Определение аффинности антител

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

Методы определения аффинности антител [c.41]

Таблица 2.1. Методы определения аффинности антител

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

Титр антисыворотки сильно зависит от концентрации антигена, используемого дл я тестирования и от способа его определения. Например, одна и та же сыворотка может иметь титр 100 в тесте иммунопреципитации и 100 000 в тесте иммуноферментного анализа. Поэтому при тестировании сыворотки и определении титра лучше всего применять тот же метод, что и при анализе, а концентрацию антигена выбирать близкую к минимальной в том диапазоне, который выбран для анализа. Кроме того, следует учитывать, что в иммуноферментном анализе используют как гомогенные, так и гетерогенные методы определения концентрации антигена, которые могут сильно отличаться по структуре образующихся иммунных комплексов. В частности, в твердофазных методах вероятность образования циклических комплексов антиген — антитело значительно меньше, чем в гомогенных, а следовательно, и Наблюдаемая аффинность антител в обеих системах будет разная. [c.158]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФФИННОСТИ АНТИТЕЛ [c.323]

Аффинность антител. Традиционные методы определения аффинности антител, позволяющие вычислять константу равновесия, основанные на изучении связывания меченого антигена с антителами, был и изложены в гл. 2, 3. В основном в таких экспериментах применяются иммобилизованные антитела и антигены, ме- [c.159]

Сушествует ряд методов определения аффинности антител и авидности антисывороток. Проце- [c.156]

Определение аффинности (или константы связывания) антител в сыворотке или выделенных в очищенном виде представляет собой сложную экспериментальную и теоретическую задачу. Трудности обусловлены следующими обстоятельствами. [c.41]

Перечень экспериментальных методов определения аффинности взаимодействия антиген — антитело приведен в табл. 2.1. [c.44]

Определение аффинности и концентрации антител [c.241]

На каждом этапе колоночной хроматографии содержание белка в смеси увеличивается не более, чем в 20 раз. и поэтому выделить из сложной смеси белков отдельный белок за один цикл практически невозможно. На долю каждого белка, как правило, приходится менее 1/1000 всего белка клетки, и для его очистки требуется последовательное использование нескольких различных типов колонок (рис. 4-47). Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография но сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. Так, при ковалентном связывании субстрата фермента с матриксом, например, с полисахаридными шариками, фермент специфически удерживается матриксом и может быть элюирован (смыт) практически в чистом виде. Подобным образом можно иммобилизировать короткие олигонуклеотиды ДНК определенной структуры (см. разд. 4.6.8) и использовать подобные носители для очистки ДНК-связывающих белков, опознающих данную последовательность нуклеотидов на хромосомах (см. разд. 9.1.8). С матриксом можно связать и специфические антитела такой носитель очень удобен для очистки белков, узнаваемых этими антителами. Аффинные колонки обладают высокой степенью специфичности за один цикл хроматографии можно добиться очень высокой степени очистки (1000-10000 раз). [c.213]

Во многих случаях необходимо или желательно получить очищенные с помощью аффинных методов антитела, специфические по отношению к определенному антигену. Ниже приводятся детальные методы фракционирования антисыворотки к гибридным белкам, позволяющие получать антитела, специфичные по отношению к гетерологичному фрагменту белка. Общая схема выделения специфических антител приведена на рис. 5.8. [c.165]

Первыми при иммунном ответе образуются 1 М. По времени возникновения их называют еще ранними антителами. Этот изотип иммуноглобулинов характеризуется относительно низкой аффинностью, поскольку он не подвергался селекции в лимфоидной ткани, для которой требуется определенное время — около 5-6 дней от начала вступления в реакцию активированных В-клеток. [c.253]

Первичным процессом ъ иммуноферментном и в любом другом иммунохимической анализе является стадия узнавания анализируемого соединения специфическим к нему антителом. Так как процесс образования иммунохимических Комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов. [c.77]

Отбор высокоактивных иммунных антисывороток, определение конечного и рабочего титра Оценка аффинности и концентрации фракции высокоаффинных антител [c.158]

И спользованне аффинной хроматографии тем не менее не ограничивается только выделением биологически активных веществ. Уже в 1960 г. Яги и др. [22] описали определение небольших количеств антител с помощью нерастворимых носителей с привязанными антигенами. Применение нерастворимых носителей в количественном радиоиммунном анализе детально рассмотрено в ра.зд. 11.7. Иммобилизованные олигомеры полнтпмидиловой кислоты использовали Эдмондс и др. [11] для количественного определения полнадениловой кислоты. Аффинная гель-фильтрация как микрометод при экспрессных определениях молекулярных масс [c.16]

Определению аффинности антител, специфичных к одной и той же детерминанте, сильно препятствует их гетерогенность (см., например, Fazekas de St, Groth, 1979). Изучая гетерогенную популяцию антител, можно определить лишь их среднюю аффинность. Эта величина для разных аитисывороток против одного и того же антигена обычно варьирует, Однако все эти трудности резко уменьшаются, если есть возможность получить к данному специфическому антигену моиоклоиальиые антитела. Определение точных характеристик связывания представляет особый интерес тогда, когда антитело специфично по отношению к какому-то клеточному (точнее, поверхностному) антигену, поскольку в этом случае реакция может иметь важное функциональное значение. Кроме того, эги данные могут быть полезны для понимания химических реакций, происходящих на поверхности клеток. [c.12]

Принципиальное различие этих этапов заключается в следую-ш,ем при определении титра исследуют связывание выбранной концентрации антигена при различных разведениях антисыворот-ки. При определении аффинности и концентрации антител исследуют связывание антисыворотки (в определенном разведении) с различными концентрациями меченого антигена. При изучении специфичности антисыворо ток в соответствуюш,ем разведении и при постоянной концентрации меченого антигена добавляют различные концентрации перекрестно реагируюш,его антигена. [c.157]

Антигенные детерминанты — это определенные участки трехмерной структуры иммуногенов и антигенов. Эти структуры способны взаимодействовать как со специфическими рецепторами лимфоцитов, индуцируя тем самым иммунный ответ, так и с антигенсвязывающими центрами специфических антител. Сложные антигены обладают множеством различных антигенных детерминант. Иммунизация такими антигенами приво-,111т к образованию поликлональных антител самой различной специфичности, которые можно обнаружить в антисыворотке. Одна детерминанта может быть образована 4—6 аминогруппами гли остатками сахаров. Тем не менее детерминанты могут бьпь чрезвычайно разнообразны по форме и распределению зарядов и способствовать развитию достаточно разнообразных ре-с кцип гуморального иммунного ответа. Действительно, специфические к одной определенной детерминанте антитела могут ( ыть клонально гетерогенны и при этом еще п значительно различаться по степени аффинности (см, разд. 4). [c.19]

Результаты определения абсорбции антител к ОХ-45 тканевыми гомогенатами, представленные на рис. 5.6, Л, показывают, что антигенная активность ткани селезенки в пересчете на 1 мг белка примерно вдвое превышает антигенную активность тимуса и в 20 раз — активность мозговой ткани. На рис. 5.6,5 представлены результаты определения абсорбции антител препаратом несолюбилизированных мембран крысиных спленоцитов и дезоксихолатным экстрактом тех же мембран. Дезоксихолат несколько смещает кривую торможения связывания антител в сторону уменьшения антигенной активности в расчете на белок, однако данный метод анализа вполне пригоден для определения сорбции и выхода антигена в процессе аффинной хроматографии. [c.184]

Константа равновесия К формально определена здесь как отношение между скоростями прямой н обратной реакций в уравнении (1). Прн таком определении высокая аффинность -антител к антигену соответствует высоким численным значениям К. Если концентрация реагирующих единиц выражена в молях иа литр (как молярность М), то К выражается в литрах на моль (т. е. М" ). Прн непользоваини единиц системы СГС концентрацию выражают в молекулах на кубический сан- [c.13]

Наблюдаемый характер влияния аффинности на титрование по методу ELISA существенно зависит от способа графического представления результатов. К сожалению, результаты титрования часто изображают в полулогарифмических координатах, что лишь усложняет выявление характера влияния аффинности антител. В то же время, если произведение параметра /С , отражающего аффинность антител, и концентрации антигена близко к 100 или выше, то отношение К [Аг]/(1+К[Аг]) стремится к единице. Это означает, что в системе практически не будет наблюдаться различий в связывании антител, аффинность которых выше определенного значения, в свою очередь зависящего от концентрации свободного антигена. [c.233]

Обзор современных подходов. Для измерения абсолютных количеств антител было предложено по меньшей мере четыре различных метода, С применением каждого из этих методов связаны определенные теоретические и (или) практические проблемы. Метод сравнения со стандартом основан на исполь зовании стандартной сыворотки (содержание антител в ней установлено по независимым критериям), с которой сопоставляют содержание соответствующих антител в исследуемых образцах, Этот метод дает достоверные результаты, только если значения аффинности антител в сыворотке и в стандарте находятся в диапазоне, для которого связывание не зависит ог аффинности (см, выше). Величина ошибки, которая привносится из-за такого допущения, была выявлена в цитировавшихся ранее специальных исследованиях (Butler et al,, 1978). При использовании мультивалентных антигенов важно, чтобы антитела образца и стандарта обладали одинаковой специфичностью. Так называемый прямой метод ELISA основанный на исполь- [c.237]

Аффиная хроматография является самостоятельной областью жидкостно-адсорбционной хроматографии, выделяемой по специфическому механизму взаимодействия разделяемых веществ с сорбентом. Метод основан на характерной особенности биологически активньгх веществ селективно и обратимо связывать определенные вещества, называемые аффинными лигандами или аффиантами. Таким образом, ферменты связывают соответствующие ингибиторы, антитела — антигены, гормоны — их рецепторы и т.п. Если по аналогии с обращенными фазами приготовить сорбенты с привитыми аффинными лигандами, появляется возможность селективного хроматографического выделения близких по свойствам биологически активных соединений и их разделения между собой. Наиболее часто применяемые аффинные лиганды приведены в табл. 3.65. [c.201]

Важной группой аффинных сорбентов являются иммобилизованные антитела, или антигены. В первом случае сорбенты могут бьпъ использованы для специфического выделения определенных антигенов, или гаптенов, из сложных смесей. В этом случае эти сорбенты называют иммумосорбентами. Во втором случае иммобилизованные антигены способствуют выделению антител с определенной специфичностью из сложной смеси антител. [c.248]

Для определения количества специфичных к гибридному белку антител, присутствующих в сыворотке, и для получения препарата антител, не загрязненного антителами к -галактозидазе, антисыворотку к гибридному белку сначала наносят на аффинную колонку, содержащую иммобилизованную -галактозидазу. Для подготовки такой колонки используют 5—7 мг очищенной -галактозидазы Е. oli (Sigma) диализованной против PBS. Метод подробно приводится в табл. 5.6. [c.165]

Применение аффинной хроматографии в качестве метода изучения взаимодействий находится еще на ранней стадии развития, несмотря на то что количественная аффинная хроматография была введена уже десять лет назад [1—3]. Действительно, количество исследований, касающихся методологических аспектов аффинной хроматографии, примерно равно количеству сообщений по применению этого метода в конкретных экспериментальных системах. Большинство этих исследований способствовало применению аффинной хроматографии для оценки равновесия с участием ферментов и модификаторов, ингибиторов или субстратов [1—12], но метод был также использован и для характеристики взаимодействий белок — лекарственный препарат [13], система антиген — антитело [14] и, в меньшей степени, белок-белковых взаимодействий [15, 16]. По существу метод заключается в иммобилизации биоспецифической реагирующей группы X на инертной хроматографической матрице (например, часто на сефарозе) и определении средневзвешенных величин объема элюирования Уа распределяющегося растворенного вещества А в ряде хроматографических экспериментов, в которых растворенное вещество мигрирует в присутствии различных концентраций лиганда 5, также специфически взаимодействующего с А и/или X, В некоторых примерах различные изменения значения Уа отражали конкуренцию между растворенными и иммобилизованными реагентами за одно и то же положение в А [2—5, 7—14] в других изменения в величинахГд были обусловлены наличием взаимодействия иммобилизованного реагента X с бинарным А5-комплексом, образованным растворенным веществом и растворимым лигандом [1, 6]. Цель количественной аффинной хром ографии — объяснить возникновение изменений в величинах Га в предложении существования тех или иных равновесий. Поскольку положение равновесия зависит от концентрации (в соответствии с законом действия масс), точное определение состава смеси реагентов, к которой относится Га, обеспечивает применение фронтальной хроматографии [3, 4]. [c.192]

Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соеди-ненцй. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их РаЬ-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий. [c.101]

Определение титра аитисыворотки. Титр — это эффективная величина, характеризуюи ая связывающую способность антител, зависящая от их концентрации и аффинности. Абсолютное значение титра также зависит от метода и условий проведения эксперимента (температуры, времени, pH и т. д.) и от начальной концентрации свободного антигена. [c.157]