Ферменты множественность

Разнообразные молекулярные формы фермента данного организма, катализирующие одну и ту же реакцию, но различающиеся по своим физическим и химическим свойствам, называются изоферментами (изоэнзимами). Ферментов, множественность молекулярных форм которых известна, около 50. Обнаружены изоферменты алкогольдегидрогеназы, пероксидазы, каталазы, амилазы, инвертазы и т. д. [c.84]

Одним из наиболее изученных 4 ферментов, множественность форм которого детально изучена методом гель-электрофореза, является ЛДГ, катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Пять изоферментов ЛДГ образуются из 4 субъединиц примерно одинакового размера, но двух разных типов. Поскольку Н-протомеры несут более выраженный отрицательный заряд при pH 7,0—9,0, чем М-про-томеры, изофермент, состоящий из 4 субъединиц Н-типа (Н,), при электрофорезе будет мигрировать с наибольщей скоростью в электрическом поле к положительному электроду (аноду). С наименьщей скоростью будет продвигаться к аноду изофермент М в то время как остальные изоферменты будут занимать промежуточные позиции. Следует подчеркнуть, что изоферменты ЛДГ, обладая почти одинаковой ферментативной активностью, различаются некоторыми физико-химическими свойствами молекулярной массой, электрофоретической подвижностью, отнощением к ак- [c.128]

ДНК-полимераза существует в различных формах в зависимости от выполняемых ею функций. Хотя это кажется невероятным, разнообразие форм ДНК-полимеразы обусловлено не субъ-единичной структурой, по крайней мере в бактериальных ферментах. Были охарактеризованы три различные формы фермента из бактерии Е. oli, которые обозначили как полимераза I, И и III. ДНК-полимераза I выполняет в основном репарирующие функции, тогда как ДНК-полимераза П1 является ферментом репликации. Функции ДНК-полимеразы II еще не ясны. Ферменты млекопитающих также существуют во множественных формах. [c.150]

Степень множественной атаки характеризуется числом молекул продукта, образующихся в результате одной успешной встречи фермента с субстратом, за вычетом двух молекул продукта, которые должны образоваться даже в отсутствие множественной атаки. Отсюда видно, что повторная (не по механизму множественной атаки) деструкция продукта реакции, образующегося после расщепления исходного субстрата, может быть легко и ошибочно принята за доказательство в пользу множественной атаки. [c.79]

Таким образом, при изучении множественной атаки возможность повторной ферментативной деструкции субстрата тривиальным способом (в результате диссоциации комплекса фермента с образующимся продуктом и повторная ассоциация с последующей атакой) должна быть полностью исключена. Подобное проведение столь чистого эксперимента было бы возможным лишь при очень сильной зависимости скорости ферментативного гидролиза от степени полимеризации субстрата в широком диапазоне последней. Тогда после первого же расщепления олигомерного субстрата скорость гидролиза должна настолько замедлиться, что реакция фактически остановится. Не исключено, правда, что она остановится и для процесса множественной атаки. [c.79]

Пример 8. В работе [14] исследуется влияние множественной атаки на величины кинетических параметров ферментативного гидролиза гомополимеров в зависимости от степени полимеризации последних. Данные, приведенные в табл. 28 (отражающие зависимость кинетических параметров ферментативного гидролиза от степени полимеризации субстрата, и в целом подчиняющиеся известному правилу лучшее связывание — лучший катализ [15]), послужили для авторов работы [14] основанием для разработки весьма детализированной кинетической модели множественной атаки. Эта модель включает более десяти микроскопических параметров (число сайтов активного центра положение каталитического участка в активном центре число возможных способов ассоциации субстрата с ферментом число связей субстрата, расщеп- [c.87]

Итак, если г — максимальное число мономерных единиц, которые могут проскальзывать вдоль активного центра фермента при множественной атаке, то это число можно рассчитать по формуле [14] [c.99]

Для практического применения данного подхода при расчете параметров множественной атаки требуется экспериментальное определение средней степени полимеризации продуктов ферментативного гидролиза Пр, максимального числа связей, расщепляемых за время жизни фермент-субстратного комплекса Гтах, числа сайтов в активном центре фермента т и положения каталитического участка (число сайтов слева и справа от каталитического участка). Используя эти данные, с помощью выражения (72) можно рассчитать максимальную длину цепи 2, продвигающейся через активный центр путем периодического проскальзывания. Имея величины г и Пр, можно рассчитать сумму единичных продвижений субстрата 8р вдоль активного центра для всех возможных способов связывания и, далее, с помощью соотношения (73) — среднее число этих единичных продвижений т] за время жизни фермент-субстратного комплекса для субстрата с любой степенью полимеризации. Наконец, с помощью выражения (77) можно вычислить эффективность ферментативного гидролиза полимерного субстрата, а с помощью уравнений (78—79) — время, требуемое для единичного проскальзывания вдоль активного центра. [c.101]

Итак, теоретические расчеты авторов работы [14] приводят к выводу о зависимости среднего числа мономерных остатков субстрата, прошедших через активный центр, и среднего числа расщепленных при этом связей не только от строения активного центра, но и от степени полимеризации субстрата. Поскольку эти значения (средние числа) определяют численные величины констант Михаэлиса и максимальной скорости реакции, то Кт и Ут достигают своих предельных величин при степенях полимеризации субстрата существенно больших, чем число сайтов в активном центре фермента. Таким образом, по мнению авторов работы [14], характер зависимости величин Кт или Ут (или их отношения) от степени полимеризации субстрата не может быть использован для определения числа сайтов в активном центре фермента. Здесь следует отметить, что именно на последнем подходе в значительной степени базируется концепция картирования активных центров, разработанная Хироми и сотр. С другой стороны, формальный подход, используемый для расчета степени множественной атаки, приводит к тому, что с его помощью нельзя объяснить специфичность действия эндоглюканаз по отношению к длинным субстратам по сравнению с короткими (см. [14]). Видимо, в основе подобного несоответствия подхода определенным экспериментальным данным опять лежит (как в подходе Хироми) предположение о некой характеристической константе скорости расщепления связей субстрата в активном центре, независимо от числа занимаемых центров и степени полимеризации субстрата. Это общий недостаток многих теоретических концепций о расщеплении полимерных субстратов разрабатываемых в последнее время. [c.101]

Для анализа экспериментальных данных (распределение продуктов ферментативной деструкции полимера в зависимости от степени полимеризации, или средняя степень полимеризации продуктов гидролиза) используют теоретические модели ферментативной деструкции полимеров — обычно весьма детализированные, но, как правило, содержащие сильные (и неочевидные) допущения, лишающие смысла всю детализацию. К ним относятся допущения об аддитивности показателей сродства индивидуальных сайтов, о постоянстве гидролитического коэффициента независимо от способа связывания субстрата и степени его полимеризации, о постоянстве инкремента свободной энергии активации действия фермента при последовательном заполнении его сайтов и т. д. Несоответствие теоретических данных, рассчитанных с помощью подобных упрощенных моделей, с экспериментальными нередко трактуется как доказательство в пользу существования таких неординарных механизмов, как множественная атака. При этом в работах, как правило, отсутствует критический анализ ограничений модели, и в частности анализ альтернативных механизмов действия фермента без априорного привлечения неординарных механизмов. [c.103]

Схема (84) описывает последовательное отщепление мономера с конца субстрата или посредством множественной атаки (с константой скорости кг), или путем повторных атак с повторяющейся диссоциацией фермент-субстратного комплекса на фермент и укороченный субстрат (с константой скорости кг). Как следует из схемы (84), исходный полимер имеет максимальную длину п- - [c.111]

К началу 70-.х годов стала очевидной необходимость создания определенного количественного подхода к изучению деполимераз, который позволил бы а) проводить сравнительное изучение ферментов пз различных источников (или множественных форм ферментов), имеющих один и тог же классификационный номер, но определенно отличающихся специфичностью действия б) достаточно однозначно характеризовать активный центр фермента [c.38]

По-видимому, одноцепочечный механизм является чнсто гипотетическим, и на практике он не наблюдался. Промежуточный случай получил название множественная атака , и при его рассмотрении предполагается, что после образования комплекса фермента с полимерным субстратом по закону случая и первого каталитического акта фермент в течение некоторого времени не диссоциирует из комплекса с оставшимся фрагментом субстрата. За это время он успевает совершить несколько последовательных атак на этот фрагмент, приводя к образованию двух, трех или более молекул продукта (обычно с низкой степенью полимеризации — мономера или димера). [c.78]

Из приведенных здесь пояснений уже очевидна некоторая неоднозначность используемых понятий. Так, способы действия эидофермента более упорядоченного действия и фермента, действующего ио механизму множественной атаки, трудно (если возможно) разделить, так как в обоих случаях наряду с расщеплением срединных связей будет образовываться некоторое количество коротких продуктов деструкции субстрата. Видимо, возникновение этих терминов обусловлено одними и теми же экспериментальными наблк дениями, хотя смысл, вкладываемый в описание способов действия ферментов, совершенно различен. [c.78]

Удивительно, что подобггые реакции и оказались неучтенными, тем более что по данным самих же авторов линейные олигосахариды, образуемые прн раскрытии макрокольца циклоамилоз, являются лучшими субстратами а-амилазы, чем исходные циклоамилозы (табл. 25). Естественно, вторичная атака фермента на образующиеся продукты должна была внести существенный вклад в вычисленную степень множественной атаки . [c.81]

Наконец, из табл. 26 и из рассчитанных значений степени множественной атаки ясно видно, что наибольшее отклонение от теоретических зависимостей (вычисленных в предположении об отсутствии повторной атакп фермента па образующиеся продукты реакции) наблюдается для субстратов с наибольшей степенью полимеризации, именно там, где повторная атака субстрата наи- [c.86]

Вместе с тем вся методология обработки экспериментальных данных базируется на весьма сильном допущении, что время, требуемое на единичный проскок субстрата (проокок на один мономерный остаток) вдоль активного центра в ходе множественной атаки, является характеристической величиной, постоянной для действия данного фермента, и независимой от степени полимеризации субстрата или от степени заполнения других сайтов активного центра мономерными остатками. Фактически, это предположение эквивалентно постулату Хироми о постоянстве микроскопического гидролитического коэффициента ферментативного расщепления связей субстрата независимо от степени его полимеризации и степени заиолнения активного центра, применимость которого на практике сомнительна (как в значительной степени отвергающего специфичность ферментативного катализа на молекулярном уровне). [c.88]

Ясно, что эти данные могут быть интерпретированы более простым образом, а именно что способ действия фосфорилазы (априорно принятый в цитируемой работе [16] как канонический для неупорядоченного действия фермента) несколько отличается от способа действия р-амилазы, что приводит к различному распределению продуктов деструкции полимерного субстрата по молекулярным массам (степени полимеризации). Как неоднократно указывалос . выше, это наиболее характерный признак действия деполимераз, и в рамках кинетики и субстратной специфичности действия ферментов он обусловлен различной зависимостью кинетических параметров ферментативной реакции от степени полимеризации (длины цепи) олигосахаридов. С точки зрения термодинамики действия деполимераз этот характерный признак объясняется различным числом сайтов в активном центре фермента, различным их сродством к мономерным остаткам субстрата и положением каталитического участка в активном центре. Как видно, и в этом случае введение гипотезы о множественной атаке было излишним и преждевременным, так как экспериментальные данные, полученные авторами работы [16], не были подвергнуты тщательному анализу. [c.91]

Пример II. При изучении гидролиза мальтооктасахарида Ое под действием а-амилазы из поджелудочной железы свиньи Робит и Френч в работе [17] предположили, что скорость образования продуктов (л2 и Об будет одинаковой, если ферментативная атака происходит по неупорядоченному механизму. Если же фермент действует по механизму множественной атаки, то скорость образования Ог будет выше, чем Ое. При этом авторы полагали (и, видимо, без должных оснований),, что за время эксперимента образующийся Оа не будет подвергаться повторной атаке ферментом. Однако из табл. 3 и 6 видно, что реакционная способность мальтодекстринов Об (и выше) почти одинакова и соответствующее предположение авторов работы [17] некорректно (кроме того, моделирование для обоснования этого предположения в работе не проводилось). [c.91]

Таким образом, модель действия деполимераз (как эндо-, так и экзодействня), базирующаяся на представлении о множественной атаке, может быть с успехом заменена моделью, исходяпгей из картирования активного центра и базирующейся иа переменной величине ги/фолитичсского коэффициента действия фермента в зависимости от степени полимеризации субстрата и характера связывания его с активным центром. [c.93]

Хироми с сотр. [9] провели кинетический анализ двух схем с участием множественной атаки, где а) субстрат проскальзывает вдоль актиЕ.ного центра фермента на произвольное (случайное) число мономерных единиц (схема 52) и б) субстрат проскальзы- [c.93]

Если N — степень полимеризации субстрата и а — доля потенциально расщепляемых связей в молекуле олигомерного субстрата от общего числа связей, соединяющих мономерные остатки (М—1), то число расщепляемых связей на молекулу субстрата равно а(Ы—1). Если при этом среднее число эффективных (приводящих к расщеплению связей) комплексообразованпй фермента с субстратом равно X, то степень множественной атаки а определяется выражением [9] [c.97]

Например, если пентамер, в котором все четыре связи могут быть расщеплены, полностью превращается в мономеры в результате единственного акта комплексообразования с ферментом, то степень множественной атаки равна четырем. Если для этого потребуются два акта, то а равна двум и т. д. Если же фермент для полной деструкции пентамера четыре раза войдет с ним в контакт, каждый раз после этого расходясь , то о=1, и вместо множественной атаки протекает неупорядоченный (многоцепочечный) механизм действия фермента. [c.97]

Здесь Пр — степень полимеризации продукта, определяемая экспериментально р, — число сайтов слева от каталитического участка (см., например, рис. 8), если продвижение субстрата идет в сторону восстанавливающего конца. Вводя термин единичное продвижение субстрата, означающий проскальзывание субстрата в активном центре на одно мономерное звено, можно рассчитать сумму единичных продвижений 5р для всех возможных способов свя ывания субстрата с активным центром в ходе множественной атаки [14]. Зная величину 5р для конкретного субстрата, можно вычислить среднее число единичных продвижений т] за время жизни фермент-субстратного комплекса [c.99]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Отсюда видно, что скорость ферментативной деструкции полимера при малой концентрации субстрата зависит от обоих показателей множественной атаки — эффективности гидролиза, г/ , или доли расщепленных связей за продвижение субстата на одну мономерную единицу, и среднего числа единичных продвижений за время жизни фермент-субстратного комплекса, т1 . В то же время максимальная скорость ферментативной деструкции (при насыщающей концентрации субстрата) определяется только эффективностью гидролиза, так как величина ta., предполагается постоянной. Левая часть выражения (77) в соответствии с уравнением Михаэлиса — Ментен (при [5]о<С/(т) равна йкат [5]о//Ст, а выражения (78) — кат) СЛСДОВЗТбЛЬНО [c.100]

Сравнивается действие двух или нескольких ферментов на один поли- или олигомерный субстрат и выявляется состав образующихся продуктов (различное распределение моно- или олигомерных продуктов по степени их полимеризации и по относительной концентрации). При этом состав продуктов действия одного из ферментов более характерен для неупорядоченного (многоцепочечного) способа действия по сравнению с действием других ферментов. Этого, как правило, для авторов достаточно, чтобы заключить о частичном проявления одноцепочечного механизма действия в последнем случае и, базируясь на выбранной ими модели, рассчитать степень множественной атаки. Кроме того, практически ни в одной из приведенных нами работ не вводились количественные поправки на возможную повторную атаку ( вторичный гидролиз образующихся продуктов реакции), исходя из кинетических параметров ферментативного гидролиза олигомеров с различной степенью полимеризации. Иначе говоря, авторы, априори принимая только механизм множественной атаки, не делают контрольных расчетов по альтернативным механизмам ферментативного гидролиза полимеров. [c.102]

Автор допускает возможность существования множественной атаки при действии деполимераз. Более того, он убежден, что этот механизм может играть важную роль в ферментативной деструкции нерастворимых биополимеров, где продвижение адсорбированного фермента по поверхности субстрата происходит с участием периферийных частей белковой (гликопротеиновой) глобулы, что легко представить условно как перекатывание фермента по поверхности нерастворимого субстрата. Наконец, при гидролизе нерастворимых биополимеров важную роль играет своеобразный клеточный эффект , когда молекула фермента последовательно действует на один и тот же участок субстрата, не успевая диффундировать от него на достаточное расстояние и снова адсорбируясь в определенной близости от места предыдущей атаки. Иначе говоря, автор не против множественной атаки, как и других неординарных механизмов ферментативного катализа. Однако в любом случае они должны быть строго обоснованы, и следует обязательно учитывать альтернативные и более тривиальные механизмы. В противном случае и без того сложная картина кинетики и механизмов действия деполимераз дополнительно усложняется введением надуманн 1х-эффектов и необоснованных концепций. [c.104]

При множественной атаке, чтобы произошло повторное отщепление мономера с сохранением фермент-субстратного комплекса, необходимо, чтобы вся полимерная цепочка сместилась на один сайт. Если такой процесс всегда протекает с одной и той же ве-роятност11Ю, то [c.121]

Комбинированный способ, или способ множественной атаки, заключается в том, что за время существования одного фермент-субст-ратного комплекса гидролизуется несколько связей. При этом после отщепления одного звена от цепи фермент не отталкивается, а задерживается. Атака происходит с чередованием одно- и многоцепочечного способов. [c.172]

На кинетику гидролиза значительное влияние оказывает и изменяющаяся степень сродства продуктов гидролиза к ферменту. Например, гидролиз глюкоамилазой плесневых грибов замедляется на коротких цепях. Гидролиз олигосахаридов происходит либо по многоцеиочечному, либо по комбинированному способу с уменьшением степени множественной атаки до единицы по мере укорочения цепей субстрата. Таким образом, гидролиз глюкоамнлазой в присутствии а-амилазы ускоряется только в начальных стадиях процесса. [c.179]

Теоретическая направленность занятий в данном разделе практикума по биохимии связана с анализом основных высокоэффективных механизмов регуляции активности ферментов, обсуждаемых в настоящее время в учебной литературе и на страницах известных биохимических журналов. К таким механизмам относятся аллостерический механизм контроля активности, реализующийся на уровне существования множественных форм ферментов механизм усиления, связанный с функционированием субстратных циклов адсорбционный механизм контроля, реализующийся при обратимом взаимодействии ферментов с биологическими мембранами регуляторный механизм с участием вторичных мессенжеров (цАМФ, С +) и универсальных модуляторов белковой природы (кальмодулин). [c.329]

Помимо тех причин существования изоферментных форм, о которых мы уже говорили, можно отметить расщепление проферментов, приводящее к образованию множественных форм, частичный гидролиз ферментов, а также обратимую модификацию белковых молекул (последнее обсуждается в разд. Е,4). [c.68]