Ионизация комплекса фермент субстрат

Из уравнения (3) следует, что [Е5] зависит от Кт и от [5]. Если в состоянии равновесия [Е5] будет бесконечно малой величиной по сравнению с [5] и с [Еоб ], то скорость реакции будет зависеть только от [8]. В этом случае при низких концентрациях субстрата эта реакция будет протекать по типу реакций первого порядка. Если же практически все количество фермента окажется связанным с субстратом в виде Е5 и если концентрация субстрата будет достаточно высока, то концентрация фермент-субстратного комплекса не будет меняться и скорость такой реакции окажется постоянной. В этом случае мы имеем дело с реакцией нулевого порядка [36]. Большинство ферментативных реакций не являются, строго говоря, ни реакциями первого, ни реакциями нулевого порядка, а протекают согласно некоему промежуточному порядку [34, 36, 37]. Это зависит отчасти от уменьшения концентрации субстрата в течение реакции, а отчасти от образования различных типов фермент-субстратных соединений. Так каталаза и пероксидаза, как уже указывалось выше, образуют зеленые и красные комплексы с субстратом, причем скорости распада зеленого и красного комплексов различны [32, 33]. Дальнейшие усложнения возникают вследствие соединения фермент-субстратных комплексов с водородными ионами [38] или с другими ионами или молекулами. Так, например, скорость гидролиза яичного альбумина пепсином зависит от концентрации водородных ионов раствора реактивным промежуточным соединением является в этом случае не Е5, а Н+Е5 [38]. Если в образовании фермент-субстратного соединения участвуют ионы, то скорость катализируемой реакции зависит от диэлектрической постоянной растворителя известно, что органические растворители, например метиловый или этиловый спирт, уменьшают диэлектрическую постоянную раствора и степень ионизации,вследствие чего уменьшается скорость катализируемой реакции [39]. [c.284]

Взаимодействие между трипсином и овомукоидом в отсутствие субстрата фермента протекает слишком быстро, поэтому непосредственные измерения сделать нельзя, но константа диссоциации комплекса была измерена и равна приблизительно 5-10 М. В том случае, если карбоксильные группы овомукоида блокированы этерификацией или аминогруппы трипсина ацетилированы, образование комплекса резко замедляется [62—64]. Диссоциация комплекса на его компоненты при значениях pH ниже 3 [65, 61] должна наводить на мысль, что ионизация карбоксильных групп фермента или ингибитора или обоих компонентов является основным условием для [c.36]

НО отмечалось, что максимальная скорость многих ферментативных реакций, наблюдающаяся при насыщающей концентрации субстрата, а не только кажущаяся величина Кт, зависит от pH. Это заставило предположить, что концентрация ионов водорода определяет не только ионизацию свободного фермента, но также кислотно-основную диссоциацию фермент-субстратного комплекса, причем этот последний процесс влияет на концентрацию активного комплекса Михаэлиса и образование продуктов реакции. [c.109]

Таким образом, можно определить влияние pH непосредственно на активность свободного фермента, на фермент-субстратный комплекс или на субстрат. Влияние pH обусловлено различием в ионизации групп, находящихся как непосредственно в активном центре, так и вблизи его. [c.29]

Лейдлер [12] провел детальный анализ таких реакций, приняв во внимание возможность образования ЕНгА из ЕН2 -)- А, с использованием стационарной кинетики вместо предположения о равновесиях в реакциях ионизации. Он показал, что действительно можно представить себе только два случая, при которых уравнение (32) справедливо для неконкурентного торможения а) когда к+2 к-, т. е. когда связывание субстрата носит равновесный характер, или б) когда и связывание субстрата в комплекс, и его диссоциация по одному из направлений происходят значительно быстрее, чем по другим (по мнению Лейдлера, этот случай нереален). Альберти и Блум-фильд [13] проанализировали также систему, в которой реакции всех трех ионизированных форм фермента дают заметный вклад в общую скорость процесса. [c.89]

Влияние pH на ферментативную активность иногда можно объяснить в рамках модели, предполагающей, что катализ зависит от состояния ионизации некоторых аминокислот. Тогда, если зависимость кат//См от pH описывается колоколообразной кривой, по ней можно определить константы ионизации Ки и К е каталитически важных групп в свободном ферменте. Константы ионизации, относящиеся к комплексу Е5, можно получить из зависимости кат от pH [101]. В случае КПА определение величин К е и Кге было бы полезным для установления роли тирозина и других остатков, расположенных вблизи субстрата. Однако имеющиеся данные довольно скудны. Пептидный субстрат КБЗ-01у-01у-РЬе был исследован недавно в условиях, при которых интерпретация результатов не осложняется ингибированием или активацией [7]. Кривые зависимости кат/-/См от pH оказались колоколообразными, что предполагает участие в катализе как кислой, так и основной групп. Кривые, описывающие влияние pH на кат, для этого субстрата имеют точку перегиба около pH 6. В щелочной области (до pH 10,5) кат практически постоянна . Отсутствие данных, указывающих на титрование второй группы в комплексе Е5, не исключает возможности участия в реакции кислотного катализа, если предположить, например, что соответствующая стадия не лимитирует скорость реакции (ср., однако, работу [103]). Зависимость гидролиза КГФ от pH представлена в нескольких ранних работах. Данные, полученные при высокой концентрации субстрата, указывают на с./южный характер влияния pH на кат и [26]. По зависимости начальной скорости от pH [104] были определены величины р/Се51 равные 6,5 и 8,6, однако сравнение с ацилтрипептидами показывает, что эти данные нуждаются в уточнении. При более низкой концентрации КГФ влияние pH на кат менее выражено [85]. [c.536]

Субстратами многих амидгидролаз являются соединения, несущие ионогенные группы. Учет ионизации субстрата приводит к довольно сложным зависимостям кинетических констант от pH. Для простейшего случая, когда фермент связывает только одну форму субстрата, а константа диссоциации свободного фермента и фермент-субстратного комплекса одинаковы [c.214]

Влияние концентрации водородных ионов на каталитическую активность ферментов состоит в воздействии ее на активный центр. При разных значениях pH в реакционной среде активный центр может быть слабее или сильнее ионизирован, больше или меньше экранирован соседними с ним фрагментами полипептидной цепи белковой части фермента и т. п. Кроме того, pH среды влияет на степень ионизации субстрата, фермент-субстратного комплекса и продуктов реакции, оказывает большое влияние на состояние фермента, определяя соотношение в нем катионных и анионных центров, что сказывается на третичной структуре белковой молекулы. Последнее обстоятельство заслуживает особого внимания, так как определенная третичная структура белка-фермента необходима для образования фермент-субстратного комплекса. [c.109]

Используя полное уравнение, можно определить Ка и Къ при низких концентрациях субстрата, в то время как при высоких его концентрациях можно определить К п и К ъ- Знание этих констант диссоциации позволяет проникнуть в природу групп в комплексе и свободном ферменте на основании этих данных можно определить, какие группы подвергаются влиянию комплексообразования, и поэтому получить некоторые сведения о группах, являющихся активными при образовании комплекса с субстратом. Лэйд-лер [62[ составил таблицу данных, показывающих влияние на величину К комплексообразования, протекающего по тем местам молекулы, которые подвергаются ионизации, и, кроме того, связывающих эти эффекты с изменениями скорости и константы Михаэлиса при изменении pH. Там, где такие сведения оказываются непол ными, иногда для вычисления Ка или Къ можно воспользоваться методом, предложенным Диксоном (381. Сведения о группах, участвующих в комплексообразовании, были получены для взаимного превращения ионов фумаровой и малеиновой кислот в присутствии фумаразы [63J, для гидролиза сахарозы в присутствии сахаразы [64[, для гидролиза ацетилхолина при наличии холинэстеразы и ацетилхолинэстеразы [65[ и для окисления 2-амино-4-оксиптеридина в присутствии ксантиноксидазы [38]. [c.135]

Любое локальное химическое изменение молекулы белка (присоединение субстрата или ингабитора к активному центру, редокс изменения металла в простетической группе, ионизация кислотной или основной группы и т.д.) приводит к появлению конформационно неравновесного состояния. Быстрая колебательная релаксация активного центра и его ближайшего окружения происходит немедленно после локального возмущения, в то время как структура основной белковой глобулы остается практически неизменной. Молекула становится неравновесной. Новое, кинетически доступное состояние фермент-субстрат-ного комплекса соответствует конформационно измененной структуре с продуктом, связанным с активным центром. Превращение субстрата в продукт реализуется в ходе конформационной релаксации фермент-субстратного комплекса к новому состоянию равновесия. Этот переход протекает чрезвычайно медленно по сравнению с масштабом времени колебательной релаксации. В некоторых случаях этот процесс занимает несколько сотен миллисекунд или даже несколько секунд [37]). [c.68]

В общем случае для ферментативной реакции существует оптимальное значение pH при увеличении или уменьшении pH по сравнению с его оптимальным значением максимальная скорость Уд падает. В нейтральной области pH влияние его изменений на реагирующую систему носит обычно обратимый характер, но при предельных значениях pH (соответствующих сильнокислой или сильнощелочной среде) белки подвергаются необратимой денатурации. Влияние обратимых изменений pH на кинетику можно объяснить изменениями степени ионизации субстрата если же в исследуемом интервале pH степень ионизации субстрата не меняется, то изменения в кинетике объясняются ионизацией фермент-субстратного комплекса. Если фермент-суб-стратный комплекс существует в трех состояниях с разным числом протонов и если только промежуточная форма разлагается с образо ванием продуктов, то уравнение, описывающее влияние pH на максимальную скорость реакции, можно вывести из схемы [c.322]

Карбоангидраза — один из наиболее активных среди известных ферментов. Реакция гидратации СО2 при 25 С характеризуется числом оборотов 10 с" . Тот же самый фермент катализирует гидратацию ацетальдегида [уравнение (7-35)], однако эта реакция протекает в ЮОО раз медленнее. Активность контролируется состоянием ионизации группы с p/(a 7. Согласно наиболее распространенной теории, предполагается, что ион цинка связывает молекулу воды и что комплекс Zn—ОН2 теряет протон, образуя Zn+—ОН (процесс потери протона комплексом Zn—ОН2 характеризуется р/Са 7, т. е. необычно низкой величиной р/Са, что, возможно, связано с гидрофобным окружением [104, 104а]). Zn+—ОН по существу представляет собой стабилизированный гидроксильный ион, существующий при тех значениях pH, при которых ОН обычно имеется в очень небольшом количестве. Именно этот гидроксильный ион и присоединяется к СО2 или к альдегидному субстрату. Таким образом, роль Zn + в этом ферменте состоит в генерировании атакующего основания, а не в поляризации карбонильной груп- [c.141]

Из кинетических соображений следует, что график log V как функции pH отражает ионизацию группировок, влияющих на мономолекулярную стадию простого односубстратного механизма. Если же функцией pH является log V/Km, то, как опять-таки следует из кинетики (см. последний раздел гл. IV), график отражает влияние pH лишь на группировки, имеющие значение для комплексо-образования, т. е. на группировки либо свободного фермента, либо субстрата. Интересно, что по логарифмическим графикам изменения константь Михаэлиса можно выявить эффекты обоих типов (фиг. 23). [c.215]

Химические факторы, определяющие скорость и направление реакций органических фосфатов, связаны главным образом с расположением гидроксильной или фосфатной группы (или других функциональных групп) субстрата относительно реагирующей части органического фосфата, присутствием или отсутствием основных катализаторов и распределением заряда в ангидриде или эфире. Химически распределение зарядов может быть изменено рядом способов, таких, как подавление диссоциации фосфатных групп при образовании эфира или проведение реакции в кислой среде (например, катализируемые протонами взаимопревращения нуклеозид-2 - и нуклеозид-З -фосфатов и нуклеозид-2 - и нуклеозид-3 -алкилфосфатов, которое не наблюдается в щелочной среде) и образование смешанных ангидридов из кислот, сила которых несоизмерима с силой фосфорной кислоты. Для неферментативных химических реакций также наблюдались каталитические и направляющие эффекты, возникающие в результате образования комплексов с ионами некоторых поливалентных металлов. В биохимических реакциях аналогичный контроль может осуществляться с полющью таких факторов, как конформация нуклеозид-5 -полифосфатов, связывание субстрата и фермента через металл, связывание диссоциирующих групп фермента с группой Р = О водородными связями, что эквивалентно протонированию. (С точки зрения резонансных форм фосфатов, разница между группами Р = О и Р — носит чистоформальный характер.) Образование катнон-субстратных комплексов, таких, как комплекс АТФ с магнием, по-видимому, увеличивает электрофильный характер атомов фосфора (препятствуя ионизации) и почти наверняка приводит к такому смещению электронной плотности, которое облегчает атаку данного атома фосфора, зависящую от определенной стереохимической конфигурации комплекса. В фермент-металл-субстратных комплексах, в которых металл служит ю тикoм между ферментом и субстратом, свободная энергия активации, по-видимому, значительно снижена. [c.350]

В ферментативных реакциях самые убедительные доказательства участия механизма с координированным ионом гидроксила получены для карбоангидразы. По данным инфракрасной спектроскопии, молекула субстрата (СО2) не связана с атомом цинка, но расположена сравнительно близко от него, чтобы быть атакованной координированным гидроксильным ионом [82] (гл. 16, разд. 7). С этим механизмом согласуется зависимость активности от pH и природы разнообразных ингибиторов [ 114, 115]. Селвин [112] предложил похожий механизм для АТФ-азы митохондрий, участвующей в окислительном фосфорилировании. Он основывался на сходстве рН-зависимостей ферментативной реакции и упомянутого выще ускорения гидролиза АТФ ионами лантанидов. Однако величина р/Са для АТФ-азной реакции (примерно 7) была намного выще р/Са воды в комплексе с активирующими двухзарядными ионами. Для наилучщих активаторов М 2+, Со2+ и Ъг эта величина примерно равна соответственно 12, ---9 и 9 [87]. Селвин [112] предполагает, что кислотность комплексов может увеличиваться под влиянием положительно заряженных групп фермента, расположенных поблизости. Надо признать, что расхождение в 5 единиц pH для Mg2+ слишком велико, чтобы его можно было объяснить таким образом (необходимая для этого энергия электростатичеокого взаимодействия должна составлять примерно 7 ккал/моль). Выще говорилось о том, что ионизация свободной молекулы воды предложена в качестве объяснения перехода при pH 8,5, наблюдаемого для 2п +-содержащей щелочной фосфатазы. При этом увеличение pH приводило к уменьщению активности фермента. В силу этого можно считать, что механизм с координированным гидроксильным ионом вряд ли играет существенную роль при ферментативном гидролизе фосфатов. [c.651]

Все эти свойства в совокупности являются тестом на выяв-ние аффинной метки, модифицирующей в активном центре группу, ионизация которой контролирует активность фермента. Наличие кинетики с насыщением (п. г) показывает, что метка образует комплекс с ферментом, хотя это можно и не обнаружить, если /С] лежит в области концентраций, при которых ингибитор не растворяется. Конкурентное ингибирование субстратом (п. а) подтверждает, что связывание происходит в активном центре. Стехиометрическое соотношение 1 1 означает, что эта модификация является избирательной. Ценные данные позволяет получить анализ рН-зависимости различных параметров. Как отме- [c.246]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология