Антигены мол. масса, метод ДСН—ЭПА

Кроме того, описанный метод широко используется при изучении биосинтеза и иммунологических свойств белков. В этих случаях белки осаждают специфическими антителами, осадок растворяют в присутствии ДСН и затем анализируют методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Такой способ позволяет легко очистить белки за счет их антигенных свойств диссоциирующие при электрофорезе легкие и тяжелые цепи антител могут служить внутренними стандартами молекулярной массы [197, 423, 959, 1466]. [c.225]

Большинство этих недостатков устраняется при переходе к гомогенным видам анализа, основанным на эффекте модуляции активности фермента при образовании комплекса антиген — антитело. Однако на сегодняшний день эти методы в совершенстве разработаны в основном для анализа низкомолекулярных антигенов. В связи с этим представляют интерес методы ИФА, позволяюш,ие анализировать различные по молекулярной массе соединения без применения твердых носителей. [c.112]

Как и антитела, антигены могут быть ковалентно связаны с носителем либо адсорбированы на нем. Многообразие соединений, которые могут являться антигенами, затрудняет выработку каких-либо единых рекомендаций. Выбор метода связывания антигена с носителем зависит от структуры и молекулярной массы соединения. [c.212]

Значительно более прецизионный подход основан на титровании активных центров иммобилизованных антител меченым антигеном. В качестве метки целесообразно использовать низкомолекулярные соединения (изотоп, флуоресцирующий краситель, кофактор и т. д.), чтобы в максимальной степени снизить вероятность экранирования меткой антигенных детерминант. Суть метода заключается в насыщении микроколичеств иммуносорбента меченым антигеном. Получаемая в результате опыта изотерма адсорбции позволяет вычислять концентрацию и константы связывания иммобилизованных молекул антител. Так как в подобном эксперименте определяется не абсолютная концентрация активных центров антител, а концентрация центров, доступных для взаимодействия с антигеном, следует ожидать, что эта величина будет различной для антигенов с разными размерами и молекулярной массой. Например, при иммобилизации антител разной специфичности часть центров может экранироваться носителем от контакта с макромолекулярным антигеном, но быть доступной для низкомолекулярного. [c.218]

Второй тип методов известен как сандвич -анализ. Методы этого типа применяются сравнительно недавно для определения веществ с молекулярной массой более 1000, имеющих как минимум две антигенные детерминанты (эпитопы). В этих методах избыток связывающих антител прямо или опосредованно связывают с твердой фазой. Вторые меченые антитела против другого эпитопа добавляют или одновременно при связывании с антителами первого типа (одностадийный метод), или после завершения стадий связывания и отмывки (двухстадийный метод). После завершения иммунологической реакции количество связавшегося с твердой фазой вещества непосредственно зависит от количества определяемого вещества в пробе. Уровень фона (неспецифического сигнала) наиболее сильно влияет при низких концентрациях определяемого вещества. В данном случае хорошо подобранная аналитическая система позволяет определять соединения в диапазоне концентраций, составляющем четыре-пять порядков с коэффициентом вариации менее 5%. Чувствительность методики зависит от ошибок при отборе проб, уровня фона и констант связывания антигена с антителами. [c.9]

Чу с сотрудниками разработали методы выделения, очистки и количественного определения антигена предстательной железы. Этот> антиген выделяли из семенной жидкости или ткани предстательной железы человека. Грубые экстракты тканей обрабатывали сульфатом аммония и преципитируемый материал растворяли, диализовали и далее очищали путем колоночной хроматографии (ДЭАЭ и сефадекс). Фракции с мол. массой 26—37 кД, содержащие антиген предстательной железы, кон- [c.152]

Несмотря на то что методы преципитации в геле занимают значительное место в изучении и количественном определении антигенов, а также широко применяются для контроля специфичности и определения титра преципитирующих антител, предел чувствительности данных методов составляет около 5 мкг/мл, и их невозможно использовать для количественного определения антигенов небольшой мол. массы, которые образуют только нерастворимые комплексы. По этой причине возникла необходимость в разработке альтернативных методов количественного определения антигенов. В 1945 г. Кумбс и сотр. [c.12]

Очень простой метод, требующий минимального оборудования, ио больших временных затрат, особенно для АГ с высокой мол. массой. Необходимы антигенные стандарты То же, что для РИД. Тест продолжительный, особенно для IgM. Необходима стандартная сыворотка сравнения (контрольная) [c.25]

I. Определение индивидуальных антигенов в растворе (РИД). Данный -метод обычно используют для определения сывороточных белков, в частности иммуноглобулинов при подозрении на множественную миелому или в случае недостаточности иммуноглобулинов. Можно определять и компоненты комплемента. В основном с помощью РИД определяют любые антигены (при наличии специфических антител), концентрация которых составляет не менее 5 мкг/мл и мол. масса не превышает 10 . Необходим и стандартный препарат антигена. Стан- [c.208]

Во всех методах сложно осуществить присоединение белка к поверхности преобразователя, поскольку оно не должно затрагивать активный участок. Если модифицированную поверхность использовать непосредственно без метки или медиатора, нужно предотвратить все иеспецифические взаимодействия, поскольку прямые измерения без метки, включающие обычно контроль изменения массы или показателя преломления на поверхности, не могут различить специфические или неспецифические взаимодействия. При иммобилизэл ции поверхности с плотной упаковкой неспецифическое связывание не происходит, тем не менее, иммобилизация часто бывает неэффективной для о а-зования комплекса антитело-антиген из-за стерических препятствий. Наоборот, упаковка с большими промежутками обычно допускает неспецифические взаимоде твия с расположенной ниже поверхностью, и, таким образом, можио з егистрировать значительные ошибочные сигналы. [c.525]

Во многих определениях существует значительная разница в размерах рецептора и лигавда. Антитела имеют молекулярные массы порядка 160 ООО и могут быть легко отделены от антигенов с молекулярной массой менее 80 ООО. Наиболее широко ддя этой цели применяется эксклюзионная гель-фильтрующая хроматография. Небольшой свободнь1й меченый антиген удерживается на колонке, в то время как объемистый комплекс антиген-антитело элюируется. Метод обеспечивает хорошее разделение, но он дорог н требует затрат времени, так что он не подходит для рутинного, многократного использования. [c.578]

Лофотрихи имеют пучок жгутиков на одном из концов клетки. Ам-фитрихи имеют по одному жгутику или пучку жгутиков на противоположных концах клетки. Жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке специальными дисками. По химическому составу жгутики состоят из белка флагеллина (от англ. flagella — жгутик), обладающего антигенной специфичностью. Молекулярная масса этого белка 40 ООО Да, он не содержит цистеина, в его составе много дикарбоновых и мало ароматических аминокислот. Субъединицы флагеллина закручены в виде спирали. Жгутики выявляют с помощью электронной микроскопии препаратов, напыленных тяжелыми металлами, или световой микроскопии после обработки препаратов специальными методами (например, после серебрения). [c.8]

Фактор II, названный протективным антигеном, представляет собой белок, он получен в нескольких молекулярных формах минимальная субъединица, обладающая специфическими иммуно-генными свойствами, имеет молекулярную массу 8500 Да. Извдр-чение наряду с этим антигенно родственного белка с молекулярной массой 51 ООО позволило предположить о гексамерной организации протективного антигена. Методом хроматографии на сефадек-се G-75 молекулярная масса протективного антигена была определена равной 100 ООО Да. [c.367]

B для аффинной хроматографии антител типа IgG и антигенов. Белок А (мол. масса 42 ООО, выделен из Staphylo o us aureus) иммобилизован на поперечносшитом агарозном геле (см. разд. 30) бромциановым методом. Белок специфически взаимодействует с молекулами иммуноглобулинов IgG некоторых подтипов. Так как взаимодействие белка А с IgG не затрагивает у последних той части молекулы, посредством которой связываются антитела, возникает возможность выделения и очистки антигенов на БСС с адсорбированным IgG соответствующего типа. Элюирование комплекса антиген антитело выполняют с помощью 3 М раствора изотиоцианата калия. [c.227]

Биохимические метйды, используемые в стандартизации и контроле качества лекарств. Для стандартизации и контроля качества лекарств используют три группы методов. 1. Физические методы — спектрофотометрия, флюоресцентный анализ, масс-спектрометрия и др. 2. Химические методы неорганического, коллоидного и органического анализа состава лекарств и их метаболитов. Эти группы физико-химических методов позволяют установить структуру вещества и лишь сделать предположение о его биологической активности. 3. Биохимические исследования с использованием субклеточных фракций, клеток, тканей, органов и организмов позволяют оценить биологическую активность лекарств. Применение биохимических методов обеспечивает стандартизацию лекарств и контроль качества на этапах производства и хранения. Широкое распространение получило использование свойства специфического взаимодействия белков в системах фермент—субстрат , лекарство—рецептор , антиген-антитело . На основе этого фундаментального свойства белков созданы специфичные и высокоточные методы радиоиммунно-го, иммуноферментного, хемилюминесцентного анализа, аффинной хроматографии и др. [c.478]

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Применение аффинной хроматографии в качестве метода изучения взаимодействий находится еще на ранней стадии развития, несмотря на то что количественная аффинная хроматография была введена уже десять лет назад [1—3]. Действительно, количество исследований, касающихся методологических аспектов аффинной хроматографии, примерно равно количеству сообщений по применению этого метода в конкретных экспериментальных системах. Большинство этих исследований способствовало применению аффинной хроматографии для оценки равновесия с участием ферментов и модификаторов, ингибиторов или субстратов [1—12], но метод был также использован и для характеристики взаимодействий белок — лекарственный препарат [13], система антиген — антитело [14] и, в меньшей степени, белок-белковых взаимодействий [15, 16]. По существу метод заключается в иммобилизации биоспецифической реагирующей группы X на инертной хроматографической матрице (например, часто на сефарозе) и определении средневзвешенных величин объема элюирования Уа распределяющегося растворенного вещества А в ряде хроматографических экспериментов, в которых растворенное вещество мигрирует в присутствии различных концентраций лиганда 5, также специфически взаимодействующего с А и/или X, В некоторых примерах различные изменения значения Уа отражали конкуренцию между растворенными и иммобилизованными реагентами за одно и то же положение в А [2—5, 7—14] в других изменения в величинахГд были обусловлены наличием взаимодействия иммобилизованного реагента X с бинарным А5-комплексом, образованным растворенным веществом и растворимым лигандом [1, 6]. Цель количественной аффинной хром ографии — объяснить возникновение изменений в величинах Га в предложении существования тех или иных равновесий. Поскольку положение равновесия зависит от концентрации (в соответствии с законом действия масс), точное определение состава смеси реагентов, к которой относится Га, обеспечивает применение фронтальной хроматографии [3, 4]. [c.192]

Вестерн-блоттинг—это метод иммунологического выявления электрофоретически разделенных антигенов, связанных с твердой подложкой. В качестве подложки используют нитроцеллюлозный фильтр [8]. Разделение обычно проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Такая система позволяет разделить белки по их мол. массе, что повышает ценность метода, поскольку можно получить данные [c.357]

С другой стороны, анализ на1эснове меченых антигенов сопряжен с рядом сложностей. Разнообразие строения и физико-химических свойств антигенов препятствует созданию универсальных методов получения антигенферментных конъюгатов. Схема введения метки в один антиген часто оказывается неприемлемой при переходе к другому. По существу, синтез большинства конъюгатов антигенов с ферментами представляет собой самостоятельную задачу, сложность которой возрастает по мере уменьшения молекулярной массы и растворимости антигена. [c.100]

Достоинствами данной модификации ИФА являются 1) отсутствие твердой фазы 2) быстрота разделения компонентов реакционной системы (I тип) 3) экспрессность при сохранении высокой чувствительности (время определения IgG человека в концентрации Ю" М не превышает 10 мин) 4) возможность быстрого анализа антигенов с различной молекулярной массой. К основным недостаткам, снижающим универсальность метода, относятся возможность неспецифической сорбции соединений на полианионе или поликатионе и необходимость сга<9ыы промывки нерастворимого поликомплекса при определении ферментативной активности в осадке. [c.112]

Описанный выше метод применяется для разделения экст-рапированных бактериальных и паразитарных антигенов, а также компонентов сыворотки человека. Он позволяет получать хорошие полосы бел ков с мол. массой от 150 до 10 кДа. Для ограничения этого диапазона можно изменить концентрации акриламида. Известны наборы для приготовления минигелей см. приложение). В них. входят специальные кассеты для заливки гелей. Они более экономичны с точки зрения расхода реагентов и требуют меньше времени, но одновременно снижается разрешающая способность при разделении очень сложных смесей. Компромисс состоит в использовании мини-гелей с различными концентрациями акриламида. Рис. 2.4 иллюстрирует разрешающую способность 14%-ного геля шириной 14 см при разделении экстрагированных из мембран и разрушенных белков Е. oli и микобактерий. Последние служат исходным материалом для получения как моноклональных антител, так и кроличьей полиспецифической антисыворотки. Белки Е. соИ получают следующим образом [27]. [c.62]

Молекулы, разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, можно электрофоретически перенести на нитроцеллюлозную мембрану, с которой они свяжутся, воспроизведя картину элекрофоретического разделения. Этот процесс называют Вестерн-блоттингом или электроблоттингом [10, 17]. После блоттинга треки стандартного антигена и маркеров мол. массы окрашивают белковым или углеводным красителем, а остальные. инкубируют с образцами антител 9, 18]. С помощью меченых антител выявляют отдельные антигенные полосы (после электрофореза в. восстанавливающих условиях — субъединицы сложных молекул антигенов). Эту стадию называют иммунохимическим окрашиванием. В полном варианте метода используют как исключительную способность электрофореза в ПААГ разделять молекулы, концентрации которых очень малы, так и свойство антител выявлять специфические антигенные компоненты. Таким образом, метод чаще всего применяют для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения специфичности антител (в частности, МКА) и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или раз-лич.ных антигенных препаратах (например, различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.). [c.230]

К сожалению, реакция циклазного аппарата при активации лимфоцитов антигеном остается неизученной, хотя работы в этом плане публикуются уже более 10 лет. Основным недостатком имеющихся работ является очень малое содержание (около 10" —Ю" ) клеток, специфичных к данному антигену, в общей массе исследованных лимфоцитов. В последние годы стали широко применять методы выращивания антигенспецифических клонов нормальных лимфоцитов. В связи с этим уже в ближайшее время следует ожидать существенного прогресса знаний о состоянии циклазной системы и других биохимических перестроек лимфоидной клетки при ее активации антигеном. [c.51]

Аффинностью, или сродством, антител к антигену называют силу их взаимодействия (прочность связи) — результирующую перечисленных выше сил притяжения и отталкивания (рис. 9.5). Взаимодействие антигенсвязывающего центра с антигеном можно исследовать термодинамическим методом. Для измерения аффинности отдельного антигенсвязывающего центра используют моновалентный антиген, или, точнее, изолированную антигенную детерминанту (гаптен). Поскольку нековалентные связи между паратопами и эпитопами способны диссоциировать, образование иммунных комплексов — процесс обратимый применив к нему закон действующих масс, можно определить константу равновесия К, которая собственно и представляет собой константу аффинности (сродства) рис. 9.6). [c.152]

В тех случаях, когда из биомассы или центрифугата (культуральная жидкость) необходимо вьщелить активную субстанцию — витамин, аминокислоту, антиген, антитело, фермент и пр., применяют физические или физико-химические методы очистки. Выбор их определяется свойствами вьщеляемого вещества (природа, молекулярная масса, лабильность к внешним воздействиям, химическое сродство и т.д.). Из физических методов чаще всего применяют на первичных стадиях сепарирование, центрифугирование (ультрацентрифугирование), а из физико-химических — осаждение нейтральными солями, спиртом, ацетоном, а также ультрафильтрацию, хроматографию, электрофорез. Методы вьщеления и очистки, как правило, многоступенчатые. Чистоту получаемого продукта характеризуют наличием в нем примесей и выражают коэффициентом очистки, который представляет отношение числа активных единиц продуктов на 1 мг белка или азота (так называемая удельная активность) в очищенном препарате к удельной активности исходного (неочищенного) продукта. [c.97]