Ингибиторы холинэстеразы, определение

Определение ингибиторов холинэстеразы [c.173]

Как осуществляется полуколичественное определение ингибиторов холинэстеразы при помощи субстрат-индикаторной бумаги [c.181]

Бензофосфат, как и некоторые другие органические соединения фосфора, является ингибитором холинэстеразы. Он задерживает разложение ацетилхолина холинэстеразой. Это свойство холинэстеразы используют для обнаружения, а иногда и для количественного определения органических соединений фосфора. [c.107]

Ежедневное опрыскивание коров или их корма или хлевов в течение 14 дней препаратами диброма в концентрации, необходимой для уничтожения хлевных мух, не вызывало появления в коровьем молоке ни диброма, ни какого-либо другого ингибитора холинэстеразы (предел точности определения диброма составлял 0,004 ч. на млн. [411]). [c.169]

Во время хирургических операций (чаще по поводу аппендицита) под местной анестезией вырезали у людей кусочки кожи. При определении локализации холинэстеразы в норме тотчас после вырезания их фиксировали в 10% нейтральном формалине. В опытах по определению изменения активности холинэстеразы под воздействием фосфорорганического ингибитора на вырезанный кусочек кожи перед его фиксацией наносили водную эмульсию вещества, через 15—30 мин или 1 ч ее удаляли с помощью фильтровальной бумаги. И лишь после этого кожу фиксировали в нейтральном формалине. [c.141]

В качестве примера, иллюстрирующего применение этого метода, на рис. 29 приведены результаты исследования кинетики торможения активности холинэстеразы сыворотки крови лошади фос-форорганическим ингибитором — армином [99]. Из данных рисунка видно, что только при определенной концентрации ингибитора зависимость llv t от t является линейной. Вычисленная на основании найденной концентрации фермента и скорости гидролиза ацетилхолина величина молекулярной активности холинэстеразы оказалась равной 7-10 мин. , что удовлетворительно совпадает с результатами, полученными при использовании других методов. [c.125]

Однако изложенные выше методы не позволяют получать вполне индивидуальные холинэстеразы достаточной для определения молекулярного веса степени чистоты, что в значительной степени затрудняет прямое определение молекулярной активности. В связи с этим были разработаны специальные методы измерения молекулярной активности, основанные на использовании специфических ингибиторов. [c.166]

Уже в самом начале исследований было ясно, что речь идет о действительно высоко специфической реакционноспособности ФОС определенного строения, поскольку их ингибирующий эффект проявлялся практически только лишь в отношении холинэстераз, причем в необычайно низких концентрациях ингибитора (часто порядка 10 — 10 М). Обнаруженная одновременно способность ФОС ингибировать некоторые протеолитические и эсте-ролитические ферменты не имела, по-видимому, практического значения для биологической активности ФОС и проявлялась при значительно (на несколько порядков) более высоких концентрациях. [c.204]

Выше было отмечено, что при реакции иона тетраалкиламмония (в составе субстрата холинэстераз или ингибитора) с анионным центром активной поверхности фермента, помимо чисто кулонов-ского взаимодействия, имеет значение строение алкильных радикалов у четвертичного атома азота. Это свидетельствует об участии определенным образом расположенных в пространстве алкильных групп при азоте в реакции с активной поверхностью холинэстераз. Возникает, однако, вопрос, какова относительная роль электро- [c.231]

На этом основании был сделан вывод, что собственно фосфорилирующая способность исследованных соединений одинакова, а различия в константах скорости ингибирования холинэстераз определяются различной скоростью их сорбции на ферменте. Это подтвердили и результаты определения констант скорости отдельных ступеней реакции (к , к-ь, к,) фосфорорганического ингибитора (I) с ферментом (Е). [c.326]

Определение активности холинэстеразы электрометрическим ДрН-методом Способ может быть использован для определения 50 и концентрации ингибитора [c.172]

При использовании этой реакции в качестве основы аналитического метода избыток холинэстеразы инкубируют в течение определенного времени с исследуемым ингибитором — пестицидом, его производным или метаболитом. Затем в систему вносят ацетил-холин и определяют его гидролиз через известный интервал времени. При этом протекают следующие реакции [c.16]

Оптимизация определений необратимых ингибиторов холинэстераз-достаточно сложный и трудоемкий процесс. Поэтому при вьшолнении анализа строго соблюдают последовательность операций по подбору фер-мергга, составу реакционной среды, концентрации субстрата и др Эго позволяет снизить пределы обнаружения ингибитора и повь сить то шость определений [c.291]

Определение обратимых ингибиторов холинэстераз менее распространено Тем не менее в настоящее время разработано множество тестов на основе холинэстераз для определения ионов тяжелых металлов и хлорорганических пестицидов [89,90], являющихся обратимыми ингибиторами Интерес представляет способ оценки общей токсичности водопроводной воды, основанный на суммарном эффекте снижения фермета-тивной активности холинэстеразы при введении в систему субстрат-фермент анализируемой пробы. Пределы обнаружения обратимых ингибиторов существенно зависят от природы ингибитора и субстрата. [c.291]

ГАЛАНТАМИН (нивалин), алкалоид из клубней подснежников. Гидробромид Г. (крист,, трудно раств. в воде, не раств. в сп.) — обратимый ингибитор холинэстеразы. ГАЛЛЕИН [пирогаллолфталеин 4,5,6-триокси-9-(2-карбок-сифенил-ЗН-ксантен-З-он) ф-лу см. в ст. Триоксифлуоро-ны], темно-красные крист, не растворяется в воде, раств. в СП., водно-спиртовых р-рах к-т и щелочей. Реагент для фотометрического определения Sn(IV) и ЗЬ(П1) в водно-спиртовой [c.117]

Определение цианокса. Для превращения цианокса в цианоксон, который является более сильным ингибитором холинэстеразы, пластинку подвергают действию паров брома, для чего ее выдерживают в течение 50—60 с в эксикаторе, содержащем насыщенный раствор (50 мл) брома в воде. Избыток брома удаляют нагреванием пластинки при 60°С в течение 20 мин. [c.122]

II. Методы, в которых в качестве субстрата используется карбокситиохолин. Упоминавшийся ранее (стр. 169) электрохимический метод основанный на измерении степени деполяризации платинового электрода, был использован для определения фосфорорганических ингибиторов холинэстеразы 5. При продолжительности инкубации 10 мин было определено 2 10 мкг/мл зарина и 1 10" мкг/мл систокса (меркаптофос). [c.176]

Величина (и, следовательно, различные возможные значения /50) для взаимодействия ингибитора с определенным видом холинэстеразы зависит от pH и температуры. Влияние изменения pH на степень угнетения холинэстеразы под действием ТЭПФ было использовано Вильсоном для выяснения строения активной поверхности истинной холинэстеразы электрического угря (рис. И). Он считает, что строение молекулы ТЭПФ не зависит от pH, а изменения, которые видны на рис. 11, отражают изменения степени ионизации активных центров фермента. Об этом было сказано выше (стр. 34). Здесь же достаточно отметить, что наличие оптимума pH для процесса торможения холинэстеразы ФОС является результатом изменений эстеразного центра. Если молекула ФОС содержит группу, которая при реакции с холинэстеразой взаимодействует с анионным центром фермента, то картина оказывается еще более сложной, так как величина заряда анионного центра тоже зависит от pH [17]. Если группа, связывающая анионный центр, является, скажем, четвертичным азотом (например, в фосфопиристигмине), то она не изменяется при сдвигах pH. Но если эта группа содержит третичный азот (как в тетраме), то ее строение (или степень ее протонизации) в большой степени зависит от pH. Такая структурная модификация приводит к изменению сродства ингибитора к активной поверхности фермента, что в свою очередь влияет на другие эффекты, вызываемые изменением pH [81 ]. [c.101]

Лучший из известных колориметрических методов определения холинэстеразы основан на измерении количества ацетилхолина, остающегося к концу реакции с помощью методики Хестрина [43]. Использование этой методики для определения активности холинэстеразы описали Меткаф [70], Роббинс и др. [901, Флейшер и др. [33] и Винсент и Сегонзак [108[. Преимущество метода состоит в его исключительной чувствительности, вследствие чего он особенно пригоден для измерения очень малых количеств фермента, например в микроопределениях, применяемых для выявления отравлений ФОС, или в исследовании небольших остаточных количеств ФОС у тяжело отравленных животных. Многие ингибиторы холинэстеразы создают помехи при пользовании этим методом, и поэтому он малоудобен для изучения угнетения холинэстеразы 1п уТ1го. [c.435]

На основе принципа ИМФ был разработан удобный метод определения тироксина в сыворотке человека. В качестве индикаторного фермента использовали ацетилхолинэстеразу, а в качестве модулятора фермента — связанный с тироксином ингибитор холинэстеразы (Finley et al., 1980). За 1 ч были исследованы 75 образцов. Результаты оказались четкими, точными и воспроизводимыми. Описана также методика определения тео-филлина, построенная по тому же принципу (Ble ka et al., 1983). [c.15]

Для удобства применения холинэстеразы иммобилизуют в по.шмер-ные пленки или гели. При этом существенно увеличивается устойчивость фермента к влиянию внешних факторов. Так, при иммобилизагщи холинэстеразы в желатиновый гель срок ее хранения составляет 2-3 года, а при непрерьганой работе активность препарата падает на 20% лишь через 10 дней. Наряд) с повьпиением стабильности иммобилизация хо.пинэстераз обеспечивает многократное использование препарата. Заметим, что при определении необратимых ингибиторов, например фосфорорганических пестицидов, повторное использование фермента в каждом случае требует специальных исследований В качестве реактиваторов применяют гидро-ксиламин, оксимы и др [c.290]

Т. анализируют спектрофотометрич. методом, основанным на его р-ции с нитропруссидом Na или 5,5-дитио-6ис-(2-ш1тро6еизойной к-той, амперометрич. титрованием в присут. соед. Hg и др. На определении Т. основаны методы определения активности холинэстераз и их ингибиторов. [c.586]

В аналитических исследованиях в связи с иммобилизованными ферментами необходимо упомянуть ферментные электроды [21], ферментные термисторы [40] и ферменты, ковалентно связанные с полистиролом или найлоном для целей автоматического анализа [24, 46]. Гильбо [22], например, использовал ферментные электроды для определения глюкозы, мочевины, L-аминокислот, галактозы, ацетилхолина и дегидрогеназ. Ферхмеиты, связанные с капиллярными реакторами, использованы в соединении с автоанализатором фирмы Te hni on для анализа различных субстратов, таких как глюкоза, мочевина и мочевая кислота [55]. Гудзон и др. [20] описали применение иммобилизованной холинэстеразы для контроля воздуха и воды, для обнаружения ингибиторов фермента, таких, как пестициды. Система характеризуется чрезвычайной чувствительностью. Например, органофосфат параоксон может быть обнаружен в количествах 1 10 в воздухе и воде. [c.442]

Полученное нами значение молекулярной активности холинэстеразы сыворотки крови лошади несколько отличается от величины, измеренной другими авторами. Так, Берри [100] при определении молекулярной активности холинэстераз, исходя из того же представления о стехиометрических отношениях при действии фосфорорганических ингибиторов, исследовал зависимость между степенью снижения активности фермента (Ди) и концентрацией добавленного ингибитора [I]. В качестве ингибиторов автором были использованы дициклогексилфторфосфат (формула П1) и диэтил-я-нитрофенилфосфат (формула IV) . [c.167]

Приведенные представления и результаты исследования кинетики действия карбаматов на ацетилхолинэстеразу показывают, что определение величины для таких ингибиторов, исходя из зависимости активности фермента от концентрации ингибитора, необоснованно. Это очень отчетливо можно проиллюстрировать результатами исследования кинетики ингибирования двух типов холинэстераз серией производных карбаминовой кислоты [75]. [c.198]

Как уже упоминалось, основные трудности при определении констант скорости реакции необратимого ингибитора с ферментом состояли в практической невозможности измерения молярной концентрации холинэстераз, а также в затруднениях регистрации хода реакции во времени из-за высокой скорости процесса даже при очень низких концентрациях ингибитора. Эти трудности былй преодолены путем измерения скорости реакции в условиях избытка ингибитора, когда бимолекулярная реакция может быть сведена к псевдомономолекулярной. [c.204]

Для оценки силы антихолинэстеразного действия препаратов мы пользовались величиной /50, которую получали при определении активности проб фермента, предварительно экспонированных в течение 10—12 мин. при 38—39° с разными концентрациями ингибитора. Определение активности холинэстераз производилось по принципу, использованному Платт-пером и Галером (1928) с тем отличием, что количество ацетилхолина, оставшееся неразрушенным после контакта с энзимом, определялось не па биологическом объекте, а фотоколориметрически, по методу Хестрина (1949). В качестве источника истинной холинэстеразы использовалась кровь коровы, в качестве источника ложной холинэстеразы — сыворотка крови лошади. [c.463]

Примером Ф. м. а. ингибиторов является ультрамикрометод определения фосфорорганич. инсектицидов, основанный на способности последних необратимо ингибировать активность холинэстераз. Измеряя активность фермента в отсутствие и в присутствии ингибитора и пользуясь калибровочным графиком зависимости степени подавления активности от концентрации анализируемого вещества, можно определить ничтожное его количество. Так, чувствительность метода определения диэтил-га-нитрофенплтио-фосфата (после предварительного окисления) и диэтил-тг-нитрофенилфосфата составляет ок. 0,015 мкг. Микрометоды определения этих и других инсектицидов в воде и пищевых продуктах имеют особо важное значение в связи с их высокой токсичностью для человека и животных. [c.206]

Все приведенные выше способы определения активности холинэстеразы, соответственно модифицированные, могут быть использованы и для определения ингибиторов. Исключением является маноме- [c.173]

Можно сделать вывод, что для псевдохолинэстеразы ei = I, а для истинного фермента ei = 2 (см. также VII,6). В последнем случае было показано, что одиночный четвертичный ион соединяется с ферментом, по меньшей мере в интервале концентраций, используемых при определении (Iso) [57]. (При более высоких концентрациях ингибитора могут образоваться соединения ЕЬ. Результаты, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что один положительно заряженный атом азота соединяется с двумя анионными центрами холинэстеразы, как показано на рис. 10 последний иллюстрирует тот факт, [c.316]

Приведенные выше рассуждения позволяют сделать вывод, что реакция протекает во времени, т. е. чем дольше ингибитор контак-тируется с ферментом, тем глубже торможение активности [70, 76]. Теоретически можно представить, что даже очень слабое антихолинэстеразное вещество может затормозить холинэстеразу на 100/О при достаточно продолжительном контакте. (На практике такие явления чрезвычайно редки [76] из-за одновременного процесса неспецифического фосфорилирования вследствие этого остатки аминокислот, не входящие в активный центр фермента, могут связывать ФОС.) Молярная концентрация ингибитора, вызывающая торможение фермента на 50%, называется ho- Этот параметр, а также величина р/50 (отрицательный десятичный логарифм До) изменяются во времени, поэтому они могут быть определены только при условии, если продолжительность инкубаций известна. Более достоверным параметром для определения силы ингибитора (т. е. его сродства с активными центрами холинэстеразы) является бимолекулярная константа скорости при определенных температуре и pH. Однако параметр ho значительно более распространен в литературе, так как его размерность (молярная концентрация) является более наглядной и облегчает вычисления в уме, а размерность бимолекулярной константы скорости л-моль- -мин-смущает всех своей сугубой химично-стью. В общем продолжительность инкубации, описанная в литературе, не слишком сильно отличается в разных работах (обычно эти различия лежат в пределах 1 час), так как почти всегда весь опыт — приготовление растворов, инкубация и определение активности —-занимает несколько часов. [c.98]

Уилсон и Коэн нашли, что около 25"о общей холинэстеразы является внутренней , а остальная часть — наружной . Однако количественные определения в этих условиях очень затруднены, потому что в опытах на интактных препаратах никогда нельзя уверенно оценить концентрацию субстрата в местах расположения фермента, а насытить систему субстратом невозможно, так как известно, что избыток субстрата тормозит активность холинэстеразы. На рис. 33 представлены некоторые результаты исследования действия ингибиторов на холинэстеразу нерва краба (данные для ДФФ не приведены). Авторы считают, что ингибиторы могут быть разбиты на два класса а) простигмин, ТЭПФ и декаметоний, которые избирательно тормозят внешний фермент, и б) ДФФ и эзерин, которые угнетают как внутреннюю , так и внешнюю холинэстеразу. По мнению авторов, это объясняет тот факт, что вещества класса б блокируют нервную передачу, в то время как соединения класса а лишены этой способности. Необходимо отметить, что различие между простигми-ном и декаметонием, с одной стороны, и эзерином—с другой, выражено недостаточно четко (ТЭПФ является исключением). Приведенные данные трудно интерпретировать потому, что в них не видно зависимости между ионизацией и проницаемостью. Так, эзерин, который при pH 7 ионизирован на 91% (его рКа = 8,0 [143]), проникает легко, в то время как ТЭПФ не проникает, хотя он не ионизирован и, как известно, способен проникать через ионные барьеры [144]. Было бы интересно провести аналогичное исследование с более тщательным подбором условий в отношении концентрации веществ и времени их воздействия. При рассмотрении рис. 33 создается впечатление, что оба эти фактора выбраны несколько произвольно. Более серьезной проблемой является отсутствие данных [c.219]

Первый метод (если применяются гомогенаты) встретил возражения в связи с возможностью возникновения артефактов, главным образом в результате перераспределения составных частей ткани при гомогенизации. При этом ингибитор, который в неповрежденной ткани пространственно отделен от фермента, может вступить с ним в контакт [137, 179]. Кевиц [99], например, перед определением высушивал и экстрагировал ткань (диафрагму мыши) хлороформом и на протяжении первых 10 час после отравления параоксоном нашел более высокую активность холинэстеразы, чем в не-экстрагированной ткани (рис. 34). Вероятно, в более поздние сроки избыток параоксона разрушался тканевыми ферментами. Однако Блебер и Кризи [26] считают, что процедура Кевица ведет к спонтанной реактивации угнетенной холинэстеразы и поэтому полученные им результаты являются артефактом. [c.221]

Часто возникает вопрос, в какой мере определение активности холинэстеразы может быть использовано для оценки тяжести поражения Рассмотрим прежде всего ситуацию (не встречающуюся при отравлениях вследствие несчастного случая), когда точно известна активность фермента у данного субъекта до отравления. Обычно у людей может быть изучена только активность холинэстеразы эритроцитов и плазмы. Как показали Гроб и др. [86а], маловероятно, чтобы активность этих ферментов могла находиться в причинно-следственной связи с симптомами отравления. Скорее всего опалишь отражает положение вещей в более важных участках, какими, по-видимому, являются центральная нервная еистема, нервно-мышечное соединение и некоторые ганглии. Во всех случаях только истинная холинэстераза может считаться жизненно важным ферментом, и поэтому не удивительно, что уровень холинэстеразы плазмы служит очень плохим показателем отравления особенно такими избирательными ингибиторами, как ДФФ. Фермент плазмы может быть почти полностью угнетен без появления тяжелых симптомов отравления. Более показательной является холинэстераза эритроцитов, возможно, вследствие ее сходства с жизненно важным ферментом. При отравлении человека ДФФ (3 мг/кг) первые симптомы появились, когда уровень холинэстеразы эритроцитов снизился до 70%, а тяжелые симптомы — когда активность стала ниже 40%. В то же время при применении меньших доз (1 мг/кг) активность фермента эритроцитов могла быть снижена до 25% без появления симптомов [86а]. Такое же несоответствие обнаружено у крыс, собак и обезьян, отравленных ДФФ [107]. [c.223]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология