Белки неравновесные конформационные состояния

Важнейшая особенность белковой цепи, определяющая существование необратимых флуктуаций и, следовательно, возможность спонтанного возникновения высокоорганизованной структуры из хаоса, заключена в специфической конформационной неоднородности природной аминокислотной последовательности. Можно утверждать, что суть рассматриваемого явления состоит в наличии четкой взаимообусловленности между химическим строением, конформационными свойствами и необратимыми флуктуациями. Гетерогенность аминокислотной последовательности ответственна за различие в конформационных возможностях ее отдельных участков, что, в свою очередь порождает термодинамическую неоднородность флуктуаций, дифференциацию их на обратимые равновесные и необратимые неравновесные. Сочетание последних и порядок их следования определяют содержание и направленность механизма быстрой и безошибочной самосборки белковой цепи. Отмеченная связь присуща только эволюционно отобранным аминокислотным последовательностям. В случае же гомогенных, регулярных или даже гетерогенных синтетических полипептидов со случайным порядком аминокислот тот же беспорядочный по своему характеру процесс не имеет развития и не выводит цепь из состояния статистического клубка. Сказанного, однако, недостаточно для объяснения высокой скорости сборки трехмерной структуры белка при его биосинтезе или ренатурации. Чтобы беспорядочно-поисковый механизм мог действительно привести к свертыванию цепи, селекция бифуркационных флуктуаций не должна представлять собой перебор возможных комбинаций всех случайных изменений целой полипептидной цепи, количество которых невероятно велико, и сборка структуры даже такого низкомолекулярного белка, как БПТИ, должна была бы продолжаться не менее 10 ° лет. [c.474]

Наиболее информативным методом изучения окисления и конформационных состояний железосерных белков является ЭПР. Этот метод был применен для регистрации неравновесного состояния центра N-2 в первом комплексе Грина и его релаксации к равновесию. [c.97]

Необратимые флуктуации и механизм самоорганизации белка. Предполагают, что в начальный период все флуктуации - периодические вращения атомных групп вокруг ординарных связей - являются беспорядочными и несинхронизированными друг с другом. В равновесных системах все флуктуации обратимы и согласно основной теории вероятности (так называемого закона больших чисел) составляют пренебрежимо малые поправки к средним значениям. За редким исключением (например, рассеяние света гомогенной средой и броуновское движение, вызываемые обратимыми флуктуациями плотности) они не коррелируют со свойствами системы и не оказывают влияние на ее переход в равновесное состояние В неравновесных системах среди множества обратимых, неустойчивых флуктуаций возникают необратимые флуктуации, оказывающие радикальное воздействие на эволюцию системы. Они не остаются малыми поправками к средним значениям, а существенно меняют сами эти значения, стирая различие между случайным отклонением и макроскопическим проявлением системы. При свертывании белка подавляющее большинство флуктуаций также обратимо и неустойчиво. Но некоторые из них приводят к сближению определенных аминокислотных остатков, и тогда те могут эффективно взаимодействовать между собой. По своим последствиям образующиеся контакты между валентно-несвязанными атомами могут быть подразделены на близко-, средне- и дальнодействующие. Флуктуации, приводящие к образованию первого вида, изменяют взаимное расположение атомных групп в пределах одного аминокислотного остатка второго вида - расположение остатка относительно соседних в последовательности третьего - относительно удаленных по цепи остатков. В зависимости от конформационного состояния белковой цепи по ходу ее сборки одни и те же флуктуации могут быть как обратимыми, так и необратимыми. Последними, т.е. бифуркационными, флуктуации становятся только в том случае, если каждая из них возникает в строго определенном месте последовательности бифуркаций между флуктуирующим клубком и трехмерной структурой. Обратимые флуктуации бесследно исчезают, а необратимые, стабилизированные специфическими невалентными взаимодействиями остатков, остаются в виде гигантских "застывших флуктуаций". [c.96]

Согласно предложенной феноменологической бифуркационной теории, самосборка белка осуществляется в неравновесной термодинамической системе, состоящей из двух подсистем - одиночной полипептидной цепи и водного окружения. Возникновение в такой системе процесса свертывания белковой цепи и его самопроизвольное развитие от беспорядка к порядку без нарушения второго начала термодинамики обусловлены неоднородностью случайных изменений флуктуирующей белковой цепи - наличием наряду с множеством обратимых равновесных флуктуаций также необратимых (неравновесных, бифуркационных) флуктуаций, определяемых конкретной аминокислотной последовательностью и текущим конформационным состоянием. Последовательная реализация специфического для данной аминокислотной последовательности набора бифуркационных флуктуаций завершается созданием трехмерной структуры белка. Вызванное спонтанным процессом свертывания уменьшение энтропии одной подсистемы - гетерогенной полипептидной цепи - компенсируется повышением энтропии другой подсистемы - окружающей среды (см. разд. 2.1). [c.586]

Достаточно большие времена жизни металлсодержащих белков в конформационно неравновесных состояниях делают возможным оценить их химическую реакционную способность. Измерили константы скорости некоторых специфических реакций этих белков сразу после образования их неравновесных состояний и в течение релаксации. Были подробно исследованы следующие реакции окисление восстановленных железосодержащих белков феррицианидом калия или некоторыми металлсодержащими белками в окисленной форме. [c.79]

Эти рассуждения показывают, что статистическая механика, продуктивно используя представление о вероятности, позволяет вычислять термодинамические функции на основе простых физических моделей молекулярных систем В.месте с тем она не прибавляет к вопросу об их возможном развитии ничего сверх того, что вытекает из законов классической термодинамики. Неравновесные системы, достигая равновесного состояния, приобретают ту структуру, которая отвечает экстремуму соответствующей термодинамической функции. Однако существование различных запретов и барьеров (расчет которых не входит в задачи термодинамики) ведет к появлению метастабильных состоянии. Отдельные переходы между ними осуществляются в тех случаях, когда эти барьеры невелики при этом сохраняется основная структура молекулярной системы. Таковы, иапример, разнообразные конформационные переходы молекул гостей в клатратах и канальных соединениях или конформационные превращения белков. [c.309]

Описанные выше исследования белков в конформационно неравновесных состояниях требуют сложной экспериментальной техники низкие температуры для замедления релаксации, импульсные методы для одновременной реализации локальных химических изменений в значительной части молекул белка в образце и т. д. Совершенно ясно, однако, что аналогичные события могут иметь место и с отдельными молекулами белка во время их функционирования при физиологических температурах, без искусственно навязанной синхронизации. Полученные до сих пор данные доказывают, что многие реакции белков действительно протекают в две главных стадии быстрые локальные изменения с последующей медленной релаксацией, в ходе которой белковые молекулы проходят через серии существенно неравновесных состояний и реализуют (для ферментативных процессов) трансформацию субстрата в продукт. [c.80]

О физической концепции механизма действия ферментов уже упоминалось в связи с обсуждением причин отклонения скорости от уравнения Аррениуса 640]. При низких температурах в жестких матрицах лабильные в обычных условиях конформационные состояния макромолекул будут существовать долго и их можно наблюдать, например, с помощью спектральных методов. В работах, [673—675] удалось зафиксировать неравновесные состояния для нескольких гемсодержащих белков, восстанавливая их с помощью сольватированных электронов, образующихся при радиолизе растворов белков в водио-этиленгликолевой матрице при 77 К- [c.250]

Рассмотренная в разделе 2.1 феноменологическая бифуркационная теория свертывания белковой цепи - лишь пролегомены, самый первый шаг к Созданию физической теории структурной организации белка и количественного расчетного метода. Неравновесная термодинамическая модель теории сформулирована в такой общей форме, которая еще не допускает прямой экспериментальной проверки. Значение предложенной теории состоит в том, что она, во-первых, дает принципиальную трактовку всем важнейшим особенностям структурной самоорганизации белка беспорядочно-поисковому механизму сборки аминокислотной последовательности, высокой скорости и безошибочности процесса образования трехмерной структуры и, во-вторых, указывает, как показано ниже, направление дальнейшего поиска и раскрывает его содержание. В частности, принципиальное значение имеет то обстоятельство, что бифуркационная теория впервые позволила представить процесс свертывания белка, не требующий при беспорядочно-поисковом механизме сборки рассмотрения всех мыслимых конформационных состояний белковой цепи. Однако сама по себе термодинамическая теория статистико-детерминистического явления не может привести к такому уровню понимания процесса свертывания белковой цепи, который необходим для количественной оценки всех логических связей между аминокислотной последовательностью, трехмерной структурой и окружающей средой, а следовательно, и для апробации лежащих в основе теории принципов. Задача может считаться решенной только после создания физической конформационной теории н расчетного метода, предсказывающих по известному расположению аминокислот в белковой цепи координаты всех атомов в нативной трехмерной структуре и количественно описывающих механизм сборки последней. Лишь при достижении цели, поставленной именно таким образом, физическая теория структурной организации белка сможет стать основой для решения следующих фундаментальных задач, связанных уже с установлением зависимости между строением и функцией. В этом разделе рассмотрены основные положения предложенной автором структурной теории белка [38-42]. [c.100]

Итак, завершено рассмотрение опытных данных Крейтона о механизме сборки трипсинового ингибитора. Оно основывалось на неравновесной термодинамической модели, физической теории структурной самоорганизации и конкретных результатах априорного расчета конформационных возможностей полипептидной цепи и геометрии нативной трехмерной структуры белка. Общим итогом анализа является адекватное естественному процессу ренатурации представление всего пути свертывания белка -от состояния статистического клубка до строго детерминированной нативной конформации макромолекулы. К принципиальным результатам рассмотрения следует, по-видимому, отнести выявление причин и количественное теоретическое обоснование возможности спонтанной, быстрой и безошибочной сборки флуктуирующей беспорядочным образом белковой цепи. [c.482]

Конформационно неравновесные состояния белков (и не только металлсодержащих) могут быть получены в растворе при комнатной температуре с помощью следующих методов [c.72]

Как уже было отмечено, конформационно неравновесные состояния всех исследованных белков с повышением температуры релак-сируют к соответствующим равновесным состояниям еще до размораживания матрицы. В некоторых случаях удалось установить последовательность структурных перестроек. Было найдено, например, что перед удалением аксиального лиганда из координационной сферы атома железа его ориентация меняется и атом железа удаляется от порфиринового кольца. Дальнейшая релаксация проходит через несколько промежуточных состояний. [c.78]

Во всех случаях быстрого локального возмущения активного центра белка (фермента) возникает неравновесное состояние, которое релаксирует путем конформационных изменений, охватывающих всю белковую глобулу. В ходе этих изменений молекула белка проходит через множество промежуточных, неравновесных состояний, переходы между которыми могут занимать от микросекунд до сотен миллисекунд. Специфическая химическая активность молекулы белка (например, ферментативная активность), как правило, в этих промежуточных неравновесных состояниях выше, чем в исходном и конечном равновесных состояниях. [c.79]

Метод изотопного обмена дает уникальную возможность регистрировать ничтожные концентрации конформационно неравновесных состояний. Однако он не позволяет установить, какая часть молекулы белка и каким образом должна перестроиться, чтобы ее NH-группы оказались доступными растворителю. К сожалению, этим методом нельзя также определить и частоту конформационных движении, которая представляет собой важную характеристику внутримолекулярной подвижности белка. Ценность метода изотопного обмена определяется информацией [c.265]

Бифуркационная теория сборки впервые смогла дать принципиальную и непротиворечивую трактовку важнейшим особенностям структурной самоорганизации белка самопроизвольному характеру возникновения и протекания всех стадий образования трехмерной структуры, большой скорости и безошибочности процесса при беспорядочно-поисковом механизме сборки. Теория указала направление и содержание дальнейшего изучения проблемы, которые привели к разработке физической конформационной теории и созданию априорного метода расчета. Теоретическое и практическое значение имело то обстоятельство, что бифуркационная модель сборки впервые позволила представить свертывание белковой цепи как спонтанно протекающий и строго детерминированный процесс, не требующий обязательного перебора всех возможных конформационных состояний и в то же время не ставящий под сомнение беспорядочность и случайность возникновения флуктуаций. Вызванная неравновесностью процесса автоселекция флуктуаций выявила призрачность проблемы множественности локальных минимумов на потенциальной поверхности белка. Она оказалась псевдопроблемой, возникающей исключительно благодаря привлечению К описанию процесса аппарата равновесной термодинамики и статистической физики. [c.7]

После электронного восстановления активного центра возникают кинегачески стабилизированное неравновесное состояние. Атом металла в активном центре восстановлен, но его непосредственное окружение изменено настолько, насколько это позволяет замороженная в матрице и поэтому не изменившаяся глобула. Непосредственное окружение активного центра претерпевает колебательную релаксацию, но пространственная структура глобулы остается той же, какой она была в равновесном окисленном белке. Однако новое состояние активного центра и его ближайшего окружения должно в условиях равновесия соответствовать конформации всей белковой глобулы. Напряжение между измененным активным центром и остальными частями макромолекулы приводит к изменению спектральных и магнитных характеристик активного центра. Так возникает конформационно неравновесное состояние белка ион металла восстановлен, но структура большей части глобулы соответствует окисленному состоянию иона металла. Методы получения, фиксирования и исследования конформационно неравновесных состояний могут с успехом использоваться не только для отдельных белков, но и для внутриклеточных органелл, клеток и целых тканей. [c.71]

Этому вопросу были посвящены исследования Л. А. Блюмен- фельда с сотр. По Л. А. Блюменфельду, молекула фермента-белка до начала взаимодействия с субстратом находится в конформаци-онно равновесном состоянии. В активном центре белковая молекула становится неравновесной для соединения фермент — субстрат и элементарный акт ферментативной реакции и заключается в конформационном изменении макромолекул фермент-субстратного комплекса, причем скорость этого изменения определяет и скорость превращения субстрата в продукт реакции. [c.325]

Расчет показал, что конформационно лабильные по средним взаимо-действиям участки Pro - ys и ys -Ala" обретают свои окончательные пространственные формы только по завершении сборки -структуре, ys - ys , которая служит для их укладки матрицей, обеспечивающей образование многочисленных стабилизирующих контактов между удаленными по цепи остатками. Наличие у одного из ди-85-продуктов дисульфидной связи ys - ys отвечает самой ранней стадии формирования -структуры, когда фрагмент Arg - ys еще лишен дальних взаимодействий с последующими остатками и является практически свободным. Как показал расчет (см. табл. IV.5 и рис. IV.9), наиболее низкой энергией в этом случае обладает конформация фрагмента со сближенными боковыми цепями ys и ys , отличающаяся от нативного состояния только значением угла v остатка Рго . Возникающее в период зарождения -структуры случайное отклонение, сближающее 5-й и 14-й остатки ys, оказывается самой предпочтительной по энергии, или, иными словами, неравновесной бифуркационной флуктуацией. Это отклонение станет невозможным или потеряет свою актуальность, будет высокоэнергетичным и обратимым, если оно появится позднее, в середине или в конце процесса формообразования -структуры. Статус бифуркационной флуктуации приобретет другое конформационное отклонение, сближающее остатки ys и ys . Как следует из расчета [11], образование дисульфидной связи ys - ys в ситуации, близкой к стадии полного завершения -структуры, также реально и энергетически выгодно. Сближенность остатков ys и ys достигается в конформации фрагмента Arg - ys , отличающейся от его состояния в нативной структуре белка значением лишь одного двугранного угла ф остатка Gly . [c.478]

На основе теории релаксационных конформационных переходов Блюменфельд в последние годы провел экспериментальные исследования синтеза АТФ в биологических мембранах — как в митохондриях, так и в тилакоидах (см. гл. 14). Показано, что АТФ синтезируется из АДФ и фосфата при скачкообразном повышении pH среды от 5 до 9. Это можно трактовать не как результат создания трансмембранного градиента pH, а как следствие возникновения неравновесных состояний АТФ-азы и других белков в цепях электронного транспорта н/или целой тила-копдной мембраны благодаря диссоциации определенных кислот- [c.440]

Любое локальное химическое изменение молекулы белка (присоединение субстрата или ингабитора к активному центру, редокс изменения металла в простетической группе, ионизация кислотной или основной группы и т.д.) приводит к появлению конформационно неравновесного состояния. Быстрая колебательная релаксация активного центра и его ближайшего окружения происходит немедленно после локального возмущения, в то время как структура основной белковой глобулы остается практически неизменной. Молекула становится неравновесной. Новое, кинетически доступное состояние фермент-субстрат-ного комплекса соответствует конформационно измененной структуре с продуктом, связанным с активным центром. Превращение субстрата в продукт реализуется в ходе конформационной релаксации фермент-субстратного комплекса к новому состоянию равновесия. Этот переход протекает чрезвычайно медленно по сравнению с масштабом времени колебательной релаксации. В некоторых случаях этот процесс занимает несколько сотен миллисекунд или даже несколько секунд [37]). [c.68]

Данные об образовании конформационно неравновесных состояний железосерных белков, ифающих важную роль во внутриклеточной трансформации энергии, будут рассмотрены позже. В конце этого парафафа будут описаны различные методы получения неравновесных форм белков в растворах при комнатной температуре. До настоящего времени этой техникой было исследовано несколько сотен белков, зарегистрирована кинетика их релаксации и установлены их физические и химические свойства. Здесь будут даны только принципиальные выводы из результатов этих исследований. Ссылки на соответствующие публикации можно найти в книгах [1,31,37,41]. [c.78]

Методом импульсного радиолиза достигается быстрое (т 10 с) восстановление иона металла в активном центре металлопротеина электронами, которые образуются во время радиолиза. Таким образом проводили восстановление ферри-гемоглобина и его комплексов с ОН , Е , N , N3 термолизованными электронами (Л. А.Блюменфельд). Восстановление атома железа до Ее + происходит в этих условиях в конформации белка, соответствующей исходной ферриформе (Ее +), так что белок в первые моменты находится в неравновесном состоянии. При низкой температуре (77 К) неравновесные восстановленные формы можно зафиксировать и идентифицировать по характерным особенностям в спектрах поглощения. Гемовое железо Ее " в этих неравновесных белках находится в низкоспиновом состоянии в отличие от равновесных белков, где оно исходно высокоспиновое. Конформационная релаксация к равновесному состоянию протекает в несколько стадий с константами скоростей порядка от 1-10 до 10" -10 с . [c.262]

Высота барьеров может претерпевать динамические изменения не только за счет кулоновских взаимодействий ионов в канале, но и в результате конформационных перестроек белка, формирующего ионный канал, которые могут инициироваться перескоками иона между отдельными участками связывания. Сильное электрическое поле иона, попадающего в канал, вызывает поляризацию и переориентацию близлежащих полярных групп. В результате появления такого крнфор-мационно неравновесного состояния смещается уровень потенциальной энергии в участке связывания и изменяется высота ближайших барьеров. [c.121]

Сборка белка начинается с чисто случайного, но неизбежного появления на некоторых олигопептидных участках цепи независимых друг от друга необратимых флуктуаций. Уникальные конформационные отклонения рано или поздно приведут к образованию за счет ближних и средних невалентных взаимодействий остатков нескольких жестких локальных структур - нуклеаций, разделенных участками, оставшимися подвижными. Таким образом, первый этап свертывания белковой цепи включает ряд параллельно идущих процессов структурирования отдельных фрагментов и завершается образованием первого промежуточного состояния ( ]). В результате на термодинамической ветви возникла первая бифуркационная точка, являющаяся поворотной в отношении направленности и характера дальнейшего развития событий с этого момента механизм сборки белка становится истинно неравновесным процессом. Далее, также за счет случайно возникающих флуктуаций в специфические взаимодействия вовлекаются удаленные по цепи остатки, принадлежащие разным участкам белка. Их сближенность происходит опять-таки только при определенных и поэтому необратимых флуктуациях. Структурная стабилизация возникает здесь за счет пространственной комплементарности избирательно контактирующих конформационно жестких фрагментов. [c.465]