Антигены связывание

При использовании аффинной хроматографии для выделения антигена из раствора используют антитела, иммобилизованные на нерастворимом носителе. При этом ключевым параметром иммуносорбции становится аффинность моновалентного взаимодействия [17]. Благодаря высокой концентрации МКА, присоединенных к гелю, связывание антигена, как правило, происходит достаточно быстро, и лишь в исключительных случаях кинетические параметры иммуносорбции требуют скорости потока меньшей, чем обычно используемая — один объем колонки в час. Выявление МКА обычно основано на поливалентном связывании с антигеном (см. рнс. 5.1), в котором участвуют как низко-, так и высокоаффинные антитела. Однако для аффинной хроматографии требуются антитела, обеспечивающие моновалентное связывание. Поэтому среди имеющихся МКА необходимо провести дополнительный отбор препаратов, обладающих нужной аффинностью. Это можно сделать, например, по способности МКА вызывать иммунопреципитацию антигена или по торможению растворимым (одновалентным) антигеном связывания с поливалентным антигеном, иммобилизованным на поверхности клеток или пластиковых панелей [17]. На рис. 5.2 схематично изображены взаимодействия, возможные при реакции торможения. Очевидно, торможение происходит лишь в том случае, если время диссоциации 50% моновалентных связей примерно равно или превышает время проведения самого анализа. Антитела, у которых 1./, составляет более 10 мин. [c.171]

Синтез полимерных суспензий с заданным комплексом свойств. В процессе работы были получены устойчивые полимерные суспензии с узким распределением частиц по размеру и заданной поверхностной концентрацией функциональных групп. Иммобилизацию белков на латексе проводили двумя способами - физической сорбцией белка или ковалентным связыванием макромолекулы с поверхностью активированного латекса. Первый способ использовали для иммобилизации антител к наркотикам и конъюгированных антигенов К-ОВА и Г-ОВА на поверхность латекса, не [c.201]

Наблюдаемая специфичность антител к тысячам разных антигенов показывает, что образующие антитела клетки подготовлены к тому, чтобы под действием соответствующего стимула размножаться и вырабатывать ту или иную из тысяч возможных полипептидных цепей. Синтез этих цепей регулируется генами. Стимулом, запускающим выработку определенного антитела к антигену, является, по-видимому, связывание антигена с комплементарным ему антителом в такой клетке однако детальный механизм этого процесса еще не раскрыт. [c.452]

Иммобилизованные ферменты могут быть использованы в качестве иммуносорбентов для выделения из антисыворотки специфических антител на эти ферменты. Эффективность адсорбции антител, количество адсорбированных антител и условия их элюции зависят от свойств иммуносорбента от количества связанного с матрицей белка-антигена, прочности связи антиген—носитель, конформации антигена и числа вовлеченных в ковалентное связывание субъединиц антигенов-олигомеров. [c.304]

Аффинность моноклональных антител к антигену является важным параметром, мерой которого служит константа связывания /Ссб. [c.323]

Иммунный ответ начинается связыванием антигена с рецепторами В-лимфоцитов, а возможно также и с рецепторами Т-клеток. Связывание антигена, по-видимому, запускает деление В-клеток, из которых через несколько последовательных делений формируются плазматические клетки, характеризующиеся высокой секреторной активностью и накапливающиеся в различных лимфатических тканях. Кроме того, В-клеткн служат предшественниками так называемых клеток иммунологической памяти —долгоживущих лимфоцитов, способных спустя много лет быстро пролиферировать при повторной встрече с данным антигеном. [c.366]

Сложность иммунного ответа связана отчасти с тем, что другие клетки, в особенности Т-лимфоциты и макрофаги, изменяют реакцию В-клеток на антиген. В отсутствие активирующего действия антигена процесс деления большей части лимфоцитов заторможен. Т-клетки, а они представлены по меньшей мере тремя типами, могут либо стимулировать клеточное деление после связывания антигена, либо продолжать подавлять его. Видимо, торможение имеет место в том случае, когда иммунная система узнает о наличии в антигене детерминанты, присутствующей также на поверхностях собственных клеток организма. Совершенно очевидно, что различение своих и чужих антигенов чрезвычайно важно для иммунной системы. Аналогично тому как нервная система находится обычно в заторможенном состоянии и только иногда по ней осуществляется проведение потока импульсов, так и иммунная система в основном ингибирована и лишь в определенных случаях развивается клон плазматических клеток. Торможение иммунологической активности обусловлено отчасти синтезом антител против других антител, а именно против антител, функционирующих в качестве рецепторов на поверхности В-клеток. [c.366]

Обработка антител меркаптоэтанолом приводит к разрыву дисульфидных связей, при помощи которых цепи связаны друг с другом, и позволяет получить препараты мономерных легких и тяжелых цепей. При ферментативном гидролизе пептидных цепей иммуноглобулинов появляются чрезвычайно гетерогенные пептидные фрагменты. Этот результат не был неожиданным, поскольку уже давно известно, что в организме содержатся буквально тысячи различных антител, каждое из которых имеет специфический участок связывания для различных антигенных детерминант. Если раньше было неясно, как формируются различные участки связывания, то [c.381]

В пределах вариабельных участков цепей иммуноглобулинов находятся так называемые гипервариабельные участки. Считают, что именно они формируют участки связывания антигенов, расположенные на концах РаЬ-фрагментов и образованные как легкими, так и тяжелыми цепями. [c.383]

В последнее время появилась возможность точно установить, каким образом РаЬ-фрагменты связывают специфические гаптены. Гаптены — зто небольшие молекулы, которые могут связываться с антителами наподобие антигенных детерминант, но сами не способны вызывать образования антител при введении в организм животного. Было показано, что в связывании гаптена фосфорилхолина с одним Fab-фрагментом и витамина К — с другим принимают участие гипервариабельные участки как тяжелых, так и легких цепей. [c.384]

Как функционируют иммуноглобулины Одна из реакций, агглютинация, происходит в результате взаимодействия поливалентного антитела с двумя клетками. Чаще, однако, взаимодействие антитела с антигеном вызьшает другие эффекты. Один из таких эффектов — связывание белка СЦ, входящего в состав комплемента (дополнение 5-Ж). Было установлено, что с белком lq связывается Сн2-домен Рс- [c.384]

Инструктивная гипотеза в 50-х годах уступила место теория клональной сеиекцян, которая ныне пользуется всеобщим признанием. Согласно этой теории, каждый лимфо1шт в ходе своего развития приобретает способность реагировать с определенным антигеном, хотя раньше он никогда не подвергался его воздейстаию. Это обусловлено тем, что на поверхности клетки появляются белки-рецепторы, которые специфически соответствуют данному антигену Связывание антигена с этими рецепторами активирует клетку, вызывая ее размножение и созревание ее потомков Таким образом, чужеродный антиген селективно стимулирует те клетки, которые несут комплементарные ему специфические рецепторы и уже поэтому неизбежно будут реагировать именно на этот антиген-вот почему иммунные ответы антигенспецифичны (рис. 17-6). [c.12]

Среди множества проблем иммунологии, одну из них, если иметь в виду прежде всего чисто познавательный аспект этой области биологических знаний, следует отнести к самой фундаментальной, поскольку во многом она определяет возможность решения остальных. Эта проблема связана с изучением на атомно-молекулярном уровне механизмов узнавания и ответных реакций иммунной системы на появление в организме инфекционных антигенов - чужеродных белков, вирусов, бактерий, патогенных веществ. Важный шаг в познании принципов функционирования иммунной системы был сделан в 1959 г. Ф. Бер-нетом, разработавшим так называемую теорию клональной селекции, которая и по сей день пользуется всеобщим признанием [265]. Первоначально теория имела сугубо гипотетический характер. Однако заложенные в ней идеи оказались плодотворными и она вскоре смогла стать для экспериментальных исследований не только системой основополагающих научных принципов, но и конкретной программой поиска. В настоящее время эта программа выполнена и сегодня теория клональной селекции представляет собой скорее констатацию надежно установленных фактов, чем концептуальную основу дальнейшего развития иммунологии [266]. Специфичность антигенной реакции лимфоцитов, согласно теории Бернета, обусловлена наличием на поверхности Т- и В-клеток рецепторных белков, избирательно взаимодействующих с определенными антигенами. Связывание с ними рецепторов активирует клетку и вызывает ее эффективное размножение. Таким образом стимулируется пролиферация лимфоцитов, содержащих на своих поверхностях именно те рецепторы, которые, с одной стороны, комплементарны чужеродному антигену, а с другой - могут адекватно сигнализировать клетке о необходимости антиген-специфцч-ного ответа. По теории клональной селекции иммунную систему образуют миллионы различных клеточных семейств или клонов, каждый из которых состоит из Т- или В-лимфоцитов, имеющих общих предшественников. Так как во всех случаях клетка-предшественница детерминирована к синтезу определенного антиген-специфичного белка рецептора, то все клетки одного клона имеют одинаковую антигенную специфичность и, следовательно, могут ответить на сигнал рецептора только одним, присущим клеткам лишь данного клона, способом. Антигенами, как правило, являются белки и полисахариды. На поверхности этих молекул имеются участки, называемые антигенными детерминантами или эпитопами, которые предрасположены к взаимодействиям с антигенсвязывающим участком антитела В-лимфоцита или 3 67 [c.67]

Согласно рентгеноструктурным исследованиям комплексов РаЬ-фрагментов с антигенами связывание антигена происходит в доступной растворителю щели активного центра, образованной вариабельными доменами в N-концевой части легкой и тяжелой цепей. Длина щели антител варьирует от 0,4 до 3,4 нм, а средние размеры области связывания для полимерных антигенов различной природы (углеводы, полипептиды, полинуклеотиды) составляют [(2,5—3,6) (10—17) (0,6—0,7)] нм. С антигеном частично контактируют гипервариабельные участки Н- и L-цепей, расположенные в местах изгибов полипептидной цепи, а также некоторые из аминокислотных остатков, более глубоких внутренних областей цепи (рис. 6). Особую роль в построении антигенсвязывающего центра антител играет третий гипервариабель-ный участок Н-цепи, включающий от I до 20 а. о. Длина этого участка и контактирующего с ним первого гипервариабельного участка L-цепи во многом определяют размеры активных центров антител. [c.28]

Рис. 13. Определение констант свя- Рис. 14. Графический способ нахож-зывания двух субпопуляцин антител дення асимптот для расчета констант с ионовалентным антигеном связывания двух субпопуляций анти-

Нетрудно представить, что интенсивность продукции антител будет возрастать как по мере увеличения в результате деления клеток, участвующих в их синтезе, так и совершенствования в ходе дифференцировки аппарата синтеза и секреции антител. Такими клетками являются плазматические клетки — конечная стадия дифференци- вки В имфоцитов. Эти клетки имеют чрезвычайно развитую сеть так называемого шероховатого эндоплаз-матического ретикулума — заполненных ихммуноглобули-нами цистерн , на наружной поверхности которых в большом количестве фиксированы полирибосомы. Плазматические клетки в полном смысле слова — фабрика для продукции иммуноглобулинов (антител). Плазматические клетки утрачивают такие важнейшие функции лимфоцитов, как рецепцию антигенов, связывание через Рс-рецепторы иммуноглобулинов взамен единственной функции — продукции антител. Значительное число этих клеток гибнет в процессе секреции антител, так что продолжительность жизни многих из них едва ли превышает несколько суток. [c.16]

НИИ И главу 4). Другими словами, многие V-гены зародышевой линии являются открытыми рамками считывания . Обнаруживается статистически значимое снижение наблюдаемой частоты стоп-кодонов внутри кодируюших участков V-генов по сравнению с ожидаемой на основании процесса случайных мутаций [11]. Это относится и к так называемым V-псевдогенам — нефункциональным V-генам, которые не могут экспрессироваться как мРНК и белок вследствие мутационных повреждений, нарушивших рамку считывания кодируюшего участка или изменивших регуляторную последовательность. Считается, что такие поврежденные гены накапливают мутации, так как они не могут подвергаться действию отбора. Итак, низкая встречаемость точковых мутаций (или мутаций сдвига рамки из-за вставок или потерь оснований), приводяш их к появлению стоп-кодона и в функциональных генах, и в псевдогенах предполагает сушествование механизма, который направлен на поддержание открытой рамки считывания V-генов зародышевой линии. Однако открытая рамка считывания может подвергаться отбору только на уровне связывания антигеном, связывания интактного гетеродимера, расположенного на поверхности клетки, и антигена. [c.156]

Видно, что при фиксированной концентрации антитела равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена зависит от его общей концентрации. Этот вывод лежит в основе всех иммунохимических методов. По существу антитела выступают в роли реагентов биологического происхождения, которые с высокой специфичностью способны узнавать чужеродные вещества. Обычно они представляют собой иммуноглобулины - белки сыворотки крови, которые образуются в ответ на введение иммуногена. Однако многие ни комолекулярные соеданения, в том числе и пестициды, сами по себе не стимулируют обргиование антител, т е. не являются иммуногенами. Индуцировать их образование можно лишь после связывания этих веществ с белком-носителем, в качестве которого, как правило, применяют бычий альбумин. Следует заметить, что в реакции с белком-носителем не должны затрагиваться те группировки молекул антигена, которые участвуют в образовании комплексов антиген-антитело и которые, следовательно, необ.ходимы для индуцирования образования в организме животного специфических антител. [c.298]

Этот процесс представляет собой наиболее удивительный и яркий пример более общего явления — достижения биологической специфичности путем взаимодействия комплементарных структур, аналогичных тем, которые обусловливают связывание антител и антигенов (разд. 15.5). Объединение пуриновых и пиримидиновых оснований в пары путем образования двух или трех водородных связей происходит в соответствии с принципом комплементарности. Взаимное положение оснований в углеводнофосфатном скелете ДНК таково, что только пуриновое основание одной цепи и пиримидиновое основание другой цепи могут образовать между собою водородную связь. В принципе возможны и неправильные пары — АС и ОТ. Однако, как видно из рис. 15.20, между А и С не могут образоваться водородные связи при заданном положении оснований в цепи ДНК. Между О и Т могла бы возникнуть одна водородная связь, но в действительности средние атомы водорода (связанные с атомами азота колец как у О, так и у Т) создают пространственные затруднения, которые удерживают О и Т достаточно далеко друг от друга, препятствуя образованию такой связи. Энергия водородной связи составляет примерно 20 кДх<-моль и, следовательно, введение в строящуюся цепь правильного ( разрешенного ) пуринового или пиримидинового основания дает энергетический выигрыш в 40 или 60 кДж-моль . [c.458]

Есть еще одна особенность аффинной хроматографии, которую следует отметить с самого начала. Способ связывания биологически активного лиганда с матрицей обязан не только обеспечивать сохранение его активности, по п не создавать стерических препятствий для взаимодействия сорбируемого вещества с лигандом. Когда в качестве лиганда выступает биополимер (белковый антиген или субстрат, нуклеиновая кислота) и его участок биоспецифического взаимодействия оказывается достаточно удаленным от точки закреплетшя па матрице, то эта проблема не возникает. [c.341]

Использование белков-антигенов в качестве лигандов для очистки специфических антител на иммуносорбентах было описано в предыдущей книге этой серии [Остерман, 1983]. Там же была рассмотрена возможность связывания любых антител на матрице, несущей белок А из Staphylo o us aureus. Обе эти системы с полным правол можно включить в перечень аффинных хроматографических систем. Естественно, что иммуносорбенты используются и в обратном варианте, когда с помощью лигандов-антител производится очистка антигенов белковой природы пли гаптенов. [c.362]

Для использования моноклональных антител в изучении белковых антигенов важно знать, с одной и той же или разными антигенным и детерминантами (эпитопами) антигена связываются полученные антитела. Эпитопную специфичность антител определяют методом их конкурентного связывания. Антитела одного клона конъюгируют с пероксидазой (с. 317). Берут 96-луночный микропланшет для ИФА и сорбируют в лунках антиген, как обычно (с. 320). После тщательной отмывки в каждую из 12 лунок вносят по 75 мкл культуральной жидкости того же или других клонов или раствор очищенных антител — 100 мкг/мл (рис. 42). Все остальные лунки содержат 50 мкл фосфатного буфера с 1%-ным БСА. Делают серийные разведения антител, перенося по 25 мкл раствора из каждой лунки в соседнюю (рис. 42) на 5—6 лунок. К каждой лунке добавляют 10 мкл меченных пероксидазой автител в концентрацию 20 мкг/мл. Инкубируют 2—4 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании. После тщательной [c.322]

Рис. 43. Конкуренция между антителами при связывании с антигеном, сорбированным на микропланшете /—АТ 1, 2 —АТ 2, <3 — АТ 1-ЬАТ 2.

Определение константы связывания. Используют метод радиоиммунного анализа (РИА). Постановка метода сходна с постановкой ИФА (с. 320), с тем исключением, что вместо конъюгатов антител с ферментной меткой для выявления связывания антител с антигеном используют антимышиные антитела с радиоактивной меткой. В каждую лунку вносят по 50—100 мкл антимышиных антител (10—30 нг около 20 000 срт). Инкубируют при комнатной температуре около 2 ч. Затем микропланшеты тщательно отмывают (с. 321), разрезают и индивидуальные лунки просчитывают в Y-счетчике. [c.324]

Кочгалекс с антигеном образуется в результате некова-лентньп взаимод, характер к-рых может варьировать в зависимости от специфичности антитела. Сила связывания с антигеном увеличивается на неск. порядков, если молекула антитела реагирует сразу двумя (или более) областями связывания с неск. детерминантами одной молекулы антигена. [c.217]

Ф-ции Т.к. в бактериальной клетке связаны с ионным обменом и регуляцией работы автолитич. ферментов (катализируют гидролиз сложного биополимера, составляющего каркас клеточной стенки), к-рые активны при росте и делении клеток. Мутантные клетки бактерий, лишенные Т.к., оказываются нежизнеспособными. К вторичньпи ф-циям Т. к. относят их антигенные св-ва и связывание фагов. Стрептококковые, стафилококковые и др. бактериальные инфекции человека и животных сопровождаются выходом Т.к. в органюм, что приводит к развитию постинфекц. осложнений в виде эндокардитов, нефритов, артритов и др. [c.510]

Во всех методах сложно осуществить присоединение белка к поверхности преобразователя, поскольку оно не должно затрагивать активный участок. Если модифицированную поверхность использовать непосредственно без метки или медиатора, нужно предотвратить все иеспецифические взаимодействия, поскольку прямые измерения без метки, включающие обычно контроль изменения массы или показателя преломления на поверхности, не могут различить специфические или неспецифические взаимодействия. При иммобилизэл ции поверхности с плотной упаковкой неспецифическое связывание не происходит, тем не менее, иммобилизация часто бывает неэффективной для о а-зования комплекса антитело-антиген из-за стерических препятствий. Наоборот, упаковка с большими промежутками обычно допускает неспецифические взаимоде твия с расположенной ниже поверхностью, и, таким образом, можио з егистрировать значительные ошибочные сигналы. [c.525]

Две конфигурации устройств ППР показаны на рис. 7.8.-22. В ранних сообщениях по щгамененпо ППР для дегастирования связывания белков речь шла об исследованиях взаимодействий без метки, с участием, например, антител, иммобилизованных на металлических пленках [7.8-55,7.8-56]. Скоро стало ясно, что хотя можно детектировать связанный антиген, в некоторых аналитических средах часто не было возможности отличить этот сигнал от сигнала любого другого яеспецифического взаимодействия с поверхностью [7.8-57]. Показатель преломления в качестве метки и другие оптические метки помогут обойти эту проблему, и, поскольку ППР столь чувствителен, достижимы низкие пределы обнаружения. [c.561]

При разработке иммунного анализа целью является проследить за равновесием между антителом и антигеном. При анализе исследуют связывание антигена с антителом и различают связанный и несвязанный антиген. Поскольку процесс имеет равновесный характер (уравнение 7.9-1), линейной зависимости от концентрации антигена нет. Следовательно, важно знать характеристический отклик связьгеания как функцию концентрации антигена. [c.567]

В присутствии слоя АЫ связывание Ag описывается константой Кра,ви1 в соответствии с уравнениями 7.9-1-7.9-6 (где АЫ = АЬ и /<Гравн1 = равн)) но затем его контролируют с помощью присоединения АЬ2 к связанному антигену Agb, описываемого константой Крд,в 2- [c.572]

В этом методе пробу фильтруют через мембрану, в которой иммобилизована захватьгаающая молекула (антитело или антиген). Затем в фильтрате определяют иесвязанлое вещество. Использование волоконных мембран увеличивает площадь поверхности, а значит, и емкость связывания используют стекловолокно и волокно целлюлозы, ио чаще материалом мембраны служит иайлон. Улучшение взаимодействия может быть получено при иммобилизации захватывающей молекулы на частицах полимера (как описано вьппе), которые затем улавливают в мембране. [c.580]

Концепция агглютинации известна с 1920-х гг. в микробиологическом анализе. Этот принцип можно положить в основу офазования комплекса между антителом и антигеном, где имеется поливалентное связывание. Поливалентный белок будет реагировать со своим антителом, образуя осаждающийся комплекс, но реакция в высокой степени зависит от таких факторов, как нонная сила и ионные частицы, и осложняется изменением реакционной способности различных антигенных связывающих центров на антителе В принципе, по мере протекания реакции образование комплекса может приводить к изменению способности среды рассеивать свет, но в адеале комплекс должен оставаться во взвешенном состоянии. [c.584]

Эффекты неспецифического связывания могут также быть источником проблем. Изменение поверхности частиц влияет на агрегацию частиц и адсорбцию реагента, так что следует оптимизировать условия, чтобы уменьшить вандерваальсово притяжение между частицами, обеспечив достаточное куло-товское отталкивание, но не ингибируя реакцию антитело—антиген. [c.585]

Рис. 7.9-14. Принцип иммунного анализа по поляриза цнн флуоресценции. Связывание антитела с антигеном, мечег1ым флуорофором, увеличивает поляризацию флуоресценции.

Ферменты служат, пожалуй, наиболее широко используемыми в иммунном анализе метками, однако они непосредствшно не участвуют в измерении, в отлнчие от изотопов или флуоресцеьгсных меток. Вместо этого, измерение может включать детектирование расхода ферментного субстрата илн накопления продукта, требуя, таким образом, наличия в анализе другого реагента и привнося в метод дополнительные сложности. Тем не менее, поскольку одна молекула фермента может вызвать превращение многих молекул субстрата, имеется очень высокий потенциал усиления сигнала, и это преимущество перевешивает часто упоминаемый недостаток несовместимой оптимизации условий конечного этапа ферментативного анализа и связывания антитело—антиген. [c.594]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология