Клетки иммунологическими методам

Один метод локализации со специфической физиологической активностью был позаимствован нз ПЭМ. Этот метод меток поверхности клетки, который, будучи применен к образцам для РЭМ, приводит к образованию на поверхности клетки морфологически различаемых или аналитически идентифицируемых структур. Такие методики в сочетании с растровой электронной микроскопией высокого разрешения позволяют изучать природу, распределение и динамические свойства антигенных и рецепторных состояний на поверхности клеткн. Методы нанесения меток на поверхность клетки в общем случае достаточно сложны и включают процедуры иммунохимической и биохимической очистки. Подробные ссылки на них можно найти в работах [359—361], но сущность методик состоит в следующем. Для крепления антител в определенных антигенных состояниях на поверхности клетки используются стандартные иммунологические процедуры. Хитрость состоит в том, чтобы модифицировать антитела таким образом, чтобы они также несли морфологически различимую метку, такую, как латексные шарики или сферы из двуокиси кремния, распознаваемый вирус, как, например, вирус табачной мозаики, или один из Т-четных фагов, как показано на рис. 11.18, илн белковая молекула известных размеров, как ферритин или гемоцианин. В работе [362] (рис. 11.19) использовались гранулы золота, которые имеют большой коэффициент вторичной электронной эмиссии. Одна часть антитела имеет средство для специфичного антигенного закрепления на поверхности клетки, в то время как другая часть несет морфологически различимые структуры. В настоящее время иммунологические методы достигли такого уровня, когда они не могут быть использованы для изучения как качественных, так и количественных характеристик поверхности клетки [363, 364]. [c.244]

За четыре года, прошедших со времени выхода в свет первого издания книги Молекулярная биотехнология принципы и применение , в области биотехнологии было сделано огромное количество открытий. На рынке появилось множество новых генноинженерных продуктов (например, вакцин и лекарственных препаратов). Рутинной практикой клинических лабораторий стало использование иммунологических методов диагностики и методов, основанных на применении полимеразной цепной реакции. Открыты и охарактеризованы многие гены, ассоциированные с различными заболеваниями человека, неизмеримо возрос объем клинических испытаний в области генной терапии. Построены подробные генетические и физические карты хромосом человека впервые из дифференцированной соматической клетки клонировано жизнеспособное млекопитающее. Производство одного из трансгенных растений, сои, поставлено на коммерческую основу. [c.7]

Рис. 14-63. Иммунологический метод идентификации белков плазматической мембраны, участвующих в межклеточной адгезии. На этапе 1 получают антитела (обычно кроличьи) к исследуемым клеткам или к их изолированным плазматическим мембранам. На этапе 2 выделяют и тестируют моновалентные фрагменты, чтобы получить препарат антитела, блокирующий межклеточную адгезию. (Используются моновалентные фрагменты, пол ченные с помощью протеаз - см. разд. 18.2.4), так как они не сшивают клетки и, таким образом, не вызывают ложной адгезии.

Примеры использования иммунологических методов в биологическом анализе 263 Примеры использования радиоиммунологического анализа 269 Иммунологические методики для локализации веществ в клетках, тканях и молекулах флуоресцентные антитела и антитела, связанные с ферритином 272 Список литературы 272 Задачи 273 [c.577]

Разработана препаративная сортировка клеточных частиц, основанная на различии их электрофоретической подвижности. Этот метод, названный свободным распределительным электрофорезом, нашел применение в иммунологических исследованиях. Через вертикально устанавливаемую камеру, боковыми стенками которой служат электроды, с постоянной скоростью протекает среда, в которой могут быть суспендированы клетки. В эту же камеру вводится взвесь клеток. Их путь в камере зависит [c.101]

Мы сегодня знаем, что рак не передается по наследству и не вызывается веществами, производимыми самим организмом. Скорее всего, как следует из современного уровня знаний, он возникает под действием окружающей среды. Недавно было установлено, что внезапное появление опухоли связано с дефектами иммунологической системы. Согласно этим воззрениям, потенциальные раковые клетки начинают расти лишь тогда, когда защитные силы организма ослаблены либо возрастными явлениями, либо искусственным угнетением иммунного механизма. На этой стадии большей частью и осуществляется лечение по правилу мечом и лучом , как говорят медики. Для этого метода важно, чтобы опухоль была локализована, т.е. не распространя- [c.333]

Наконец, клетки ин виво подвержены воздействию иммунологических и гормональных факторов, которые отсутствуют в условиях культивирования. Эти различия означают, что радиационные эффекты ин витро не идентичны эффектам ин виво. Это привело радиобиологов к необходимости разрабатывать методы определения выживаемости клеток ин виво. [c.66]

Метод гибридизации ДНК и иммунологические методы позволяют идентифицировать многие гены и их продукты. Если при этом искомый ген кодирует фермент, не синтезируемый клеткой-хозяином, то для обнаружения клонов, содержащих данный ген, можно использовать метод идентификации на чащках. Так были идентифи- [c.69]

Рис. 9.2. Скрининг клеток, вырабатывающих моноклональные антитела. Вьщеляют клетки селезенки мыши, иммунизированной специфическим антигеном, и проводят их слияние с клетками миеломы, не вырабатывающими антитела. Слившиеся клетки отбирают по способности к росту на среде ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Клетки, вырабатывающие специфические антитела к иммунизирующему антигену (клетки гибридомы), идентифицируют иммунологическими методами и субкультиви-руют, чтобы получить отдельные клоны. Из гибридомы, растущей в культуре и секрсти-рующей единственный тип молекул антител, получают моноклональные антитела.

Для идентификации некоторых гликопротеинов клеточной поверхности, участвующих в межклеточной адгезии у позвоночных, был использован иммунологический метод, представленный на рис. 14-63. В одном из наиболее изученных примеров были получены фрагменты моновалентного антитела к клеткам сетчатки куриного эмбриона. Затем были отобраны антитела, ингибирующие реагрегацию этих клеток in vitro. Мембранные белки клеток сетчатки были затем фракционированы и испытаны на способность нейтрализовать блокирующую активность антител. Таким путем был идентифицирован крупный (около 1000 аминокислотных остатков) грансмембранный гликопротеин, названный молекулой адгезии нервных клеток (N- AM). N- AM экспрессируется на поверхности нервных и глиальных клеток (разд. 19.1.6), склеивая их при участии [c.520]

Известны примеры эукариотических полипептидов, продуцируемых в клетках Е. oli в виде растворимых гибридных или обычных белков [1]. В некоторых случаях в растворенном состоянии находится только часть полипептида остальной белок входит в состав нерастворимых включений. Многие процедуры очистки, описанные для таких белков, предусматривают стадию аффинной хроматографии это либо иммунологические методы очистки, либо аффинная хроматография с использованием субстрата [1]. [c.128]

Для получения поликлональных антисывороток, используемых в повседневных иммунологических методах исследования, особенно в реакциях преципитации, применяют более крупных животных, в частности лабораторных кроликов. Кроликов можно содержать в клетках, они хорошо размножаются в неволе, выносливы и долго живут. Уход, иммунизация и взятие Крови у этих животных не представляют труда. Полученные от кроликов антисыворотки обладают хорошими преципитиру-ющими свойствами и стабильны при хранении, иммуноглобулиновая фракция легко поддается очистке. Кроме того, такие антисыворотки, обладая высокой авидностью/аффинностью пригодны для использования в чувствительных иммунологических тестах. В течение нескольких месяцев в период максимального ответа можно получить не менее 100 мл антисыворотки и еще 150 мл при аутопсии. Аутбредные кролики отвечают на иммуноген по-разному, поэтому следует использовать для иммунизации несколько животных, протитровать их сыворотки по отдельности, затем смешать отобранные пробы, если требуется максимальное разнообразие антител. Кролики достаточно хорошо отвечают на широкий спектр ммуногенов в сочетании с адъювантом Фрейнда образованием IgG. [c.41]

Потребность в более прочных липосомах возникла также в ходе реализации одной из новейших идей в химиотерапии опухолей [42]. Вместо того чтобы доставлять в опухолевую клетку цитотоксичные ФАВ, убивающие клетку изнутри, можно дестабилизировать мембрану такой клетки, т. е. убить ее снаружи. Для этого необходимы корпускулы, так как процесс протекает на клеточном уровне. Как уже было отмечено, обычные липосомы могут сливаться с клеткой, но при этом гибнет липосома. Для уничтожения же опухолевой клетки необходимо, чтобы возможность слияния сохранялась, но разрушению подвергалась клетка, т. е. мембрана липосомы должна быть прочнее, чем клеточная мембрана. Проблема целеузнава-ния будет решаться при этом так же, как и для обычных липосом, действующих на молекулярном уровне, т. е. иммунологическими методами. [c.231]

Т-клетки 004 и 008 в раковой опухоли молочной железы. Эти клетки выявлены с помощью иммунологического метода окрашивания на щелочную фо-сфатазу (розовый цвет) с использованием моноклональных антител. Срезы контрастированы гематоксилином. Видны окружающие опухоль клетки С04 вверху) и в меньшем количестве С08 внизу), а также редкие лимфоциты внутри опухоли. [c.382]

Выявление микрометастазов с помощью моноклональных антител. Микрофотография отпечатка клеток из лимфатического узла, дренирующего область расположения злокачественной опухоли. Отпечаток окрашен на щелочную фосфатазу иммунологическим методом с использованием антител к цитокератину. Клетки карциномы зкспрессируют цитокератины, и в отпечатке ясно видна крупная, окрашенная в розовый цвет опухолевая клетка. При обычном цитологическом исследовании редкие опухолевые клетки, как в представленном отпечатке клеток лимфатического узла, легко могут быть пропущены. [c.386]

Быстрый прогресс клеточн й тммуиологии был связан с использованием иммунологических методов. Особую роль сыграло применение меченых антител, каждое из которых реагирует с одним из вариантов Н-или Ь цепей или с каким-либо иным антигеном. Пометив такое антитело радиоактивным соединением (например, Н, 1) или флуоресцирующим красителем и обработав ими пр параты (ма ки или срезы) лимфатических кл ток, можно с потной определенностью выявить клетки, с кретирующпе ти содержащие на поверхности тот ти инои антиген, например антиген ц-цепи имм н поб>л ш в. [c.6]

Различные вновь синтезируемые белки способствуют процессу межклеточной адгезии, позволяя мигрирующим миксамебам плотно слипаться друг с другом и формировать многоклеточный организм. В первые 8 ч голодания клетки слипаются с помощью Са -зависимого механизма с участием адгезивной молекулы, называемой контактным сайтом В. Через 8 ч вступает в действие другая адгезионная система, ще слипание кпеток осуществляется Са -независимым механизмом с участием молекулы межклеточной адгезии, называемой контактным сайтом А. Контактные сайты А и В были вьщелены и идентифицированы как интегральные гликопротеины плазматической мембраны с помощью остроумного иммунологического метода, представленного на рис. 14-63. Позднее этот метод был использован для идентификации молекул межклеточной адгезии также и у позвоночных. [c.517]

Для выявления рекомбинантных клонов, синтезирующих экзоглюканазу, использовали иммунный скрининг, позволяющий идентифицировать белок-мишень с помощью специфичных к нему антител секреция белка при этом необязательна. Рекомбинантные клетки лизи-ровали in situ (парами хлороформа), перенесли цитоплазматические белки на найлоновый или нитроцеллюлозный фильтр и провели иммунологический тест. Использованный при этом метод реплик позволил сохранить жизнеспособные клетки для дальнейших исследований. [c.298]

В настоящее время около половины идентифицированных ферментов находятся в клетках и тканях в виде множественньгх молекулярньгх форм, имеющих единую субстратную специфичность, но отличающихся по физико-хими-ческим или иммунологическим свойствам. Генетическая основа молекулярной гетерогенности обусловлена наличием нескольких генов, каждый из которых кодирует одну субъединицу фермента или одну его молекулярную форму. Кроме того, различные молекулярные формы одного и того же фермента могут кодироваться в одном генном локусе, имеющем множественные аллели. Генетически детерминированные молекулярные формы называются изоэнзимами. Посттрансляционные модификации ферментов, обусловленные локальным протеолизом, ковалентными модификациями, белок-белковыми взаимодействиями и т. д., являются причиной образования множественных молекулярных форм, не являющихся истинными изоэнзимами, но играющими существенную роль в метаболических процессах. Наиболее часто встречаются так называемые конформеры — молекулярные формы, имеющие одинаковую первичную структуру, но отличающиеся по своей конформации. Это возможно в том случае, если эти конформации достаточно устойчивы, т. е. соответствуют уровню свободной энергии, близкой к минимальной. Только такие конформационные варианты белков, которые воспроизводимо фиксируются посредством электрофоретических, хроматографических или иных методов, могут рассматриваться как конформеры. [c.83]

Когда врач ставит диагноз рака, его пациент, как правило, уже буквально наводнен миллионами раковых клеток отсюда легко заключить, что его организм иммунологически толерантен к раковым клеткам (ко всем или лишь к определенным ) и считает их своими . Исходя из этого, можно предложить и метод лечения — разрушение такой иммунологической тшерантности, например путем пересадки иммунологически компетентных клеток от иммунного организма. [c.367]

Полагают, что макромолекулы, обладающие групповой специфичностью, синтезируются с помощью последовательного или конкурирующего действия ферментов, которые в свою очередь образуются под влиянием различных генов (см. раздел 7). Поэтому в одном и том же активном материале, выделяющемся эпителиальными клетками, нельзя иметь групповые вещества, молекулы которых. идентичны. Таким образом, цель болео ранних работ по групповым веществам — получение полностью гомогенных препаратов,— вероятно, неосуществима. Однако можно максимально приблизиться к разрешению этой проблемы, если для изучения использовать препараты от одного индивидуума. При этом необходимо с помощью различных физических (электрофорез и ультрацентрифугировапие), химических (дробная растворимость) и иммунологических (специфическая преципитация, торможение гемагглютинации) методов убедиться в том, что исследуемый материал не содерлшт примесей [56]. [c.171]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

Метод моделирования и получения искусственных мембран основан на получении и исследовании моно- и бимолекулярных липидных слоев, везикул, липосом и протеолипосом. Сущ ествует два основных типа искусственных мембран классические плоские и сферические мембраны различного размера. Для получения искусственных мембран используют различные фосфатиды, нейтральные глицериды, смеси липидов биологического происхождения, добавляя к ним холестерин, а-токоферол и другие минорные добавки. Потенциальная ценность искусственных мембран для исследований зависит от возможности включения в них природных белков, в особенности тех, которые обладают транспортными свойствами. Липосомы, со-стоящ ие из белков и липидов, стали получать в 60-е гг. термин протеолипосомы был введен В. П. Скулачевым. В настоящее время разработан целый ряд методов приготовления различных типов липосом и протеолипосом, а также их стандартизации по размерам, структуре, гомогенности, стабильности и другим характеристикам. Липосомы используют для доставки в клетку лекарственных и химических соединений, стабилизации ферментов в инженерной энзимологии, введения в клеточные мембраны молекул зондов, модифицирующих и моделирующих их поверхность. Большой интерес для генной инженерии и медицины представляют работы по введению в клетки при помощи липосом нуклеиновых кислот и вирусов. В липосомы включают митохондриальные компоненты и изучают на таких модельных системах процессы генерации энергии в клетках. Ультра-тонкие искусственные мембранные структуры — полислои Лен-гмюра—Бложе (ПЛБ) — применяют для получения био- и иммуносенсоров. Создаются ПЛБ с иммобилизованными ферментами и компонентами иммунологических систем. При использовании смешанных липид-белковых пленок ПЛБ получают информацию о функционировании белков и о липид-белковых взаимодействиях в мембране. Результаты изучения физических характеристик, проводимости, проницаемости и других свойств искусственных липидных мембран имеют большое зна- [c.216]

Успех создания Т/В-клеточных химер, полностью лишенных В-клеточной популяции хозяина и не загрязненных Т-клетками донора, зависит главным образом от эффективности уничтожения популяции В-клеток хозяина, которая определяется правильной дозировкой циклофосфамида, вводимого по жесткому расписанию. Не менее важно, чтобы адекватное число жизнеспособных клеток фабрициевой сумки донора было трансплантировано реципиенту без значительной примеси периферической крови, которая является потенциальным источником Т-клеток. Лучше всего получать клетки фабрициевой сумки от донорОБ-цыплят 1—3-суточного возраста или даже от зародышей поздних стадий (20—21-е сутки). Клетки фабрициевой сумки, взятые в этот период, гораздо эффективнее заселяют строму соответствующего органа реципиента, и среди таких клеток не содержится Т-лимфоцитов или содержится лишь небольшое их число. Ценность описанных химер состоит в том, что они являются иммунологически полноценными животными, у которых В- и Т-клетки имеют хромосомные маркеры. Следовательно, химеры являются гораздо лучшими источниками В- и Т-лимфоцитов для функциональных исследований, чем те животные, у которых популяции В- или Т-клеток избирательно истощены общепринятыми химическими или хирургическими методами. В последнем случае всегда возникает вопрос, в какой степени отсутствие клеток данной линии дифференцировки влияет на функционирование оставшейся популяции лимфоцитов. Т/В-клеточные химеры птиц оказались чрезвычайно полезными при [c.420]

Для некоторых целей может понадобиться обогащение популяции лейкоцитов лягушек клетками того или иного типа, например Т- или В-лимфоцитами. Для этого с успехом применяют два метода, которые обычно используют в иммунологических исследованиях млекопитающих разделение клеток на нейлоновой вате и селекция клеток по их способности связываться с моноклональными антителами к иммуноглобулинам, так называемый Ig-пэннинг. [c.485]

При изучении аитител к антигенам клеточной поверхности обычно использовалнсь свежие нли фиксированные клетки в суспензии, что требовало затраты времени на центрифугирование. Недавно был описан метод (Sto ker, Heusser, 1979), в котором клетки иммобилизуются иа поверхности пластика и используются как нерастворимый антиген для различного рода иммунологических реакций. Ннже описаио применение этого [c.329]

Именно новейшая иммунологическая методология — основное содержание этой книги. В ней определены наиболее существенные методические достижения последних лет разработка способов культивирования и выделения клонов иммунокомпетентных клеток методика слияния В-клеток, образующих антитела, с клетками плазмоцитомы н последующее клонирование гибридбм, синтезирующих моноклональные антитела (иммунодиагностические реагенты, прикладное значение которых трудно переоценить) методы аналитического и препаративного разделения такой тонкости и чувствительности, которая позволяет анализировать ианомолярные количества антигенов и из общей смеси иммуноглобулинов выделять антитела, синтезированные одиим-единствениым клеточным клоном (в этом отношеиии поразительно эффективно изоэлектрофокусирование в тонком слое). [c.5]

Методы определения поверхностных клеточных антигенов нашли широкое применение во многих областях биологии. Среди антигенов клеточной поверхности первыми были описаны продукты генов главного комплекса гистосовместимости — те самые антигенные молекулы, которые обусловливают иммунологическую индивидуальность организма (Klein, 1975). Кроме этих универсальных поверхностных антигенов, присущих всем клеткам данной особи, отдельные клеточные популяции обладают уникальными, свойственными только им антигенами. Это было использовано при анализе тканей нервной системы (S ha hner et al., 1975) и особенно успешно — для идентификации многочисленных субпопуляций морфологически неразличимых лимфоцитов (Raff, 1971). [c.273]

Описанный метод обеспечил значительные успехи в изучении специфических антигенов, связываемых Т-клетками. Он впервые позволил идентифицировать Т-клетки, реагирующие на аитигены МНС, не по функциональной активности (пролиферация, цитотоксическое действие на клетки-мишени), а по специфическим антигенам, присоединяемым отдельными клетками. Применение этого метода уже позволило значительно продвинуться в понимании различных аспектов иммунологического распознавания антигенов МНС-реактивными клетками. Однако остается много нерешенных вопросов. Мы надеемся, что эта глава привлечет внимание исследователей к данной проблеме. [c.318]

Выбор методики получения вирусного препарата определяется целью дальнейшего исследования. Для изучения круга хозяев, серологических свойств, а также в качестве инфекционного материала можно использовать и неочищенные препараты вируса [2]. В качестве антигена или иммуногена [3], для клонирования и секвенирования вирусной РНК [4] и получения матричной РНК (мРНК), транслируемой в бесклеточных системах, необходимо иметь высокоочищенный вирус, не содержащий контаминантов клеточного или другого происхождения. Для изучения цикла репродукции вируса в зараженной клетке, характеристики полиовируса методом олигонуклеотидного картирования РНК [6, 7], анализа вирионных белков [8] и в ряде иммунологических исследований [9] применяют вирус, меченный радиоактивным изотопом. [c.44]

Смотреть страницы где упоминается термин Клетки иммунологическими методам: [c.189] [c.104] [c.386] [c.517] [c.184] [c.262] [c.14] [c.92] [c.30] [c.518] [c.520] [c.521] [c.362] [c.419] [c.346] [c.360] [c.343] [c.346] [c.118] [c.146]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология