Аминокислотный анализатор Аминокислоты

Для проведения количественных определений аминокислотный анализатор должен быть откалиброван. Площади пиков обычно соотносят с пиком Lys, который менее других аминокислот разрушается прн гидролизе. Для оценки потерь материала в приборе, чувствительности окраски и регистрации используют калибровку с помощью стандартных растворов аминокислот точно известной концентрации (в отдельном опыте). Коэффициенты корреляции вводят в память интегратора (или учитывают при планиметрировании пиков). [c.527]

Наиболее совершенным методом для количественного анализа аминокислотного состава белков и пептидов в настоящее время является их определение с помощью автоматических приборов — анализаторов аминокислот. Разделение аминокислот в них происходит по [c.125]

Гидразиды аминокислот удаляют реакцией с бензальдегидом, изо-валериановым и другими альдегидами, а находящуюся в водной фазе С-концевую аминокислоту анализируют методами хроматографии или электрофореза на бумаге и в тонком слое или с помощью аминокислотного анализатора. Смесь, получаемую после гидразинолиза, можно обрабатывать динитрофторбензолом или дансилхлоридом. Это дает возможность идентифицировать С-концевые аминокислоты в виде ДНФ- (с. 145) или ДНС-производных (с. 148). [c.156]

АНАЛИЗ ПОЛИПЕПТИДОВ. Полипептиды, как и прочие амиды, можно гидролизовать водными растворами кислот или щелочей. После полного гидролиза полипептида можно при помощи аминокислотного анализатора установить его качественный и количественный аминокислотный состав, но не точную последовательность аминокислот. Если перед гидролизом обработать полипептид реактивом Сэнгера, то можно будет затем идентифицировать его N-концевую аминокислоту, так как она даст устойчивое окрашенное производное анилина, которое не разрушается при гидролизе. [c.402]

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ АВТОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТНЫХ АНАЛИЗАТОРОВ [c.173]

Определение аминокислот в аминокислотном анализаторе [c.175]

Одномерная тонкослойная ионообменная хроматограмма дает почти те же значения аминокислот, что и диаграмма, полученная на аминокислотном анализаторе. Разделение аминокислот от Асп до Ала в анализаторе также чувствительно к изменению pH и молярности буферного раствора и ухудшается при увеличении pH. В то же время разделение аминокислот от Вал и далее уже нечувствительно к изменению pH и молярности. [c.256]

Для разделения и количественного анализа аминокислот и родственных соединений в белковых гидролизатах и физиологических жидкостях предназначены автоматические аминокислотные анализаторы, выпускаемые многими фирмами. [c.91]

В отличие от ранее рассмотренных видов хроматографии ионообменная хроматография основана на химическом взаимодействии активных групп неподвижной фазы с ионами разделяемых соединений. Она используется для разделения смесей белков н аминокислот, которые в водном растворе находятся в виде ионов (см. 11.1.3). Ионообменная хроматография положена в основу действия специальных приборов — автоматических аминокислотных анализатор О В. [c.498]

Для определения аминокислот существуют разнообразные химические реакции, которые специфичны для некоторых из них (табл. 6.2). Эти реакции используются довольно редко, так как аминокислотный анализатор позволяет легко проводить качественный и количественный анализ и инструментальное детектирование этих соединений. Этим методом плохо определяется триптофан (Try) из-за его повышенной чувствительности к кислотам, поэтому его лучше идентифицировать с помощью химических реакций (табл. 6.2). Химической основой работы аминокислотного анализатора является реакция с нингидрином, описанная в опыте 20. [c.273]

Обсуждение. Важность этой реакции определяется не только тем, что она представляет собой качественную пробу, но и тем, что при этом образуется поглощающее свет вещество, которое можно определить количественно с помощью автоматического аминокислотного анализатора. Эту цветную реакцию используют также для установления присутствия и положения аминокислот после разделения их с помощью хроматографии на бумаге (гл.7). [c.279]

Рис. 4.2. Хроматограммы стандартной смеси аминокислот (а) и гидро-лиаата ванадилпорфириновой фракции нефти (б), полученные на аминокислотном анализаторе — жидкостном хроматографе Mi rote hna AAA 881 [761].

Большинство аминокислот практически не поглощает свет в доступной для регистрации области, так что их приходится окра-тпвать нпнгидрином. Этот метод окраски будет подробно рассмотрен в приложении 2, посвященном аминокислотным анализаторам. Пептиды и белки поглощают свет в области 206—215 нм за счет пептидной связи и в широкой области спектра с максимумом вбли- и1 280 нм за счет присутствия в них ароматических аминокислот. Азотистые основания и нуклеиновые кислоты хорошо поглощают вблизи 260 нм. Поэтому не удивительно, что основной метод детектирования в хроматографии белков и нуклеиновых кислот — это регистрация поглощения света в ультрафиолетовой области спектра. Соответствующие приборы мы будем для краткости именовать УФ-детекторами. [c.82]

ТСХ модифицированных ароматическими заместителями аминокислот в последние годы предпочитают вести на пластинках с полиамидным покрытием, поэтому из обзора Нидервизера процитируем только методы фракционирования немодифицированных аминокислот. Разумеется, ни по чувствительности и воспроизводимости результатов, ни тем более по точности количественных определений ТСХ аминокислот не может конкурировать с современными аминокислотными анализаторами. Однако существует немало ситуаций, когда возможности ТСХ оказываются вполне адекватными поставленной задаче определение аминокислотного состава, сопоставление родственных полипептидов, выявление генетических различий, проявляющихся в замене каких-либо аминокислот, клинические анализы физиологических жидкостей и др. На рис. 160 показана приведенная в цитируемом обзоре картина распределения пятен носле двумерной ТСХ модельной смеси аминокислот на иластинках с сп-ликагелевым покрытием. На старт вносили но 1 мкг каждой из ал1И-нокислот в 0,5 мкл 0,1 М раствора НС1. Элюцию в нервом направленип проводили смесью хлороформа, метанола и 17 %-ного аммиака (2 2 1), а во втором — смесью фенола и воды (3 1 но массе). [c.482]

Рассмотрение принципа действия и особенностей использования аминокислотного анализатора начнем с того, что сформулируем представления об анализируемом препарате. Для наиболее интересного случая — анализа состава белка — им является смесь 20 природных аминокислот. Все компоненты этой смеси представляют одинаковый интерес, подлежат полному разделению и количественной оценке. Интервал. молекулярных масс простирается ог 75 (Gly) до 204 (Тгр), диапазон значений р1 — от 2,97 (Glu) до 10,76 (Arg). Различия в стеиени гидрофобности тоже выражены сильно от гидрофильных дикарбоновых и оксикислот до весьма гидрофобных, несущих довольно протял<енные алифатические и ароматические боковые группы. Заметим сразу, что такие различия должны облегчить задачу хроматографического разделенпя, но вряд лн позволят обойтись без ступенчатой смены элюентов. В обычных условиях хроматографии все алшнокислоты достаточно устойчивы, но следует обратить внимание с этой точки зрения и на предшествующий хроматографии этап исчерпывающего гидролиза белков и пептидов (от него будут зависеть и результаты анализа). Агрегация аминокислот маловероятна, за исключением возможности окисления цистеинов до цистинов. Не-специфическая сорбция за счет гидрофобных взаимодействий с материалом матрицы безусловно возможна, но здесь она будет использоваться в интересах фракционирования. [c.515]

На рис. 179 показана типичная схема расположения аминокислот на выходе аминокислотного анализатора ( hromaspek фирмы Rank Hilger ) с сохранением примерного соотношения расстояний между пиками, обозначенными вертикальными отрезками. Как видно из рисунка, пики аминокислот легко можно разбить на три группы [c.516]

Рис. 181. Типичные профили хроматографической алюции аминокислот, окрашенных нингидрином, после разделения в аминокислотном анализаторе

В приборе предусмотрен простой измеритель скорости потока жидкости 17). Он представляет собой стеклянную трубку с двумя рисками. На вход трубки подаются пузырьки воздуха, скорость перемещения которых легко подсчитать по времени прохождения известного расстояния между рисками. Манипулируя работой насосов 5) и 11), можно установить отдельно скорость элюцип колонки и скорость подачи нингидринового реактива (для указанного выше состава последнего соотношение скоростей должно быть 2 1). На выходе всего прибора имеется запорный клапан 16). Внешний вид аминокислотного анализатора Biotronik L 7000 представлен на рис. 183. Прибор можно укомплектовать интегратором с микрокомпьютером (например, типа SP4100). Он производит обсчет площади пиков и (с учетом данных по калибровке прибора стандартной смесью аминокислот) печатает на ленте аминокислотный состав исследуемого препарата. [c.522]

В полученных образцах определяют свободные аминокислоты. При тонкослойной хроматографии на пластинах Фиксион (с. 133) требуется не менее 10—30 нмоль аминокислот, для определения с помощью аминокислотного анализатора —2—5 нмоль аминокислот. Можно предварительно провести реакцию дансилирования (с. 148), а затем идентифицировать модифицированные аминокислоты с помощью тонкослойной хроматографии (в этом случае надо иметь 0,5—5 нмоль дансилированных аминокислот). При количественном определении аминокислот можно исследовать зависимость освобождения их от времени инкубации образца с карбоксипептидазой. [c.156]

Для успешной идентификации аминокислот необходимо, чтобы все они обладали характерным свойством или вступали в реакцию, продукт которой легко было бы обнаружить. Чаще всего используется способность аминокислот реагировать с нингидрином с образованием продуктов характерного синего цвета. Реакции нингидрипа с аминокислотами представлены на рис. 25-3. В настоящее Ьремя разделение и идентификация аминокислот полностью автоматизированы. Аминокислотные анализаторы позволяют провести анализ смеси аминокислот за 2—3 ч. [c.389]

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого Б. или пептида и количеств, определение всех аминокислот в гидролизате. Для гидролиза обычно используют 5,7 н. водный р-р НС1, а при анализе содержания триптофана-4 н. метансульфоновую к-ту, содержащую 0,2% ЗЧ2-аминоэтил)индола, или кипячение со щелочью. Количеств, определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких приборов смесь аминокислот разделяют на ионообменных колонках, детекцию осуществляют спектрофотометрически по р-ции с нингидрином или флуориметрически с использованием флуоре-скамина или о-фталевого диальдегида. В последнем случае можно анализировать до 0,1-0,05 нмоль аминокислоты. [c.250]

Независимо от того, какая модификация метода Эдмана используется, после каждого цикла необходимо собирать производные 2-анилинотиазолона-5 Л -концевых аминокислот и превращать их в 2-тио-З-фенилгидантоины (12) нагреванием с трифторуксусной кислотой. Известно несколь <о методов [23] идентификации 2-тио-гидантоинов. До того, как были разработаны удобные способы отделения 2-тиогидантоинов, широко использовали их гидролиз до аминокислот, так как для идентификации и количественного определения можно использовать аминокислотный анализатор. При гидролизе, однако, неизбежно разрушаются некоторые гидантоины (например, гидантоинозые производные серина и треонина), и в настоящее врем предпочитают методы прямого их определения. [c.270]

В последнее время появилась возможность определять аминокислотный состав белков с помощью автоматических аминокислотных анализаторов. Когда в 1948 г. Мур и Стейн [551 в дополнение к классическим методам органической химии, а также манометрическому и бактериологическому анализу ввели ионообменную хроматографию, наступил поворотный момент в развитии химии аминокислот. В основу работы созданных сотрудниками Рокфеллеровского института современных автоматических аминокислотных анализаторов была положена ионообменная хроматография. Принцип работы этих приборов заключается в следующем. Исследуемый белок гидролизуют, затем гидролизат подвергают хроматографии на смоле типа дауэкс 50 х8 в Na-форме. Элюирование производят с помощью непрерывной подачи буферного раствора. Выходящий из колонки элюат попадает в пластмассовую ячейку особой формы, где он смешивается с раствором нингидрина. Подачу нингидрина осуществляет специальный насос, работающий синхронно с насосом, подающим буферный раствор на колонку. Затем смесь элюата с нингидрином проходит через тефлоновый капилляр, который погружен в кипящую баню. В этих условиях в растворах происходит нингидриновое окрашивание, интенсивность которого измеряется в проточной кювете спектрофотометрически. Поглощение света регистрируется самописцем. Применение сферических смол [80] позволило сократить время исследования одного образца примерно в четыре раза, а использование особых ячеек сделало вполне допустимыми для анализа очень малые количества исследуемого вещества — порядка 0,01—0,05 мкмоля [38]. Введение одноколоночной процедуры значительно упрощает метод [9, 29, 43, 60]. С помощью этой методики в одной и той же пробе можно определить кислые, нейтральные и основные аминокислоты, что не только экономит исследуемый материал, но и повышает точность и сокращает время исследования. Работая на стандартном аминокислотном анализаторе и пользуясь некоторыми модификациями известных методов, можно полностью закончить анализ одного вещества в течение 3 ч [91. [c.32]

Б. При хроматографии, высушивании, нанесении пробы, проявлении, оценке разделения, документации и т. д. можно применять ранее разработанные хорошо известные способы тонкослойной хроматографии. Например, для разделения основных аминокислот в аминокислотном анализаторе применяют буфер, имеющий концентрацию Ыа" 0,35 М и pH 5,23 этот же буфер пригоден для разделения основных аминокислот на пластинке Фиксион 50 х 8 . При этом, кроме основных, хорошо разделяются и идентифицируются ароматические аминокислоты Тир и Фен. [c.245]

Ароматические и основные аминокислоты на пластинке Фик-сиоц 50 X 8 разделяются при одномерной хроматографии в цитратном буферном растворе pH 5,23 с концентрацией Ыа" 0,35 М (буферный раствор В, табл. 10), который используется в двухколоночной системе аминокислотного анализатора. Типичная хроматография такого разделения представлена на фиг. 49. Колебания pH и концентрации буферного раствора не существенны для фракционирования. Хроматографию проводят при комнатной температуре без предварительного уравновешивания. В камеру наливают слой буферного раствора высотой примерно 1 см. При хроматографии фронт буферного раствора должен подняться на высоту 15 см. Если пластинка не уравновешена, на это уходит около 2 ч. На уравновешенной пластинке (см. буферный раствор для уравновешивания, табл. 10) это происходит за несколько ми-нут. На примере разделения ароматических и основных аминокислот можно оценить Лиз высокую разрешающую спо-Гис обность ионообменной хроматографии в тонком слое по сравнению с соответствующей колоночной техникой. Известно, что на малой колонке в этом же буферном растворе (т. е. 0,35 М Ыа+, pH 5,23) ароматические аминокислоты не отделяются друг от друга. [c.250]

Специфика хроматографического анализа аминокислот определяется особенностями этой группы сорбатов, в которую входят представители, сильно различающиеся по кислотно-основным свойствам и УФ-спектрам. Работы этого класса можно выполнять различными методами, используя либо стандартную аппаратуру для ВЭЖХ, либо специализированные приборы — аминокислотные анализаторы. Выбор оптимального варианта диктуется характером аналитической задачи необходимой чувствительностью, наличием в образце веществ других классов, присутствием лишь нескольких аминокислот, либо всего набора белковых аминокислот. [c.328]

Аминокислотный анализатор ВЭЖХ РКОЗТАК , включающий градиентный насос, УФ-детектор, реактор с нагревателем колб, колонку, реактивы и стандарты аминокислот. [c.553]

Обратимся к жидкостной хроматографии, где часто прибегают к по-слеколоночным реакциям для облегчения детектирования. Например, аминокислотные анализаторы, в которых разделенные на колонке с сорбентом компоненты последовательно элюируются и смешиваются с потоком реагента — нингидрина (нингидрин дает с аминокислотами окра- [c.410]

Анализ. Методы анализа белковых макромолекул селективны и осуществляются в зависимости от того, какая структура является объектом исследования, и начинаются с определения аминокислотного состава. Для этого необходимо провести полный гидролиз пептидных связей и получить смесь, состоящую из отдельных аминокислот. Гидролиз проводят при помощи 6 М соляной кислоты при кипячении в течение 24 ч. Так как для гидролиза пептидных связей изолейцина и валина этого может быть недостаточно, проводят контрольный 48- и 72-часовой гидролиз. Некоторые аминокислоты, например триптофан, при кислотном гидролизе разрушаются, поэтому для их идентификации используют гидролиз при помощи метансульфоновой кислоты в присутствии триптамина. Для определения цистеина белок окисляют надмуравьиной кислотой, при этом цистеин превращается в цистеиновую кислоту, которую затем анализируют. Вьщеление и идентификацию аминокислот проводят при помощи аминокислотных анализаторов, принцип действия которых основан на хроматографическом разделении белкового гидролизата на сульфополистирольных катионитах, В основе количественного определения той или иной аминокислоты лежит цветная реакция с нингидрином, однако более перспективным следует считать метод, при котором аминокислоты модифицируют в производные, поглощающие свет в видимом диапазоне. Разделение смеси аминокислот проводят при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, а само определение — спектрофотометрически. Следующим этапом является определение концевых аминных и карбоксильных [c.40]

Для изучения аминокислотного состава белков исгюльзуется глс жным образом метод гидролиза, т. е. нагревание белка с 6—10 моль/л соляной кислотой при температуре 100—110 "С. Получают смесь а-амипокислот, из которой, мож1ю выделить индивидуальные аминокислоты. Для количественного анализа эгоп смесн в настоящее время применяют иоисоомсниую и бул ажную хроматографию. Сконструированы специальные автоматические анализаторы аминокислот. [c.627]

Количественное определение аминокислот в гидролизате белка или пептида проводится с помощью аминокислотного анализатора — прибора, разработанного в 1958 г. С. Муром и У. Стейном. Принципиальная схема анализатора приведена на рисунке 4. [c.35]