Кристаллография белков

Кристаллография белков использует метод изоморфного замещения, в котором кристаллы нативного белка погружают в раствор соли металла, для того чтобы позволить тяжелым атомам занять места в кристаллической структуре. Положения более легких атомов остаются практически неизменными таким образом, подобные производные с тяжелыми металлами оказьшаются изоморфными с исходной макромолекулой, т. е. они характеризуются той же пространственной группой и практически неизменными параметрами элементарной ячейки. Разница в интенсивностях 1ш Для изоморфных кристаллов целиком определяется вкладом различных тяжелых атомов, положение которых можно определить при помощи синтеза Паттерсона. Подобная информация от по меньшей мере двух дополнительных изоморфов позволяет рассчитать фазовые углы и, затем, распределения электронной плотности для кристаллов белков. [c.409]

После классических работ Перутца, Кендрью и Филлипса кристаллография белков стала быстро развиваться во многих научных центрах. К 1970 г. с помощью рентгеноструктурного анализа были получены трехмерные структуры 18 белков, к 1975 г. - 79, к 1979 г. - 161, к 1989 г. -400. Сейчас это количество приближается к трем тысячам. Одновременно кристаллография белков все больше приобретает для биологии универсальное значение и, наконец, становится неотъемлемой частью исследований, направленных на решение фундаментальных научных и прикладных задач. В настоящее время знание молекулярной пространственной структуры во многом определяет уровень работ и значимость получаемых результатов. [c.74]

По прошествии более трех десятилетий со времени расшифровки структур миоглобина и гемоглобина рентгеноструктурный анализ все еще остается единственным прямым методом определения на атомном уровне пространственного строения белковых молекул, их комплексов и доменов. Полученные с его помощью данные по-прежнему служат незаменимой экспериментальной основой изучения структурно-функциональной организации молекул белков. В 1990-е годы этот метод, по-прежнему сохраняя высокий темп экстенсивного развития, позволил приступить к решению принципиально новых задач, представляющих первостепенный интерес для молекулярной биологии. Основная, если не единственная, причина наметившегося качественного роста возможностей кристаллографии белков связана с использованием вместо излучения рентгеновских трубок синхротронной радиации. [c.74]

Если стереохимический генетический код не столь же однозначен, как химический генетический код, то можно ли все же его использовать для получения ориентировочных данных с целью последующего уточнения, аналогично тому, как, например, используются рентгеновские дифракционные картины грубого разрешения в кристаллографии белков [c.530]

Влияние аммониевой соли и pH на роль связанной воды В структуре белка [12] еще не совсем ясно и, по-видимому, способно объяснить значительные различия, наблюдающиеся в кристаллографии белков, особенно гемоглобина и миоглобина. Наличие некоторых более мелких пиков, отнесение которых еще не сделано, может быть обусловлено присутствием других молекул воды, фоновыми шумами или ошибками, возникающими ири обрыве ряда Фурье. Данные с более высоким разрешением (1,5 А) были получены с помощью недавно разработанных более быстрых методов, основанных на использовании двумерного счетчика, чувствительного к положению рассеивающего центра . Эти данные в настоящее время анализируются. Карты с более высоким разрешением позволяют анализировать фракцию связанной воды вплоть до степеней заселенности менее 0,2. Исследования со смесями НгО/ОгО различного состава еще более увеличат достоверность химической идентификации этих пиков, получаемых при использовании фурье-метода. [c.229]

В кристаллографии белков термин изоморфизм обычно применяют к производным белков с тяжелым атомом, так называемым изоморфным производным, а метод использования этих производных носит название метода изоморфных замещений. Различные тяжелые атомы, которые вводят в кристалл, не обязательно занимают одно и то же место в разных производных. [c.216]

Другая проблема, также связанная с подготовкой кристаллов к съемке, возникла значительно позже, когда в принципе была решена фазовая проблема и встала задача получения кристаллов изоморфных производных. На первых же порах, после получения прекрасных дифракционных снимков глобулярных белков, требовалось решить вопрос об их расшифровке. В чем же заключалась новизна рентгеноструктурного анализа глобулярных белков по сравнению с анализом малых молекул и фибриллярных белков Суть рентгеноструктурного анализа любого монокристалла состоит в определении амплитуд всех дифрагированных лучей (отражений) и их фаз. Зная амплитуды и фазы, можно воспроизвести распределение электронной плотности элементарной кристаллической ячейки и, следовательно, найти ее геометрические параметры, а также параметры структуры образующих ее молекул. Амплитуды определяются по интенсивностям рефлексов, но найти фазы путем непосредственных измерений нельзя. В связи с этим как в кристаллографии малых молекул, так и в кристаллографии белков возникает так называемая фазовая проблема - основная проблема расшифровки любой кристаллографической структуры. В рентгеноструктурном анализе малых молекул для ее решения разработаны прямой метод, метод Паттерсона, метод проб и ошибок, метод изоморфного замещения. Со временем каждый из них приобрел целый ряд [c.40]

После создания метода, позволившего решить в кристаллографии белков проблему фаз и преодолеть трудности получения нужных кристаллов нативного белка и его изоморфных производных, встала задача измерения интенсивностей отражений в дифракционной картине. Она также не имела аналогий, поскольку касалась измерений, несопоставимых с кристаллографией малых молекул по числу дифрагированных лучей, многие из которых малоинтенсивны. Ощутимый прогресс Б решении этой задачи наступил только в конце 1960-х годов, после создания полностью автоматизированных дифрактометров. В последующие годы сцинтилляционные счетчики, способные регистрировать отдельные кванты рентгеновского излучения, были соединены с прибором, автоматически перемещающим кристалл и детектор с одного дифрагированного луча к другому, что привело к достаточно эффективной и точной регистрации интенсивности. В последнее время усовершенствование эксперимента направлено на создание источников рентгеновского излучения повышенной яркости и монохроматичности. Однако при этом возрастает опасность радиационного разрушения образца, вполне реальная в кристаллографии белков. [c.45]

К представленному выше материалу о Т-лимфоцитах кристаллография белков прямого отношения не имела. В значительной мере поэтому почти все то, что было сказано о функционировании Т-клеток, молекулярных структурах поверхностных белков и их комплексов, природе и побудительных мотивах антитело-антигенных взаимодействий, работе сигнальных систем и регуляторных механизмов носит общий, феноменологический и предположительный характер. Рентгеновские данные о трехмерных структурах мембранных белков и их отдельных доменов, участвующих в функционировании Т-клеточной иммунной системы, начали появляться лишь в 1990-х годах. Поскольку речь идет главным образом о структурах мембранных белков, то использование метода рентгеновской дифракции в клеточной иммунологии сталкивается с большими препаративными трудностями, не в полной мере еще преодоленными. Впрочем, аналогичная ситуация и во всех других направлениях молекулярной биологии, имеющих дело с изучением явлений, протекающих на поверхности клеток. Поэтому при оценке обсуждаемых ниже конкретных результатов рентгеноструктурного анализа следует учитывать, что они означают только обнадеживающее начало широкого проникновения метода в проблематику Т-клеточной иммунологии. [c.70]

Представление о чисто химических аспектах ферментативных реакций аспартатных протеиназ сформировалось еще до становления кристаллографии белков. Детальные исследования неферментативного гидролиза разнообразных эфиров, амидов и модельных пептидов, проведенные главным образом в 1960-е годы, показали, что катализ оказывается эффективным лишь в среде, включающей следующие три [c.81]

Таким образом, разработанные схемы ферментативного катализа примечательны в том отношении, что они исходят, по существу, из одного и того же экспериментального материала, включающего данные рентгеноструктурного анализа, полученные в последние годы, и базируются на одних и тех же теоретических представлениях о природе биокатализа, сложившихся до становления кристаллографии белков и давно ставших традиционными. На несовершенство сделанных обобщений указывает то обстоятельство, что при единстве исходного опытного материала и теоретической основы, а также в рамках одного подхода была предложена не одна стереохимическая модель функционирования аспартатных протеиназ, а четыре различные модели, которых, впрочем, могло бы быть и больше. Они не образуют ряда, свидетельствующего о количественном развитии знаний о механизме действия ферментов, а скорее представляют собой букет различных точек зрения. Рассмотренные гипотезы отвечают одному уровню понимания изучаемого явления и равноценны как в своей аргументации, так и предсказательной силе. Что же привнесла нового в изучение каталитических реакций аспартатных протеиназ и других ферментов рентгеновская кристаллография белков [c.104]

Итак, с появлением рентгеноструктурного анализа ферментов не произошел переход от умозрительных представлений о ферментативном катализе к строгому количественному описанию этого явления. Не изменилась также направленность биокаталитических исследований, по-прежнему следующих от функции к структуре, что неслучайно, поскольку результатом рентгеноструктурного исследования может быть лишь знание морфологии биосистем атомно-молекулярного уровня, которое само по себе не является конечной целью изучения ферментов. Морфология объекта — это всегда нечто предварительное и совершенно необходимое для последующего изучения структурной и структурно-функциональной организации биосистем. Выяснение с помощью рентгеноструктурного анализа пространственного строения многих сотен молекул ферментов не решило проблему биокатализа, но сделало реальным разработку подхода к изучению ферментативного катализа в направлении от структуры к функции и априорному количественному описанию механизма каталитической реакции. Благодаря развитию кристаллографии белков проблема создания общей теории биокатализа и соответствующих методов расчета впервые обрела форму подлинно научной проблемы, решаемой на уровне современных естественнонаучных знаний. [c.107]

В кристаллографии белка разрешение определяется минимальным межплоскостным расстоянием (dJJ ), в пределах которого собраны дифракционные данные (нли р пределах которого значения фактора рассеяния Р включены в расчет рядов Фурье). Фактор расходимости К контролирует эффективность уточнения и определяется цо формуле [c.147]

Самой сложной проблемой рентгеновской кристаллографии белка является фазовая проблема. Именно она около двух десятилетий, когда уже имелась полная ясность в отношении всех других принципиальных вопросов рентгеноструктурного анализа, сдерживала расшифровку дифрагированных белковыми кристаллами пучков лучей, построение карт электронной плотности и установление трехмерных молекулярных структур. Реконструирование пространственного строения белка по наблюдаемым в дифракционной картине многим тысячам рефлексов возможно лишь при знании амплитуды и фазы каждого из них. И если значение амплитуды можно оценить путем прямого измерения интенсивности вторичного рентгеновского излучения, то фаза есть расчетный параметр, нахождение которого непременно связано с привлечением дополнительного экспериментального материала. [c.156]

НЕЙТРОННАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ БЕЛКОВ [c.164]

Два десятилетия (1960—1970-е годы) рентгеноструктурный анализ был единственным методом прямого исследования пространственного строения белков. Его роль и сейчас остается доминирующей. Однако в начале 1980-х годов появились новые методы, дополняющие рентгеноструктурный анализ. Они основаны на применении в кристаллографии белков дифракции нейтронов и гамма-лучей. Эти методы сходны с рентгеноструктурным анализом прежде всего использованием одного и того же состояния исследуемого образца — это также белковый монокристалл и изучаемым явлением — дифракцией, но дифракцией уже других излучений. Явления, происходящие во взаимодействии атомов, упорядоченных в кристаллической решетке молекул белков, с нейтронами и гамма-излучением, сильно отличаются друг от друга и от того, что имеет место при взаимодействии атомов с рентгеновским излучением. Поэтому получаемые от трех методов дифракционные картины не полностью совпадают между собой, а дополняют друг друга, раскрывая новые свойства белковых молекул. Рентгеновские лучи рассеиваются электронной плотностью. Рассеивающая 164 [c.164]

Кристаллическая структура белка - это очень сложным образом полученная и, по-видимому, самая дорогая во всех отношениях фотография. Представленное на ней изображение позволяет увидеть многие детали внутреннего устройства белковой глобулы. Но, как и любая другая фотография, она не раскрывает природы внутренних связей и принципы организации изображенного объекта, его возможного поведения при изменении внешних условий. Кристаллография белка - это морфология биосистемы молекулярного уровня. Для перехода к изучению физиологии белка одной фотографии кристаллической структуры белка, т.е. одной морфологии, недостаточно. На приведенной ниже схеме показана цепочка субординационных взаимоотношений между функцией белка (в данном случае, фермента) и его химическим и пространственным строением. Из схемы видно, что наблюдаемая структура белковой молекулы не имеет непосредственной связи с реализуемой каталитической функцией. Существующая же связь, во-первых, направлена не от функции к структуре, а от структуры к функции, т.е. в сторону, противоположную традиционному направлению поиска, и, во-вторых, включает три промежуточных звена и требует последовательного решения трех задач. [c.76]

Ко времени моего приезда теории Фрэнсиса вышли далеко за пределы кристаллографии белков. Его влекло все мало-мальски значительное. [c.14]

Кроме того, Дж.Д. Бернал и И.Фанкухен уже исследовали ВТМ рентгенографическими методами. Одного этого было достаточно, чтобы испугаться гениальность Бернала давно уже вошла в пословицу, а я не мог и надеяться овладеть кристаллографической теорией так, как овладел ею он. Я даже не сумел понять многие страницы в их классической статье, опубликованной в самом начале войны в Журнале общей физиологии . Это было довольно странное место для подобной публикации, но Бернал тогда был поглощен оборонной работой, а Фанкухен, к тому времени вернувшийся в Штаты, решил поместить сообщение о полученных результатах в таком журнале, за которым следят люди, интересующиеся вирусами. После войны Фанкухен охладел к вирусам, а Бернал, хотя и не оставил вовсе кристаллографию белков, но в основном занимался установлением взаимопонимания с коммунистическими странами. [c.67]

Рентгеноструктурные исследования, оказавшие огромное влияние на развитие кристаллографии белков, принадлежат У. Астбэри. Выбрав в качестве критерия структурный признак, он по наблюдаемым дифракционным картинам разделил фибриллярные белки на две группы. В первую (группа к.т.е. .) вошли кератин, миозин, эпидермин, фибриноген, а во вторую (группа коллагена) - белки сухожилий, соединительных тканей, хрящей и др. У. Астбэри обнаружил, что белки группы к.т.е.Г, имея [c.68]

В 1950 г. публикуется исследование Л. Брэгга, Дж. Кендрью и М. Пе-рутца, в котором сообщаются не только вновь полученные авторами данные рентгеноструктурного анализа миоглобина и гемоглобина, но анализируется сложившаяся в кристаллографии белков общая ситуация. Авторы подводят итог предшествующим исследованиям в этой области и в заключении формулируют важную гипотезу о родственном пространственном строении белков, которая представляет собой дальнейшее, подкрепленное новыми наблюдениями развитие взглядов Астбэри и Хаггинса на структурное единство белковых молекул. [c.70]

Л. Брэггу и М. Перутцу в 1954 г. удалось впервые продемонстрировать возможность расчета знаков рефлексов в дифракционной картине гемоглобина, что означало решение одной из самых трудных проблем кристаллографии белков - проблемы фаз. Это было достигнуто методом изоморфного замещения, идея которого была подсказана авторам Дж. Берналом. Путь к получению трехмерных структур криталлизующихся белков на атомном уровне был открыт. В 1960 г. Дж. Кендрью и сотрудники построили атомную модель молекулы миоглобина с разрешением 2,0 А, а в 1968 г. М. Перутц и сотрудники - модель молекулы гемоглобина с разрешением 2,2 А. Так был завершен титанический труд кристаллографов Кавендишевской лаборатории, продолжавшийся более четверти века. [c.72]

Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. Пер. со словацк. 1977. 1—51 Берлинер Л. (ред.). Метод спиновых меток. Яер. с англ. 1979. 6—20 Бландел Т., Джонсон Л. Кристаллография белка. Пер. с англ. 1979. 6 р. [c.335]

Подобные счетчики принято называть позиционно-чувствительными детекторами (см. Бландел Т., Джонсон Л. Кристаллография белка. Пер. с англ. — М. Мир, 1979, с. 267, 521).— Поим, перев. > [c.229]

Обычно в кристаллографии белков для расчетов по разностному методу Фурье используются коэффициенты ю( Ез — / Е )ехр( гаЕ) . Поскольку вклад, соответствующий структуре нативного фермента, вычитается, то суммирование рядов Фурье позволяет получить изображение различий между структурами Е и Е5. Если некоторые атомы белка смещаются в результате комплексообразования, то на их месте появляются участки с отрицательной электронной плотностью. На предварительных разностных картах комплекса с глицилтирозином при разрешении 2,8 А хорошо наблюдалось расположение атомов тирозильной группы. Однако глицильный остаток субстрата, который на рис. 15.6 и 15.8 находится над атомом цинка, особенно его карбонильная группа, был виден плохо. Причиной этого могло быть то, что при связывании субстрата электронная плотность небелкового происхождения вблизи атома цинка замещалась на эквивалентную ей. Были рассмотрены две возможные ориентации глицильной части субстрата. Более вероятная из них предполагает образование связи между атомом металла и кислородом карбонильной группы [2]. [c.518]

Перутц (Perutz) и сотрудники разработали метод тяжелых атомов для рещения проблемы фазы в кристаллографии белка [c.193]

Систематическая работа с белками началась в конце 1920-х годов У. Астбери, который был привлечен для решения проблемы пространственного строения шерстяных волокон У. Брэггом. Позднее в содружестве со специалистами по химии шерсти он изучал с помощью рентгеноструктурного анализа фибриллярные белки, начав с кератина (см. гл. 1). Другой выдающийся ученик школы У. Брэгга, Дж. Бернал, начал в 1934 г. изучение кристаллических глобулярных белков. Он работал с И. Фанкухеном и Д. Кроуфут (Ходжкин). Вскоре к ним присоединились М. Перутц, бывший студент Л. Брэгга, избравший в 1937 г. предметом своей диссертации определение кристаллической структуры гемоглобина, Д. Райли и Дж. Бойес-Уотсон. С 1946 г. сначала вместе с М. Перутцем, а потом самостоятельно в этой области начал работать Дж. Кендрью, также ученик Л. Брэгга, а с 1955 г. -Д. Филлипс. Если сюда же присоединить Ф. Крика, ставшего заниматься белками в 1949 г., то получим почти полный список лиц, создавших кристаллографию белка и вьшолнивших пионерские исследования по расшифровке трехмерных структур белковых молекул. Путь к этому прошел через решение следующих проблем 1) получение белковых кристаллов 2) решение проблем фаз 3) получение изоморфных [c.39]

В этой и следующей главах в краткой форме рассматриваются результаты рентгеноструктурных исследований белков, которые в чем-то, например, сложности объектов анализа, их особой познавательной цешюсти или прикладной актуальности, точности определения координат атомов или каких-то методологических и препаративных новшеств, являются на сегодняшний день наивысшими достижениями. Рассмотрение, вероятно, поможет составить представление о состоянии и возможностях рентгеновской кристаллографии белков первой половины 1990-х годов. [c.55]

Для рассмотрения были выбраны такие объекты, которые были интересны в отношении своей струкгурно-функциональной организации и в то же время наглядно иллюстрировали сегодняшние достижения кристаллографии белков. К ним, безусловно, относятся ДНК-связываю-щие белки, принимающие прямое участие как в создании генетического аппарата, так и на всех стадиях его функционирования. Предварительно приводится несколько соображений общего характера о специфических особенностях структурной организации белков и двухцепочечных молекул ДНК. [c.108]

Самым существенным методологическим достижением рентгеноструктурного анализа последнего десятилетия, по-видимому, можно считать начавшееся применение в кристаллографии белков синхротронной радиации, значительно более мощной по сравнению с излучением традиционных источников. В первый период становления рентгеноструктурного анализа, 1960-1970-е годы, большинство трехмерных структур белков было расшифровано с использованием запаянных острофокусных трубок с медным анодом, имеющих характеристическую длину волны X (Ка) 1,54 А И фокусное пятно примерно 8,0 X 0,4 мм. Интенсивность излучения таких трубок ограничивалась скоростью отвода тепла от анода и при малых кристаллах белков с большими элементарными ячейками не обеспечивала желаемого разрешения. В конце 1970-х годов появились трубки с вращающимся анодом и фокусом 2,0 х 0,2 мм. Их яркость, оцениваемая потоком фотонов коллимированного рентгеновского пучка (Ю -Ю фотонов в с), была в несколько раз выше, чем у лучших запаянных трубок, а фокусировка пучка на заметно меньшую площадь позволяла получать дифракционные картины с более высоким разрешением и меньшей экспозицией. В настоящее время рентгеновские трубки с вращающимся анодом и никелевым или графитовым фильтрами применяются в анализе повсеместно. [c.138]

Таким образом, ближайшие перспективы развития рентгеноструктурного анализа белков будут определяться достижениями в использовании синхротронной радиации в трех отмеченных направлениях синтезе и кристаллизации белков, а также условиях проведения эксперимента. Продолжится наметившееся сближение рентгеноструктурного анализа белка с методами малоуглового рассеяния, флюоресценции, криомикроскопии, лазерной, ЯМР- и УФ-спектроскопии и т.д. Сделанные прогнозы касаются кумулятивного развития кристаллографии белка и, следовательно, говорят о его тактических целях. Что же касается стратегического прогноза, то он не может быть известен, поскольку развитие науки, являясь нелинейным неравновесным процессом, не имеет конечной цели и непредсказуемо в принципе. [c.164]