и красителя. В соответствии с уравнением (5.214) по тангенсу угла наклона этой зависимости определяется константа скорости Отрезок, отсекаемый на оси ординат, дает сумму констант 21 + 23 + Соответственно из зависимости функции от равновесных концентраций фермента [c.210]

В таблице 5 приведена температурная зависимость константы ассоциации диэтилглутарата с активным центром а-химотрипсина [5]. Определить значения стандартных энтальпии и энтропии комплексообразования. [c.253]

Трипсин и химотрипсин, очевидно, имеют второй активный центр, содержап ий гистидин. Второй участок удален от первого, но на спиральной цепочке они сближены. Установление активной роли гистидина основывалось частично на изменении скорости ферментативной реакции в зависимости от pH, что соответствовало предположению о стратегическом расположении слабоосновного остатка, имеющего характер гистидина. Даже сам имидазол также катализирует гидролиз простейших сложных эфиров (БрюИ С" и Шм Ир 1965—.19i57 Бендер, 1957). 7 о, что фермент в 10 раз эффективнее, чем имидазол, имеет аналогию в модельных опытах по мутаротации глюкозы — реакции, катализируемой кислотами и основаниями. о -Оксипиридин, содержащий кислотный и основной центры (оба относительно слабые), более эффективен как катализатор, чем смесь пиридина и фенола (Свайн, 1952). И в а-окси-пиридине, и в протеолитическнх ферментах бифункциональность повышает каталитическую активность, поскольку протоны могут быть одновременно поданы и отщеплены в сопряженной реакции. Механизм действия, предложенный, Нейратом (1957) для химотрипсина, сводится к следующему. При взаимодействии гидроксильной группы серина с имидазольным кольцом гистидина отщепляется протон и образуется активированный комплекс П, имеющий электрофильный и нуклеофильный центры. [c.714]

При высоких значениях pH скорость действия химотрипсина падает, и характер рН-зависимости указывает на существование в активном центре группы с рЛ[а от 8 до 9. Это значение рКа может относиться к N-кoнцeвoй аминогруппе Ие-16. Аминогруппа Пе-16 участвует в образовании одной из связей, расщепляемых при превращении зимогена в активный фермент. Эта аминогруппа образует ионную связь (ионную пару) с остатком Азр-194 (рис. 7-2), который находится рядом с сери-ном активного центра. Возможно, ионная связь способствует поддержанию фермента в нужной для реакции конформации. Депротонирование при pH выше 8—9 должно вызывать инактивацию [39]. [c.112]

Активность химотрипсина проявляется при pH 7—9,. но она несколько меняется в зависимости от субстрата [128]. Максимальный гидролиз некоторых синтетических субстратов, например бензоил-/-тирозиламида, наблюдается при pH 7,8. [c.199]

КИМ реакциям химотрипсина. Ацилирование, а тзкже алкилирование иодуксусной кислотой зависят от групп с кажущимися рКз 4,2 и 8,2 (колоколообразный профиль зависимости от pH), в то время как дезацилирование зависит только от остатка с рКа около 4. Возникает обоснованное и в этом случае справедливое заключение, что группа с больщим р/Са представляет собой Н5-группу остатка цистеина активного центра, который в процессе реакции ацилируется и поэтому отсутствует в ацилфер-менте. [c.499]

Каким образом могут влиять на активность ферментов некоторые свойства носителей или тип присоединения фермента и насколько сильно это влияние, показано ниже на нескольких примерах. Один из наиболее важных факторов — состав реакционноспособных групп. Датта и Оллис [10] исследовали зависимость удельной активности иммобилизованного а-химотрипсина от концентрации гидразидных групп на поверхности гранул биогеля Р-2 (рис. 12.1). Обнаружено, что кривая зависимости имеет острый максимум. На химотрипси-не, лизоциме и липазе изучались изменения удельной активности не только после их иммобилизации, но одновременно и после обработки растворимыми аналогами носителей с теми же химическими группами, которые использовались для связывания белка с поверхностью носителя. Во всех случаях наблюдалась корреляция поведения модифицированных ферментов в растворимом состоянии и в иммобилизованном виде. Манеке и Фогт [33] исследовали количество иаиаи-на, связанного с носителями на основе поливинилового спирта, в зависимости от концентрации на носителе реакционноспособных диазониевых групп. Как следует из табл. 12.2, с возрастанием количества реакционноспособных групп носителя количество связанного папаина проходит через максимум, в то время как относительная активность постепенно понижается. Одной из причин такого уменьшения активности может быть неблагоприятное влияние многоточечного присоединения молекул фермента к носителю, который содержит избыток реакционноспособных групп. Подобные результаты были получены также с иммобилизованным ненсином [53]. Препараты, содержащие 13 мг связанного пепсина на 1 г сухого носителя, имели относительную протеолитическую активность 92,8%, содержащие 46,8 мг/г — 65,7%, 50,8 мг/г — 45,3%, а 65 мл/г — 37,8%. [c.425]

Этим же методом Массей, Харрингтон и Хартли [34] исследовали энзимы — химотринсин и химотрипсиноген. Для метки употреблялось то же вещество. Авторы отмечают, что работа с энзимами осложнена недостаточной стабильностью образующихся комплексов и требует ряда предосторожностей и специальных приемов. Поляризация люминесценции позволяет изучить полимеризацию энзимов с увеличением концентрации и определить число мономеров в полимере. Это число различно для различных энзимов — для химотрипсина оно составляет 4—8, для химотрип-синогена — 2, причем отдельные молекулы соединяются в последнем случае в стык , образуя цепочку. Это следует из найденного отношения осей эллипсоида. Кроме того, у энзимов найдено новое явление, которого Вебер на белках не наблюдал,— степень поляризации меняется в зависимости от того,, сколько молекул красителя связано с макромолекулой, следовательно, изменяется отношение времени вращательной релаксации ко времени жизни возбужденного состояния. Используя это явление и данные других методов (в частности, центрифугирования и изучения биохимической активности энзимов), авторы смогли подойти к вопросу о природе биохимической активности энзимов. [c.340]

Одним из первых фактов, выяснение которых позволяло прийти к определенным заключениям о строении активного центра ферментов, было открытие, что диизопронилфторфосфат ДФФ) подавляет активность химотрипсина, причем подавление активности находится в стехиометрической зависимости от количества добавленного ДФФ, и что при использовании ДФФ, меченного метка включается в химотрипсин 116]. С тех пор биохимики значительно продвинулись вперед в решении этой проблемы. В настоящее время известно, что ДФФ вступает во взаимодействие с многими [c.107]

Активность фермента можно охарактеризовать различными способами одним из наиболее иллюстративных способов является указание числа оборотов фермента, т. е. числа полных каталитических циклов, которые данный биокатализатор соверщает в единицу времени. Число оборотов может изменяться в очень щироких пределах в зависимости от функций, выполняемых ферментом в клеточных структурах, он должен действовать более или менее активно. Число оборотов медленно работа-щих протеолитических ферментов невелико и составляет, например для химотрипсина, величину, лежащую в интервале от 0,01 до 10 циклов в минуту. С другой стороны, один из наиболее деятельных ферментов каталаза, разлагающая перекись водорода, имеет число оборотов, равное 10 в минуту. Активность фермента не является строго постоянной величиной даже в одних и тех же условиях данный фермент может обнаруживать различную активность, если он получен из разных источников. Многие ферменты способны существовать в неактивной форме, которая превращается в активную под влиянием специфических веществ. Как было показано Опариным, различные ферменты растительных клеток инактивируются частично или полностью при адсорбции и активируются в результате десорбции. Связь активности с деталями строения субклеточных структур будет рассмотрена ниже более подробно. [c.58]

Простейшей и наиболее непосредственной моделью гидрофобного связывания является перенос соединения из водного раствора в другую фазу, которой может быть как само изучаемое соединение в жидком состоянии, так и. любая другая неводная фаза. Свободная энергия этого переноса, вычисленная из коэффициентов распределения между двумя фазами или в случае жидкого соединения, по данным растворимости дает грубую оценку свобод-но11 энергии, ожидаемой для гидрофобного взаимодействия с участием этого соединения. Так, связывание ряда углеводородов с сывороточным альбумином и ряда углеводородных ингибиторов с активным центром химотрипсина в каждом случае обратно пропорционально растворимости этих углеводородов в воде [17, 18]. Зависимость логарифма растворимости от энергии связывания свидетельствует о том, что изменения в структуре углеводорода влияют на его энергию связывания с сывороточным альбумином приблизительно вдвое слабее, чем на растворимость, в то время как в случае ингибиторов химотрипсина влияние па ингибирующую способность и растворимость почти [c.307]

Прж реакции химотрипсина (ХТ) с фосфорорганичесними ингибиторами (ФОИ), имеющими ионизованные уходящие группы -З(сн2)д3(сн2)с2н , бимолекулярные константы скорости фосфорилирования оказались в более чем на порядок величины меньшими, чем можно было ожидать, исходя из данных по электрофильной реакционной способности этих соединений . Чтобы выяснить, не является ли отмеченный "эффект заряда" результатом электростатического отталкивания заряженного радикала ФОИ от некой положительно заряженной группировки на активной поверхности ХТ , в настоящей работе были определены рН-зависимости бимолекуляр-ных констант скоростей фосфорилирования для ФОИ настоящее место работы сектор биохимии Института кибернетики АН ЭССР, г Таллин, [c.837]

Данные, полученные в основном при исследовании хим1отрип ои на, указывают а то, что в каталитическом процессе участвует гистидин. Нужно отметить, что гистидин не является соседней с серином аминокислотой в приведенной выше последовательности аминокислот и не находится в витке спирали, соседнем с витком, в котором расположен серин. Возможно, что гистидин мог бы приводиться в непосредственный контакт с серином в результате изгиба спирали, хотя найдено, что пролин, т. е. аминокислота, которая препятствует суш,е-ство1ванию спиральной конфигурации, может находиться довольно близко от серина в химотрипсине и трипсине. Эксперименты, показавшие, что гистидин является составной частью активной области, включают 1) фотоокисление, поз1волившее выявить соответствие между потерей гистидина и потерей ферментативной активности [338] 2) построение кривых зависимости pH — активность, которое дало основание связать активность с группой, имеющей р/С имидазола (гистидина), но не серина 3) модельные опыты на неферментативных системах, показавшие, что гидролиз эфиров фосфорной и карбоновых кислот очень сильно катализируется имидазолом (гистидин), но очень слабо катализируется спиртом (серин). Последние два аргумента, являющиеся сомнительными, детально будут обсуждаться позднее. Сообщалось, однако, что фрагмент трипсина, не содержащий гистидина, еще сохраняет в значительной степени ферментативную активность [339]. [c.133]

На основании последующих исследований был сделай вывод, что кз катализируемого химотрипсином гидролиза этилового эфира ацетил-/,-тирозина, этилового эфира ацетил-1.-трш1тс>фана и амида aцeтил-L-тиpoзинa зависит от ионизации группы с кажущейся р/Са, равной 6,7 (388, 389]. Эти данные можно объяснить участием имидазольной группы гистидина о каталитическом процессе. Применение метода, заключающегося в изучении влияния pH в стадии катализа, является само по себе важным достижением в деле изучения активной области гидролитических ферментов, так как ранее обычно рассматривалась только графическая зависимость общей скорости ферментативных реакций от pH, имеющая колоколообразную форму. [c.143]

Смотреть страницы где упоминается термин Химотрипсин зависимость активности: [c.424] [c.426] [c.150] [c.224] [c.110] [c.146] [c.109] [c.404] [c.273] [c.262] [c.427] [c.186] [c.264] [c.698] [c.84] [c.86] [c.583] [c.590] [c.48] [c.58] [c.143] [c.225] [c.267] [c.272]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология