Электрофорез, анализ белков

Тонкие различия в первичной структуре родственных белков часто удается выявить методом отпечатков пальцев . Метод этот состоит в том, что белок подвергают частичному перевариванию с помощью одного или нескольких протеолитических ферментов, а затем разделяют продукты гидролиза и идентифицируют их, пользуясь для этого либо электрофорезом, либо хроматографией на бумаге. На фиг. 32 приведены полученные таким способом отпечатки пальцев , или пептидные карты , нормального и аномального гемоглобинов. Детальное изучение этих пептидных карт показывает, что все пептидные пятна, за исключением одного, идентичны. Таким способом генетически измененный структурный элемент выявляется очень легко, и для установления природы структурного изменения нет надобности устанавливать полную аминокислотную последовательность всей молекулы. Действительно, в ряде случаев весьма определенные указания относительно природы имеющегося замещения можно получить просто исходя из результатов анализа аминокислотного состава соответствующих пептидов, выделенных из двух белков. Но, конечно, однозначные доказательства замены одной аминокислоты на другую получают только после установления аминокислотной последовательности анализируемых пептидов. [c.96]

Электрофорез широко применяется для разделения смесей белков и их детального анализа. О природе диссоциирующих функциональных групп позволяет судить электрометрическое титрование белковых растворов. Во время электрофореза белки движутся в кислых растворах к катоду, а в щелочных — к аноду. Существует, однако, для каждого из них такое значение pH, при котором никакого движения не происходит. Его называют изо-электрической точкой. Белок при изоэлектрическом состоянии содержит положительно и отрицательно заряженные группы в одинаковом количестве. Его суммарный свободный заряд равен нулю. Обычно считают, что в изоэлектрической точке белки являются многовалентными цвиттерионами и содержат большое количество анионных и катионных групп, заряды которых как бы уравновешивают друг друга. Белки обладают дипольным моментом, который в растворах выражается величиной от 100 до 1000 ед. Дебая. Диэлектрическая проницаемость белковых растворов всегда выше, чем растворителей. [c.29]

Методы разделения смесей веществ представляют ценность не только как начальная ступень практически любого эксперимента в области исследования биополимеров, так как выделенный и очищенный белок или нуклеиновая кислота претерпевают с течением времени изменения как в растворе, так и в кристаллическом виде или в виде осадка, но и как методы непосредственного изучения свойств биополимеров. Изучение электрохимических свойств белков, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, полипептидов методами электрофореза и сорбции, изучение их морфологии методами сорбции и хроматографии представляет собой столь же важную область применения этих методов, как и наиболее до настоящего времени распространенное их приложение для фракционирования и анализа смеси веществ. [c.9]

Адсорбция на носителе. При работе с пористым носителем поверхность раздела фаз очень велика и даже сравнительно слабая адсорбция может привести к полной неудаче при электрофоретическом разделении. Причины адсорбции не всегда достаточно ясны. По-видимому, силы неэлектростатического происхождения играют большую роль по отношению к белкам, чем к малым ионам. Адсорбция последних (пептидов, аминокислот и т. д.) связана с наличием ионизованных групп на поверхности носителя. Установлено, что в целлюлозе и крахмале, например, имеется значительное количество карбоксильных групп. Так как эти группы заряжены отрицательно, опасность адсорбции относительно мала для отрицательных ионов, но велика для положительных. Делались попытки уменьшить заряд бумаги этерифи-кацией карбоксилов диазометаном. С белками рекомендуется работать при pH выше их изоточки, тогда электростатическое отталкивание препятствует адсорбции. Этот эффект можно усилить, используя ионообменную бумагу, в которой с поверхностью целлюлозных волокон химически связано значительное число ионизированных групп с зарядом, противоположным заряду исследуемого иона. Для уменьшения адсорбции белков применялись также детергенты иногда помогает предварительная обработка носителя раствором исследуемого белка. Хотя в некоторых случаях эти меры приносят желаемый эффект, адсорбция часто (для белков — почти всегда) наблюдается в той или иной степени при электрофорезе на твердом носителе. Обратимая адсорбция проявляется в уменьшении скорости движения и в образовании хвостов у движущихся зон, что ухудшает разделение и затрудняет количественный анализ. Необратимая адсорбция приводит к тому, что на всем пути зоны остается равномерный след — адсорбированный белок, а количество вещества в зоне постепенно уменьшается. Если это количество мало, зона может вообще исчезнуть по дороге. Иногда адсорбция сопровождается денатурацией белка, частичной или полной потерей его биологической активности. [c.81]

Регуляторные ДНК-связывающие белки прокариот вызывают заметные изменения конформации ДНК. При рентгеноструктурном исследовании комплекса регуляторного белка TFIHA со своим участком ДНК оказалось, что двойная спираль находится в А-форме. Другие изменения (изгибы и изломы двойной спирали) можно обнаружить с помощью электронной микроскопии, электрофореза ДНК-белковых комплексов, а также при действии нуклеаз. Связанный белок защищает от расщепления 15—30 п. о. в месте связывания и порождает два участка повышенной чувствительности к нуклеазам с обеих сторон от места связывания. Тонкий анализ мест гиперчувствительности в хроматине эукариот показал, что они имеют точно такую же структуру — две гипер-чувствительные точки, разделенные защищенны.м участком. [c.257]

После того как установлена первичная структура- какого-либо белка, обычно нет необходимости проводить полное изучение аминокислотной последовательности у гомологичных белков из близких (соответствующих) источников. Быстрый ответ можно получить, используя технику трипсинового фингерпринта . Для этого подвергают гидролизу трипсином белок с известной структурой и параллельно ему гомологичный белок полученные в результате гидролиза пептиды разделяют обычно с помощью двумерного электрофореза или хроматографии. Если разница в последовательностях невелика, то больщинство пептидов должны занимать идентичное положение на двумерном фингерпринте. Те немногие пептиды, которые отличаются по подвижности, необходимо элюи-.ровать и подвергнуть аминокислотному анализу по Эдману. Эта техника особенно полезна при изучении аномальных гемоглобинов, которые отличаются от нормального природой только одного участка. [c.276]

Можно представить себе, что обычный регуляторный ген , активированный соответствующим сигналом дифференциации, инициирует биосинтез всех компонентов клетки, характерных для соответствующей стадии дифференциации. Но это не так. Напрнмер, стадии, необходимые для морфологической дифференциации, регулируются независимо от стадий, необходимых для синтеза медиатора. Эта область исследования бурно развивается п мы должны удовлетвориться кратким описанием, чтобы не утонуть в потоке предварительных наблюдений. Один из методов исследования заключается в действии на подходящую клеточную линию биологических (например, фактор роста нерва, сокращенно NGF рис. 11.3) или искусственных (например, ди-бутирил-сАМР, диметилсульфоксид) стимулов до тех пор, пока нейриты разрастутся параллельно устанавливаются, например, изменения состава ферментов или мембранных белков. Интересно отметить, что в ходе дифференциации in vitro наблюдались только количественные изменения в составе белка таких клеточных линий хотя используемый для анализа метод двумерного электрофореза очень чувствителен, ни один новый белок не был идентифицирован и ни один из ранее присутствовавших белков не псчез. [c.323]

Метод электрофореза широко применяют в клинике для анализа белков плазмы и сыворотки крови. Концентрация белков плазмы составляет 60—80 г/л. Сыворотка крови представляет собой плазму, лишенную фибриногена. При заболеваниях может изменяться как общее количество белков плазмы, так и содержание отдельных белков или белковых фракций без изменения общего количества белка. При некоторых заболеваниях, например при воспалении почек, циррозе печени и др., наблюдается уменьшение содержания белков плазмы (за счет снижения количества альбуминов). Напротив, острые инфекционные заболевания, возникновение некоторых злокачественных новообразований сопровождаются повышенным содержанием белков в крови, чаще всего глобулиновой фракции. Поэтому анализ белков сыворотки крови имеет большое диагностическое значение и позволяет наблюдать за ходом лечения. Суммарный заряд белковой молекулы изменяется в зависимости от pH и при определенном значении pH (изоэлектриче-ская точка) равен нулю. Белок в изоэлектрическом состоянии при электрофорезе не передвигается ни к катоду, ни к аноду, наименее устойчив в растворе и при стоянии выпадает в осадок. [c.31]

С момента разработки этого метода гель-хроматография наиболее часто используется для препаративного фракционирования белков, причем обычно как первый этап разделения. Поскольку разрешающая способность этого метода низка, хроматографические фракции могут содержать несколько компонентов и необходимо дальнейшее разделение другими способами. Анализ смеси неизвестного состава первоначально проводят на гелевой матрице с широким диапазоном фракционирования, собирают фракцию, содержащую интересующий белок, и разделяют ее на геле с 0олее узким диапазоном фракционирования. Выделенную в результате фракцию разделяют далее методом ионообменной хроматографии или электрофореза. [c.106]

Ретикулин, волокнистый белок, был найден в большинстве эмбриональных тканей и в некоторых тканях взрослых особей (селезенке, почках, лимфатических узлах) он состоит из сетки волокон, покрытых аморфным веществом, частично состоящим из углеводов [48]. При обработке ретикулина селезенки пепсином был получен гликопентид [41], который, по-видимо-му, гомогенен по данным электрофореза на колонке. Результаты анализа табл. 2) показали, что в гликопептиде содержится глюкозамин, галактоза и манноза в молярном соотношении 6 1 1 в пептидной части идентифицировано семь аминокислот (аспарагин, глутамин, треонин, лизин, валин, фенилаланин, лейцин). Структура гликопептида, изображенная на рисунке, была предложена Спеллманом [41]. [c.267]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

В ранних стадиях исследования было обнаружено, что хотя бы один из двух белков Р ассоциирован с рибонуклеопротеидным комплексом вирионов [25, 58, 257, 259]. По мере совершенствования условий электрофореза в ПААГ стало ясно, что вирион содержит три дискретных белка Р [112, 133, 200], которые обозначили Р1, Р2, РЗ по порядку уменьшения их электрофоретической подвижности в ПААГ (выявленная м. м. 95 000—82 000). На основе анализа рекомбинантов штаммов A/PR/8/34 и А/НК/68 определили, что 1-й сегмент РНК кодирует белок РЗ, 2-й сегмент РНК — белок Р1 и 3-й сегмент РНК — белок Р2 [194, 217], но у штамма A/FPV/Rosto k/34 кодируемые назначения сегментов РНК отличались [242]. Поскольку обозначение Р1—РЗ, согласно номенклатуре, основано на подвижности в геле, а не на функция , белок Р2 одного штамма может быть функционально эквивалентен белку РЗ другого штамма [7]. [c.42]

Секретированная форма НА оказывается отличной от белка связывания мембраны дикого типа только в одном отношении — в скорости его гликозилирования. Добавка углевода к белкам происходит в две стадии. Как только образующийся белок появляется на открытой просвету потока стороне грубого эндоплазматического ретикулума, преформированные богатые сахарозой олигосахариды переносятся от липидного носителя к определенным аспарагиновым остаткам [13, 21]. Это первоначальное котрансляционное гли-козилирование кора является только первым шагом в тщательно разработанной программе реакций, которые происходят в грубом эндоплазматическом ретикулуме и позднее в аппарате Гольджи, где сахара упорядочены и добавлены к образующемуся белку [13, 26]. Во время биосинтеза НА переход от гликозилированной по кору молек5щы к полной молекуле можно наблюдать при анализе методом SDS-гель-электрофореза белка, меченного S-метионином, или меченных тритием предшественников сахаров в экспериментах с пульсовой меткой. Конечный состав олигосахаридных боковых цепей на завершенных белках штамма дикого типа и А -бел-ках оказывается одинаковым. Однако в противоположность белку связывания мембраны дикого типа, который быстро и относительно синхронно гликозилирован, популяция секреторных молекул становится терминально-гликозилированной через очень длительный период. Возможно, это различие в некоторой степени отражает относительную эффективность, с которой белки связывания мембраны и относящиеся к просвету потока белки изолируются в транспортные везикулы, перемещаемые от грубого эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи. [c.183]

Обе формы сенситизации имеют общую морфологическую и нейрофизиологическую основу, но их молекулярные механизмы принципиально различаются. В основе кратковременной сенситизации лежит независимое от текушей экспрессии генов и обратимое повышение уровня фосфорилирования группы белков в сенсорных нейронах сифона, обусловленное кратковременной активацией аденилапшклазы, сопряженной с пресинаптическими рецепторами 5-НТ. Природа и функция большинства этих белков неизвестна, однако одним из них является белок 5-НТ-чувствительного-канала уменьшение проводимости которого и составляет основу механизма сенситизации. При долговременной сенситизации фосфорилирование тех же белков повышено в течение срока, соответствующего длительности самой сенситизации, причем этот эффект, как и сама сенситизация, полностью блокируется при ингибировании текущей экспресии генов в период обучения. Анализ индивидуальных, вновь синтезированных при обучении белков методом двумерного электрофореза позволил обнаружить избирательное повышение скорости синтеза нескольких белков, но их природа и функциональная роль пока неизвестны. [c.386]

Можно ли считать препарат чистым Является ли он гомогенным по составу Например, содержит ли образец полимерные молекулы лишь одной молекулярной массы На этот вопрос часто можно ответить с помощью измерения размеров молекул, используя такие методы, как ультрацентрифугирование, электрофорез и хроматографию (которые будут подробно описаны в гл. Пи 12). Те же методы могут быть использованы и для выделения одного компонента из смеси макромолекул. При более детальном изучении гомогенности можно использовать также химический анализ, часто с применением спектроскопических измерений. Например, нередко возш1кают вопросы, не содержит ли препарат белка примеси нуклеиновых кислот, нет ли в нем ковалентно связанных с ним сахаров (и если есть, то сколько), состоит ли белок из одной непрерывной полипептидной цепи (и если это так, то какова ее длина). Отметим, что далеко не всегда стоит задавать вопрос об отсутствии загрязнения белка или нуклеиновой кислоты малыми молекулами, так как последние неизбежно присутствуют в препаратах. Большинство биополимеров — полиэлектролиты и поэтому находятся в окружении противоионов. Иногда бывает важно тщательно проконтролировать тип противоионов, которые присутствуют в образце. Очень часто для нормального функционирования макромолекулы бывает необходимо присутствие или отсутствие тех или иных малых молекул. [c.22]

Если же белковые полосы после электрофореза в геле можно обнаружить обычной окраской, а введение радиоактивного иода используется только для последующего пептидного анализа, то поступают более экономно. Белковые полосы из геля вырезают Один такой диск вымачивают в 0,3 мл 0,5 М Na-фосфатного бу фера, содержащего 0,5 мКн Na I, и добавляют туда 5 мкл рас твора Хлорамина Т, чтобы получить его концентрацию 0,1 мг/мл Через 2 мин при 25 добавляют еще одну такую же порцию Хлор амина Т, а через 1 мин — еще одну. Затем реакцию останавлива ют добавлением 0,1 мл насыщенного водного раствора тирозина Остальной 1 присоединяется к нему и может быть удален дна лизом. Меченный таким образом белок можно гидролизовать, например трипсином, прямо в геле, а затем элюировать из него радиоактивно меченные пептиды белка, содержащегося в выбранной полосе геля [Bryant et al., 1979]. [c.238]

Рис. 6-6. Анализ белков, входящих в состав теней эритроцитов, до и после гидролиза сиалидазой и проказой (задача 6-12). Белки, связанные с мембраной, выделены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН, а затем окрашены на белок и на углеводы. Линиями показано распределение белков, серым цветом обозначено распределение углеводов.

А. Отсутствие существенных различий по уровню фосфорилирования между известньпк1и мишенями рбО не исключает того, что рбО " вызывает трансформацию за счет своей тирозинкиназной активности. Ключевой мишенью для трансформащ1и может быть белок, присутствующий в клетке в очень малом числе копий. Стандартные методы анализа клеточных белков, такие, как двумерный электрофорез в геле, не позволяют обнаруживать такие редкие белки. Тем не менее эти экспериментальные данные четко указывают на то, что среди известных мишеней рбО нет белка, ответственного за трансформацию. [c.480]

Для ЭТОГО предложено почти полтора десятка методов. Белок признают гомогенным, если увеличение его количества в твердой фазе не сопровождается возрастанием содержания белка в растворе (рис. 14). Наличие одной белковой полосы при электрофорезе в полиакрила-мдцном геле, одного пика на выходной кривой (либо одной белковой зоны на пластинке) при хроматографировании или гельфильтрации, резкой границы пограничного слоя белок—растворитель при ультрацентрифугировании белка являются наиболее надежными показателями гомогенности белкового препарата. В большинстве случаев гомогенны кристаллические белки. Если кривая распределения белковых частиц по высоте при использовании метода свободной диффузии подчиняется теоретической кривой распределения Гаусса, белок гомогенен. Достижение в процессе очистки белка стабильного содержания свободных Н8-групп или содержания радиоактивной метки (при работе с меченым белком), равно как и постоянного уровня биологической (ф мен-тативной, гормональной и т. п.) активности, свидетельствует в пользу гомогенности белка. Выявление единственной N-кoнцeвoй и единственной С-кон-цевой аминокислоты при анализе белкового препарата также является признаком гомогенности выделенного белка. [c.34]

Смотреть страницы где упоминается термин Электрофорез, анализ белков: [c.309] [c.145] [c.31] [c.467] [c.112] [c.348] [c.158] [c.172] [c.349] [c.367] [c.231] [c.479] [c.348] [c.105] [c.172] [c.536] [c.100] [c.154] [c.102] [c.105]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология